Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 60-63. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

No description available.

La protéine kinase Ca2+ /calmoduline-dépendante II (CaMKII) est une enzyme impliquée dans le remodelage synaptique dépendant de l'activation des récepteurs NMDA. Une activation importante des récepteurs NMDA provoque, dans l'épine dendritique, une augmentation du calcium libre ainsi que le recrutement de la CaMKII. Une fois dans l'épine, la CaMKII peut interagir avec plusieurs protéines, affectant ainsi sa mobilité et son accessibilité à certains substrats. Mes travaux démontrent que l'interaction de la CaMKII avec la sous-unité NR2B du récepteur NMDA, ainsi que l'auto-association de plusieurs holoenzymes de CaMKII peuvent modifier la localisation de la CaMKII dans des cellules non-neuronales suite à l'activation de la kinase. À l'aide de la technique de fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), j'ai montré que l'activation des récepteurs NMDA mène à la rétention de la CaMKII dans l'épine dendritique. Mes résultats suggèrent que le recrutement et la rétention de la CaMKII à la synapse pourraient jouer un rôle dans la plasticité synaptique.

La protéine kinase Ca²⁺/calmoduline-dépendante II (CaMKII) est une enzyme clé dans le processus de la mémoire. Elle est impliquée dans les mécanismes qui régissent la plasticité synaptique et le recrutement de protéines à la synapse. Certaines hypothèses suggèrent que pour y parvenir, la CaMKII se fixe à la densité post-synaptique de manière persistante. Cette localisation pourrait faciliter son rôle de kinase vis-à-vis de ses partenaires et faciliter la transmission synaptique, en permettant l'exocytose des récepteurs AMPA par exemple. L'enzyme peut également se lier aux microtubules de manière plus brève lors des entrées calciques. Cette liaison pourrait à son tour phosphoryler certaines protéines associées aux microtubules et permettre la libération de cargos aux endroits spécifiques. Plusieurs questions sont présentement posées par la communauté scientifique au sujet des rôles de l'enzyme face à la plasticité synaptique. De quelles manières est-elle retenue à la synapse, quelles sont ses mécanismes et ses modes de diffusion, est-elle impliquée dans certains processus d'étiquetage synaptique ? Ce sont là quelques questions auxquelles j'ai tenté de répondre au cours de mes travaux de maîtrise. J'ai donc étudié les dynamiques spatiales et temporelles de la CaMKII de façon à mieux comprendre comment elle intervient au niveau synaptique. J'ai utilisé des cultures d'hippocampe de rats, dans lesquelles j'ai surexprimé la GFP-aCaMKII. J'ai fait du FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) et du FLAPA (Fluorescence loss after Photo Activation) ce qui m'a permis d'obtenir de l'information sur la mobilité et la rétention de la CaMKII. J'ai également adapté une méthode d'analyse de régression sur le profil d'intensité en utilisant la méthode des maxima d'entropie. Mes résultats démontrent que suite à une activation synaptique, une plus grande fraction de CaMKII est retenue à la synapse, pour une durée de temps prolongée. Cette rétention, observée sur une longue période, pourrait avoir un rôle important dans les changements plastiques à long terme. J'ai aussi démontré que l'enzyme doit d'être activée via le complexe Ca²⁺/CaM. D'autres résultats m'ont permis de constater que lors des entrées calciques, la CaMKII se fixe aux microtubules. Mes travaux proposent donc que plusieurs dynamiques spatiales et temporelles de la CaMKII sont mises à contribution pour le bon fonctionnement du système de transmission synaptique.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / La formation des connexions entre les neurones durant le développement et la plasticité des connexions synaptiques une fois établies nécessite une fine régulation au niveau du cytosquelette du neurone. Les interactions entre les microtubules et l'actine du cytosquelette sont à l'origine du déplacement et du guidage de l'extrémité de l'axone en croissance, et de récentes évidences suggèrent qu'elles pourraient être importantes dans la réorganisation synaptique. La protéine kinase Ca2+/calmoduline-dépendante II (CaMKII), une des protéines les plus abondantes du cerveau, pourrait être impliquée dans la régulation de ces interactions. Il a été montré que la sous-forme CaMKIIb, exprimée dans le développement et liant l'actine en situation de faible activité, détecte les oscillations calciques dans le cône de croissance et provoque son attraction. Le mécanisme par lequel la CaMKIIb entraîne le virage du cône est cependant inconnu. L'isoforme CaMKIIa, essentielle dans la potentialisation à long-terme de l'épine dendritique, a été observée s'accumulant sous l'épine dendritique lors d'une forte activité locale, où elle pourrait contrôler la livraison locale de cargos destinés à la synapse. Dans le laboratoire du Dr. De Koninck, nous avons observé ces deux formes se lier à des structures ressemblant à des microtubules pendant une forte stimulation. La liaison de la CaMKII aux microtubules pourrait expliquer le mécanisme d'action de la CaMKIIb dans le virage du cône de croissance ainsi que mettre en évidence un nouveau rôle de la CaMKIIa dans l'épine dendritique. Au cours de mes travaux de maîtrise, j'ai observé la CaMKII et le cytosquelette dans des cultures de neurones d'hippocampe de rats en marquant les protéines avec des anticorps ou en transfectant des protéines de fusion fluorescentes. Mes analyses de colocalisation m'ont permis de montrer que la dépolarisation du neurone provoque le déplacement de la CaMKIIb de l'actine vers les microtubules dans le cône de croissance et la localisation de la CaMKIIa aux microtubules, mais pas aux neurofilaments, dans le neurone plus mature. Les études d'inhibition de la CaMKIIb au cours du développement ainsi que l'étude du guidage du cône de croissance n'ont pas donné de résultats probants permettant d'expliquer le rôle du déplacement de la CaMKIIb. Finalement, il est possible que la liaison de la CaMKIIa aux microtubules sous l'épine puisse être impliquée dans les entrées de microtubules dans l'épine et dans la livraison de récepteurs AMPA.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2006. / Sur la p. de t. 2 et + est en suscrit. Bibliogr.: f. [72]-76. Présenté aussi en version électronique.

La plasticité synaptique représente un mécanisme fondamental de l'apprentissage et de la mémoire au cours du développement et durant la vie adulte. Au niveau moléculaire, il est connu que la CaMKII joue un rôle important dans la plasticité et la maturation des synapses. L'objectif était de démontrer par mesure électrophysiologique que la translocalisation de la CaMKII à la synapse est nécessaire à la potentialisation à long terme (LTP) des courants synaptiques. Pour tester cette hypothèse, une étape critique devait d'abord être franchie, celle d'établir une méthode robuste pour induire de la LTP dans des neurones d'hippocampe de rat maintenus en culture, où on peut manipuler l'expression et la dynamique spatiale de la CaMKII. Ce mémoire montre que cette première étape n ' a pu être établie et qu'ainsi l'hypothèse de départ n'a pu être testée. Néanmoins, je présente une méthode candidate prometteuse, faisant appel à une lumière intense, pour augmenter la fréquence des événements synaptiques. De plus, j ' a i développé un outil qui permettra bientôt d'automatiser les mesures d'électrophysiologie et microscopie nécessaires pour tester l'hypothèse de départ. Il devrait entre autre accélérer notre capacité de trouver un protocole optimal pour induire de la LTP en culture en testant un plus grand nombre de conditions expérimentales de manière rapide et reproductible.

Le bulbe olfactif (BO) est un réseau neuronal complexe qui traite et transfert les informations olfactives aux structures corticales supérieures. Le réseau bulbaire est composé d’une large population de cellules granulaires (CGs) GABAergiques qui sont continuellement renouvelées tout au long de la vie de l’animal. Cette population peut exprimer différents marqueurs neuronaux comme la calretinine (CR+) et la CaMKIIα (CaMKIIα+), mais jusqu’à présent les études ayant eues pour but de comprendre le rôle des CGs dans le BO n’ont pas pris en considération cette hétérogénéité. Cependant, il est possible que différentes sous-populations de CGs présentent des propriétés morpho-fonctionnelles différentes et jouent un rôle spécifique dans le comportement olfactif. Ici nous comparons les caractéristiques morphologiques et eléctrophysiologiques des cellules CR+ générées chez l’adulte versus les cellules qui ne n’expriment pas la calretinine (CR−), ainsi que des cellules CaMKIIα+ générées chez l’adulte versus les cellules qui ne l’expriment pas (CaMKIIα−). Nous démontrons que les CGs CR+ et les CGs CaMKIIα+ présentent des morphologies similaires mais reçoivent moins de courants inhibiteurs que les cellules négatives. Nous révélons également qu’au sein d’une même souspopulation, des cellules générées pendant le développement ou bien générées chez l’adulte ont les mêmes propriétés morpho-fonctionnelles. De plus, nous démontrons par quantification de l’expression de gènes à expression précoce immédiate ainsi que par l’inhibition de sous-populations de CGs à l’aide d’outils pharmacogénétiques combiné à des tests de comportement l’implication spécifique des cellules CR+ et des cellules CaMKIIα+ dans la discrimination olfactive spontanée et suite à un apprentissage associatif. Dans le dernier chapitre de la section Résultat, nous révélons l’existence d’une nouvelle forme de plasticité structurelle présente uniquement sur les CGs générées chez l’adulte, permettant la formation de nouvelles synapses dans un lapse de temps très court. Nous montrons que les épines disposent de fins filopodes sur leurs têtes qui scrutent l’environnement et induisent une relocalisation des épines dépendamment de l’activité. Nous montrons également que ce phénomène dépend de l’activation des récepteurs AMPA et TrkB se trouvant sur les CGs par le glutamate et le BDNF libéré par les cellules mitrales. / The olfactory bulb (OB) is a complex neuronal network which processes and transfers olfactory information to higher cortical structures. The bulbar network is composed of a large population of GABAergic granule cells (GCs) which is continuously renewed throughout animal lifetime. This population can express diverse neurochemical markers such as calretinin (CR) and CaMKIIα, but so far most of the studies that aimed to unveil the role of GCs in the OB and odor behaviors didn’t take into consideration this heterogeneity. However, it is possible that different subpopulations of GCs display different morpho-functional properties and play specific roles in olfactory behaviors. Here we compared morphological and electrophysiological characteristics of adult-born CR-expressing cells versus CR-non expressing cells, as well as CaMKIIα-expressing cells versus CaMKIIαnon expressing cells. We showed that CR-expressing and CaMKIIα-expressing GCs display similar morphological properties but receive less inhibitory inputs than their respective negative counterparts. I also revealed that among the same subpopulation, cells generated during brain development or adulthood, display the same morpho-functional properties. In addition, we demonstrated by immunostaining for early-immediate gene markers as a proxy of neuronal activity and pharmacogenetic inhibition of GC subpopulations combined with behavioral tasks, the specific implication of CR- and CaMKIIα-expressing cells in spontaneous and odor-associative learning discrimination. In the last chapter in Result section, we revealed the existence of a new form of structural plasticity occurring in adult-born, but not early-born GCs, in a very short time. We showed that spines display thin filopodia on their heads which scrutinize the microenvironment and induce spine relocation in an activity-dependent manner. We also revealed that this phenomenon depends on activation of AMPA and TrkB receptors located on GCs by glutamate and BDNF released by active mitral cells.

La virulence de la bactérie Gram+ Bacillus anthracis, responsable de la maladie du charbon, est due à la présence d'une capsule et deux toxines. Chaque toxine résulte de l'assemblage de l'antigène protecteur (PA) avec l'un des deux facteurs, létal (LF) ou oedémateux (EF), dans le cytoplasme de la cellule hôte. EF est une adénylyl cyclase, qui transforme l'ATP en AMPc de manière incontrôlée, provoquant des dérèglements cellulaires. Elle est activée par la calmoduline (CaM), impliquée dans de nombreuses voies de signalisation du calcium. Des structures cristallographiques et une étude par RMN ont montré que la stabilité du complexe EF-CaM dépend du niveau de calcium fixé à CAM. Des simulations de dynamique moléculaire du complexe, avec 0, 2 ou 4 ions calcium, ont permis de caractériser l'effet du calcium sur la plasticité conformationnelle des deux partenaires et de proposer un modèle de l'interaction EF-CaM. L'analyse conjointe des corrélations dynamiques et des influences énergétiques a fait émerger le concept de connexité du réseau de résidus comme critère de stabilité. La large transition conformationnelle induite chez EF par la fixation de CaM a été décrite, grâce à la détermination d'un chemin de réaction plausible, par modélisation moléculaire. Les conformations intermédiaires obtenues ont servi à guider la recherche rationnelle d'inhibiteurs de la toxine EF, dans le cadre d'une approche combinant méthodes computationnelles et expérimentales. Une stratégie innovante, impliquant le criblage virtuel d'une poche allostérique plutôt que du site catalytique de l'enzyme, a identifié six molécules actives, inhibant totalement l'activité de EF à des concentrations de 10-100 microM.

Suite aux conséquences environnementales provoquées par l’accident nucléaire de Fukushima, il est fondamental d’étudier les mécanismes gouvernant les effets des radionucléides sur la biosphère et ainsi identifier les processus moléculaires responsables du transport et de la déposition d’actinides comme le neptunium et l’uranium. Cependant, les informations concernant l’aspect microscopique des interactions entre actinide et molécules biologiques sont rares. Les données publiées étant majoritairement issue d’études in vivo, la structure des sites de coordination et l’effet de cette complexation sur les fonctions des protéines restent encore à découvrir.La calmoduline (CaM), qui est connue pour son affinité envers les actinides, agit comme un régulateur métabolique du calcium. Cette protéine, qui est présente de manière ubiquitaire dans le corps humain, peut également complexer d’autres métaux comme les actinides. Ainsi, en cas de contamination interne, les actinides complexés à la protéine pourraient l’empêcher de fonctionner correctement et donc avoir des répercussions sur un grand nombre de fonctions vitales pour l’organisme.La complexation du Np et de l’U par la CaM a été étudiée par spectroscopie EXAFS ce qui nous a permis de montrer que les actinides sont incorporés au site de complexation du calcium. Une fois les aspects structuraux et thermodynamiques étudiés, c’est l’impact de cette complexation sur les fonctions de la protéine qui a été étudié.Afin d’évaluer les conséquences de la complexation, une méthode calorimétrique basée sur une réaction enzymatique (Phosphodiesterase) a été développée. Ces expériences réalisées avec des concentrations variables d’actinides (30-500 nM) montrent une diminution de l’activité enzymatique lorsque la concentration d’actinide augmente. Les résultats montrent que le complexe CaM-An agit comme un inhibiteur enzymatique. De plus, on observe qu’à haute concentration en actinide, le complexe CaM-métal agit comme un poison et tue complètement l’activité enzymatique. / Considering the environmental impact of the Fukushima nuclear accident, it is fundamental to study the mechanisms governing the effects of the released radionuclides on the biosphere and thus identify the molecular processes generating the transport and deposition of actinides, such as neptunium and uranium. However, the information about the microscopic aspect of the interaction between actinides and biological molecules (peptides, proteins…) is scarce. The data being mostly reported from a physiological point of view, the structure of the coordination sites remains largely unknown. These microscopic data are indeed essential for the understanding of the interdependency between structural aspect, function and affinity.The Calmodulin (CaM) (abbreviation for CALcium-MODULated proteIN), also known for its affinity towards actinides, acts as a metabolic regulator of calcium. This protein is a Ca carrier, which is present ubiquitously in the human body, may also bind other metals such as actinides. Thus, in case of a contamination, actinides that bind to CaM could avoid the protein to perform properly and lead to repercussions on a large range of vital functions.The complexation of Np and U was studied by EXAFS spectroscopy which showed that actinides were incorporated in a calcium coordination site. Once the thermodynamical and structural aspects studied, the impact of the coordination site distortion on the biological efficiency was analyzed.In order to evaluate these consequences, a calorimetric method based on enzyme kinetics was developed. This experiment, which was conducted with both uranium (50 – 500 nM) and neptunium (30 – 250 nM) showed a decrease of the heat produced by the enzymatic reaction with an increasing concentration of actinides in the medium. Our findings showed that the Calmodulin actinide complex works as an enzymatic inhibitor. Furthermore, at higher neptunium (250 nM) and uranium (500 nM) concentration the metals seem to have a poison-like behavior and “kill” completely the enzymatic activity.