Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules endothéliales (CE), monocouche de cellules hexagonales jointives situées à la face interne de la cornée, assurent la transparence de ce tissu essentiel à la vision. Peu avant la naissance, ces CE perdent leur capacité proliférative en restant bloquées en phase G1du cycle cellulaire. Le non remplacement des cellules mortes est responsable de certaines pathologies cécitantes dont la cornea gutatta et les dystrophies bulleuses du pseudophaque sont les prototypes et comptent parmi les premières indications de greffe de cornée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'arrêt de la prolifération de ces CE restent très partiellement expliqués. La première partie de cette thèse a pour objectif d'identifier si des changements d'expression transcriptionnelle des gènes régulateurs du cycle cellulaire interviennent au cours de l'organoculture (OC) et de la culture in vitro, afin de définir au mieux les cibles potentielles à inhiber ou celles à surexprimer pour re-déclencher une prolifération cellulaire contrôlée. Pour la première fois, nous avons mis en évidence des profils transcriptionnels variables en fonction de l'environnement des CE, avec une activation globale de l'expression des gènes en OC de routine et en culture primaire et l'expression accrue de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire en différents points comme DIRAS3, GADD45A, p15 p16, p18 et p19 ou impliqués dans la régulation du cycle des CE comme le complexe ubiquitine/protéasome (culines, APC...), laissant supposer que les freins antiprolifératifs sont encore plus complexes. Dans la seconde partie, nous avons développé une méthode d'analyse de la viabilité de l'endothélium pan-cornéenne afin d'évaluer au mieux la viabilité des cellules endothéliales sur les greffons. Nous avons développé un outil innovant de mesure combinant un triple marquage Hoechst/Ethidium/Calcéine AM à l'analyse pan-endothéliale permettant d'évaluer de définir la notion originale de densité en cellules viables d'une cornée. Cette technique peut être appliquée à l'analyse de n'importe quel procédé chirurgical ou non, susceptible d'altérer directement ou indirectement l'endothélium cornéen

Ces travaux de thèse portent sur la mise au point d'une technique d'élastographie quantitative à haute résolution pour l'estimation des propriétés biomécaniques de la cornée et de la peau. Pour cela, nous avons implémenté la méthode Supersonic Shear wave Imaging (SSI) à des fréquences ultrasonores atteignant 20 MHz. L'élastographie SSI consiste à déterminer la rigidité d'un milieu à partir de la vitesse de propagation d'une onde de cisaillement dans ce milieu. La géométrie de la cornée et de la peau, qui sont des organes d'épaisseur submillimétrique, impose un guidage des ondes de cisaillement le long des interfaces de ces organes, engendrant des phénomènes dispersifs. Nous avons donc dans un premier temps développé un modèle permettant de calculer quantitativement le module d'Young à partir des courbes de dispersion de l'onde de cisaillement. Dans un second temps, nous avons mis en application l'élastographie SSI pour obtenir des cartographies des propriétés élastiques de cornées porcines ex vivo et in vivo et du derme humain in vivo. Le comportement élastique anisotrope et non-linéaire de ces deux tissus a ainsi pu être observé. Nous avons ensuite réalisé une étude préclinique en ophtalmologie, qui démontre la faisabilité d'utiliser l'élastographie SSI pour évaluer in vivo le durcissement cornéen induit par un traitement appelé " cross-linking de collagène cornéen ". Enfin, nous avons mené deux études cliniques en dermatologie. L'une a permis d'étudier les variations d'élasticité du derme au cours du vieillissement, l'autre concerne la caractérisation de lésions cutanées.

La cornée est le hublot transparent de l’oeil. Bien que de nombreux modèles alternatifs utilisant des cornées animales ex vivo aient vu le jour durant ces 30 dernières années, les recherches préclinique (étude de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques) et fondamentale sur la cornée ont toujours besoin de l’expérimentation animale in vivo. Elle fait aujourd’hui l’objet d’une réglementation stricte afin d’éviter tout abus et maltraitance. Les animaux les plus fréquemment utilisés en recherche cornéenne sont des mammifères (souris, rat, lapin, chat, chien, cochon, boeuf et primate non humain). Malgré leur proximité phylogénétique de l’Homme, ces animaux peuvent présenter des différences notables avec la cornée humaines qui doivent être connues pour ne pas induire de biais dans l’expérimentation. Les objectifs de cette thèse sont de mettre au point les modèles animaux et les méthodes alternatives nécessaires aux travaux du laboratoire BiiGC (EA 2521, Université de Saint-Étienne, France). Ils sont illustrés par 3 projets innovants : 1/une étude préclinique utilisant un modèle de kératoplastie transfixiante chez le lapin pour évaluer la prévention du rejet d’allogreffe de cornée par implant sous conjonctival de déxamethasone ; 2/Le développement d’un bioréacteur cornéen porcin pour l’analyse de la cicatrisation épithéliale ; 3/ l’utilisation d’un modèle lapin de lésion endothéliale pour l’étude de la régénération endothéliale. Ces 3 travaux innovant démontrent la diversité des modèles animaux nécessaires en recherche fondamentale et translationnelle. / The cornea is the clear window of the eye. Although many alternative models using ex vivo animal corneas have emerged during the last 30 years, preclinical research (study of new diagnostic and therapeutic strategies) and fundamental corneal research still need animal experiments in vivo. The most commonly used animals in corneal research are mammals (mouse, rat, rabbit, cat, dog, pig, beef and non-human primate). Despite their phylogenetic proximity to humans, these animals may exhibit notable differences with the human cornea, which must be known so as not to induce bias into the experiment. The aims of this thesis are to develop the animal models and the alternative models necessary for the work of the BiiGC laboratory (EA2521, University of Saint-Etienne, France). They illustrated by 3 innovative projects: 1/ a preclinical study using penetrating keratoplasty model in rabbits to evaluate the prevention of corneal allografts rejection by a conjunctival implant of dexamethasone; 2/ The development of a porcine corneal bioreactor for the analysis of epithelial wound healing; 3/ The use of rabbit endothelial lesion model for the study of endothelial regeneration. These 3 innovative works demonstrate the diversity of animal models needed in fundamental and translational research

Les cellules endothéliales cornéennes (CEC) jouent un rôle essentiel pour le maintien de la transparence de la cornée. Cependant, chez l’homme, elles sont incapables de proliférer en raison d’un arrêt de leur cycle cellulaire en phase G1, ce qui rend la couche endothéliale cornéenne particulièrement vulnérable. La délivrance de molécules thérapeutiques (gènes ou médicaments) représente une solution prometteuse pour maintenir la viabilité des CEC. Néanmoins, la difficulté majeure de cette technique repose sur le fait de traverser la membrane cellulaire, normalement imperméable aux molécules de grande taille. Plusieurs techniques de délivrance de molécules ont déjà été testées sur le tissu cornéen mais aucune d’entre elles ne donnent de résultats suffisamment probants pour être utilisée en applications cliniques. L’objectif de cette thèse est d’adapter et de développer une nouvelle technique de délivrance intracellulaire de molécules, basé sur une perforation cellulaire via un phénomène photoacoustique induite par l’activation de nanoparticules de carbone par laser femtoseconde, sur un modèle d’endothélium cornéen in vitro et ex vivo / Corneal endothelial cells (CEC) are essential for corneal transparency. However, on humans, they are unable of proliferation owing to its arrest of G1 phase of the cell cycle, making corneal endothelial monolayer particularly vulnerable. The gene and drug delivery represents a promising solution to maintain CEC viability. Unfortunately, the major difficulty of this technique is the transport across the cell membrane, normally impermeable to high-size molecules. Several techniques of molecules delivery have already been tested on corneal tissue but none of them gives results sufficiently convincing to be used in clinical applications. The aim of this thesis is to adapt and develop a new technique of intracellular molecules delivery, based on cell perforation via photoacoustic effect induced by the activation of carbon nanoparticles by femtosecond laser, on in vitro and ex vivo models of corneal endothelium

L'objectif du projet est la synthèse d'une cornée artificielle biocompatible à base de collagène de type I extrait et purifié à partir de tendons de queues de rats. La synthèse utilise les propriétés mésogènes (cristal-liquides) de la molécule de collagène ainsi qu'une transition sol-gel mimant l'étape de fibrillogenèse qui se déroule in vivo. Des solutions acides de collagène (500 mM en acide acétique) sont dyalisées contre des solutions de diverses concentrations en acide acétique et en acide chlorhydrique puis concentrées jusqu'à 90 mg/mL. Les phases cristal-liquides données par les différentes conditions physico-chimiques sont analysées par microscopie à lumière polarisée et par génération de seconde harmonique. L'une des conditions permet d’obtenir une phase dite en contreplaqué, ce qui est l’organisation des lamelles de fibrilles de collagène dans la cornée.Analysée par microscopie électronique à transmission, la structure des matrices obtenues après fibrillogénèse présente des domaines en contreplaqué indiquant une conservation et une stabilisation de l’organisation cristal-liquide d'origine. L’organisation obtenue est proche de celle du stroma cornéen. Par une optimisation des conditions physico-chimiques, les matrices synthétisées présentent une transparence proche de 90 % et possèdent de bonnes propriétés mécaniques avec un module d’Young proche de 1 MPa. Des cultures cellulaires effectuées sur les matrices transparentes montrent qu’elles sont un très bon support pour la culture de cellules cornéennes, en particulier des cellules épithéliales. Tous ses résultats confortent la méthode utilisée et les essais in vivo constituent l’étape suivante. / In view to generate artificial corneas, dense transparent collagen type-I scaffolds were synthesized exploiting the intrinsic liquid crystals properties of collagen molecules. 3 mg/mL collagen solutions in 500 mM acetic acid were dialyzed against a solution of precise concentrations in acetic and hydrochloric acid. When concentrated, solution provided a liquid-crystal organization resembling plywood, which is the organization of the collagen fibrils in the cornea. This was verified by polarized light and second harmonic generation microscopy experiments. In parallel these collagen solutions were also concentrated by centrifugation-filtration up to 90 mg/mL. The concentrated solutions were pressed into cornea-like shape and submitted to ammonia vapor in order to induce the fibrillogenesis of collagen. The result is a transparent dense fibrillated collagen matrix (transparency 90 %). Transmission electron microscopy revealed that fibrils kept the organization of the concentrated solution. Using a custom made device, mechanical tests showed that the Young modulus reached 900kPa. Human donor limbal explants were sewed on top of the scaffolds and cultured for 14 days. Optical microscopy and immunocytochemical analysis showed the development of an epithelium with characteristics of corneal epithelial cells. Preliminary experiments showed that keratocytes could be successfully inserted during the synthesis process. Thus, the results show the viability of the process of fabrication, and the following step is the in vivo experiment.

La cornée est le tissu le plus densément innervé du corps humain. Cette innervation joue un rôle dans la régulation de la sécrétion du film lacrymal et exerce un rôle trophique direct sur l'épithélium cornéen. Les axones cornéens expriment différents types de récepteurs et répondent à des fonctions de mécano-nocicepteurs, de récepteurs au froid ou de récepteurs polymodaux. Nous avons pu identifier de nouvelles lignées de souris transgéniques et les utiliser pour caractériser ces différentes populations axonales. L'innervation cornéenne débute à E12.5 chez la souris et est régulée par les molécules de Slits et de Sémaphorines et leurs récepteurs Robo et Plexines/Neuropilines respectivement. Nous avons pu étudier le rôle de ces deux familles dans le développement de l'innervation cornéenne. Les mutants Slits et Robos présentent une réduction du nombre et de la taille des terminaisons axonales épithéliales cornéennes. A l'âge adulte, les mutants Robos présentent une dégénérescence précoce des terminaisons épithéliales. Les mutants plexine-A4 et Neuropiline-1 présentent à l'inverse une augmentation du nombre de divisions des troncs stromaux cornéens. A l'âge adulte les mutants Plexine-A4 retrouvent une organisation classique de l'innervation alors que les mutants Neuropiline-1 conservent la désorganisation de l'innervation cornéenne. Nous avons également étudié la régénération de l'innervation après lésions de grattage de l'épithélium cornéen. Nos résultats préliminaires semblent en faveur d'une augmentation de la régénération de l'innervation cornéenne chez les mutants Neuropiline-1. / The cornea is the most densely innervated tissue in the entire body. Corneal innervation plays a role in regulating the secretion of lacrimal film and exerts a direct trophic role on the corneal epithelium. Corneal axons express different types of sensory receptors ranging between mechano-, thermo-, and polymodal nociceptors. We identified transgenic mouse lines to characterize these different axonal populations. Corneal innervation begins at E12.5 in mice and is regulated by a range of axon guidance cues such as Slits and Semaphorins, which respond to their receptors Robo and Plexin/Neuropillin respectively. We studied the role of these two families in the development of corneal innervation. The Slits and Robos mutants show a reduction in the number and size of the corneal epithelial nerves endings. In adult, Robos mutants exhibit early degeneration of the epithelial nerves endings. Plexin-A4 and Neuropilin-1 mutants, on the other hand, show an increase in the number of divisions of the corneal stromal nerve trunks. In adult, Plexin-A4 mutants regain a classical organization of innervation whereas Neuropilin-1 mutants retain the disorganization of corneal innervation. Following a lesion, corneal innervation is able to regenerate, however the axons never regain their initial morphology or complexity. Due to the increased corneal innervation observed in the Neuropilin-1 mutants, we wondered whether the regeneration of innervation after scrapping lesions of the corneal epithelium could be enhanced in Neuropilin-1 loss of function. Our preliminary results support an increase in corneal innervation regeneration in Neuropilin-1 mutants.

La greffe lamellaire postérieure, ou greffe endothéliale, consiste à remplacer l’endothélium défectueux d’une cornée par un endothélium sain prélevé sur un donneur décédé, en laissant en place l’épithélium et le stroma du patient. La découpe du greffon lamellaire endothéliale est l’une des étapes critiques de la greffe de cornée postérieure. Supérieur au microkeratome pour la réalisation de capots cornéens peu profonds, le laser femtoseconde montre cependant des résultats plutôt décevant concernant les découpes cornéennes profondes. L’objectif de cette thèse est d’étudier et d’optimiser les découpes lamellaires endothéliales cornéennes, réalisées au microkeratome et au laser femtoseconde. Ces optimisations passent par le développement d’un bioréacteur cornéen, ainsi que par l’amélioration des techniques d’estimation de la viabilité endothéliale cornéenne / Posterior lamellar graft, also named endothelial graft, consist in a replacement of a defective corneal endothelium by a healthy one take on a deceased donor. The epithelial and stromal layers of the patient stay untouched. A critical step of this technic is the preparation of the lamellar graft. Femtosecond lasers are better in comparison with microkeratome for low depth lamellar cut. However, femtosecond high depth corneal lamellar cuts show disappointing results. The aim of this thesis is to study and optimize corneal endothelial lamellar cuts, realized by microkeratome and femtosecond laser. Development of a corneal bioreactor and improve of corneal endothelial viability assessment are necessary for the realization of these objectives

Les cellules endothéliales (CE), monocouche de cellules hexagonales jointives situées à la face interne de la cornée, assurent la transparence de ce tissu essentiel à la vision. Peu avant la naissance, ces CE perdent leur capacité proliférative en restant bloquées en phase G1du cycle cellulaire. Le non remplacement des cellules mortes est responsable de certaines pathologies cécitantes dont la cornea gutatta et les dystrophies bulleuses du pseudophaque sont les prototypes et comptent parmi les premières indications de greffe de cornée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l’arrêt de la prolifération de ces CE restent très partiellement expliqués. La première partie de cette thèse a pour objectif d’identifier si des changements d’expression transcriptionnelle des gènes régulateurs du cycle cellulaire interviennent au cours de l’organoculture (OC) et de la culture in vitro, afin de définir au mieux les cibles potentielles à inhiber ou celles à surexprimer pour re-déclencher une prolifération cellulaire contrôlée. Pour la première fois, nous avons mis en évidence des profils transcriptionnels variables en fonction de l’environnement des CE, avec une activation globale de l’expression des gènes en OC de routine et en culture primaire et l’expression accrue de gènes impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire en différents points comme DIRAS3, GADD45A, p15 p16, p18 et p19 ou impliqués dans la régulation du cycle des CE comme le complexe ubiquitine/protéasome (culines, APC...), laissant supposer que les freins antiprolifératifs sont encore plus complexes. Dans la seconde partie, nous avons développé une méthode d’analyse de la viabilité de l’endothélium pan-cornéenne afin d’évaluer au mieux la viabilité des cellules endothéliales sur les greffons. Nous avons développé un outil innovant de mesure combinant un triple marquage Hoechst/Ethidium/Calcéine AM à l’analyse pan-endothéliale permettant d’évaluer de définir la notion originale de densité en cellules viables d’une cornée. Cette technique peut être appliquée à l’analyse de n’importe quel procédé chirurgical ou non, susceptible d’altérer directement ou indirectement l’endothélium cornéen / Corneal endothelial cells (EC) form a monolayer of hexagonal contiguous cells located at the inner surface of the corne and are responsible for maintenance of its transparency, and therefore essential for vision. Just before birth, they lose the proliferative capacity and remain blocked in the G1 phase of the cell cycle. The absence of cell replacement by mitosis induces is responsible for certain blinding diseases such as cornea gutatta and pseudophakic bullous keratopathy, two prototype endothelial diseases that are among the first indications of corneal graft. The molecular mechanisms involved is the non-proliferation of EC remain only partially explained. The first part of this thesis aimed to identify whether changes in transcriptional expression of cell cycle regulators genes occurred during organ culture (OC) and during in vitro culture, in order to better define the potential targets to inhibit or to overexpress necessary to trigger a controlled cell proliferation. Forthe first time we have highlighted variable transcriptional profiles depending on endothelial environment, with a glolal activation of gene expression in routine OC and in primary cultures, especially with an increased expression of gene involved in cell cycle arrest at different points like DIRAS3, GADD45, p15 p16, p18 and p19 or involved in cycle regulation as the ubiquitin/proteasome complex (Culines, APC ...), suggesting that the antiproliferative brakes are even more complex than previously reported. In a second part we developed an original method of pan-corneal endothelial viability assessment. This innovative measurement tool combines a triple Hoechst/Ethidium/Calcein-AM labeling with a part endothelial image analysis allowing to define the new concept of viable endothelial cell density, that represent the reaviable cell pool of a cornea. This technique can be applied to the analysis of any procedure (surgical or not), likely to directly or indirectly alter the corneal endothelium

Dans un contexte d’augmentation du nombre d’amétropes dans la population mondiale, et en conséquence, de l’accroissement du recours aux techniques de corrections chirurgicales, la compréhension et l’amélioration de celles-ci sont un enjeu crucial. Nous avons cherché à améliorer la prédictibilité de certains résultats postopératoires dans le cas d’un LASIK (Laser-Assisted In-Situ Keratomileusis), d’une PKR (Photorefractive Keratectomy) ou d'une chirurgie de la cataracte, et ainsi formuler des recommandations pratiques qui contribueraient au développement de stratégies de traitement davantage personnalisés. Pour cela, nous avons utilisé prospectivement des méthodologies de « contrôle de qualité » des chirurgies sur de larges échantillons de patients. Dans un premier temps, nous avons étudié la dynamique pupillaire dans le cadre de chirurgies au LASIK et notamment le rôle du centre pupillaire, point de référence important dans les stratégies de centrage. Nous avons également évalué la dynamique du diamètre pupillaire et les modifications du segment antérieur sur des yeux subissant une chirurgie de la cataracte. La seconde partie du travail s’est focalisée sur le rôle de l’épithélium dans la topographique cornéenne. Nous avons comparé les topographies spéculaires de l'épithélium et de la couche de Bowman sur des cornées saines et des cornées kératoconiques, présentant une myopie faible à modérée corrigée par PKR. Enfin, dans la dernière partie de notre recherche, nous nous sommes intéressés aux changements de paramètres anatomiques de l'oeil, des performances visuelles et de la qualité de vision subjective survenant dans un échantillon d’yeux myopes après un LASIK réalisé avec le laser WaveLight® Refractive Suite (Alcon® Laboratories Inc., USA). / While the number of ametropic eyes in the world’s population and consequently the use of surgical correction techniques is increasing, understanding and improving these techniques is a crucial issue. We sought to improve the predictability of certain postoperative results in the case of LASIK (Laser-Assisted In-Situ Keratomileusis), PRK (Photorefractive Keratectomy) and cataract surgery, and thus to formulate practical recommendations that would contribute to the development of more personalized treatment strategies. To achieve this objective, we have prospectively used "quality control" methodologies to assess surgeries performed on large samples of patients. First, we studied the pupillary dynamics in LASIK surgery and in particular the role of the pupillary centre, an important point of reference in the centration strategies. We also assessed the dynamics of pupillary diameter and anterior segment changes on eyes undergoing cataract surgery. The second part of the work focused on the role of the epithelium in the corneal topography. We compared specular topographies of the epithelium and Bowman's layer in healthy and keratoconus corneas with mild to moderate myopia corrected by PRK. Finally, in the last part of our research, we were interested in the changes in anatomical parameters of the eye, visual performance and subjective quality of vision occurring in a sample of myopic eyes after LASIK performed with the WaveLight® Refractive Suite (Alcon® Laboratories Inc., USA).