L’amyotrophie spinale (SMA) est causée par une réduction du taux de la protéine de Survie des MotoNeurones (SMN). Cette protéine est associée aux protéines Gemin 2 à Gemin 8 et unrip pour former le complexe SMN. Bien que la protéine SMN soit présente dans tous les types cellulaires, la pathologie SMA est exclusivement liée à un défaut des motoneurones. Récemment, il a été proposé que SMN puisse avoir des fonctions spécifiques dans le transport des ARNm et dans la régulation de la traduction dans les neurones. La protéine FMRP, défective dans le syndrome de l’X fragile, joue également un rôle dans le transport de particules messagères (mRNP) et dans leur traduction. Dans cette étude, nous avons mis en évidence un lien entre le complexe SMN et la protéine FMRP dans les cellules neuronales suggérant un rôle du complexe SMN dans ces mécanismes. Les connaissances sur la composition, les interactions et les fonctions du complexe SMN ont bien avancées ces dernières années. L’idée actuelle est que le complexe SMN agirait comme un chaperon macromoléculaire des RNP en augmentant l'efficacité et la fidélité des interactions ARN-protéines et en fournissant l’opportunité à ces interactions d’être régulées. Le deuxième volet de cette étude a été d’analyser l’implication du complexe SMN dans l’assemblage de RNP différentes des UsnRNP. Le défaut spécifique des motoneurones nous a conduit à considérer le rôle du complexe SMN dans l’assemblage de RNP spécifiques à ce type cellulaire et notamment la RNP BC200. Finalement, nous nous sommes également intéressé à l’implication du complexe SMN dans l’assemblage et/ou la fonction de la particule SRP, une particule ubiquitaire. / Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by reduced levels of the survival of motor neuron (SMN) protein. SMN protein is associated with the proteins Gemin 2 to 8 and unrip to form the SMN complex. Although the SMN protein is present in all cell types, SMA is restricted to a defect in motor neuron. SMN was recently proposed to have specific functions in mRNA transport and translation regulation in neuronal processes. The defective protein in Fragile X mental retardation syndrome (FMRP) also plays a role in transport of mRNPs and in their translation. In this study, we showed a link between the SMN complex and FMRP in neuronal cells suggesting a role for the SMN complex in these processes. Knowledges of the composition, interactions and functions of the SMN complex have advanced greatly in recent years. The emerging picture is that the SMN complex acts as a macromolecular chaperone of RNPs to increase the efficiency and fidelity of RNA–protein interactions, and to provide an opportunity for these interactions to be regulated. The second part of this study was to analyse the involvement of the SMN complex in the biogenesis of RNP different of UsnRNP. The specific defect of motor neuron led us to analyse the role of the SMN complex in the biogenesis of specific RNP to this cell types in particular the RNP BC200. Finally, we are also interested to the SMN complex involvement in the assembly and/or the function of the SRP particle, an ubiquitous particle.

Le travail présenté dans cette étude a été réalisé au laboratoire du Dr. Luca Pellegrini, qui se concentre sur les mécanismes régulant la dynamique mitochondriale. Dans ce contexte, mon travail s'est focalisé sur la protease rhomboïde Parl, un régulateur essentiel de l'apoptose, de la morphologie mitochondriale et du métabolisme et qui a été impliquée dans la maladie de Parkinson. Au cours de ce travail, nous avons adopté une approche en deux points pour comprendre les bases structurelles et mécanistiques de l'activité protéolytique de Pari et de sa régulation. Dans une première approche, nous avons réalisé une analyse de la structurefonction basée sur un modèle d'homologie pour identifier les déterminants structurels de Pari. L'identification d'un événement de coupure protéique (clivage- Y) qui génère une nouvelle forme de Pari présentant une structure à six segments transmembranaires à partir de la structure classique à 6+1 segments transmembranaires nous a servi de base pour cette étude. Nos résultats montrent des similarités de structure entre la protéine rhomboïde d'origine bactérienne GlpG and Pari. Cependant, Pari semble utiliser une catalyse par triade par opposition à la catalyse par dyade opérée par les rhomboïdes GlpG. Le clivage y perturbe la triade et rend ainsi Pari protéolytiquement inactif. Ainsi, notre étude a identifiée la régulation de la fonction de Pari par l'élimination protéolytique de son activité, ce que nous avons publié dans le journal Cell Death & Differentiation. Dans une seconde approche, nous nous sommes penché sur la validité d'un communiqué publié dans Nature (Chao et al., 2008) qui suppose un rôle pour la protéine HAX1 en tant que protéine présentatrice de substrat pour Pari. En effet, plusieurs faisceaux de preuves n'étaient pas cohérents avec les résultats de cette étude. Nos résultats montrent que Pari et HAX1 sont confinés dans des souscompartiments cellulaires distincts et que l'interaction observée in vitro n'est qu'un artefact. Ainsi in vivo, HAX1 ne peut pas contribuer à la régulation de la protéolyse 2opérée par Pari. Notre étude a contesté les résultats de Chao et al., et a été publiée dans un article de fond dans le journal Cell Death & Differentiation. Enfin, il est important de mentionner qu'au cours de mon doctorat j'ai été le coauteur d'une revue (Jeyaraju et al., BBA 2009) et de deux articles de recherche à travers des collaborations avec les laboratoires du Dr Toth (Lavoie et al., J.Neuroscience, 2011 ) et du Dr Shore (Warr et al., JBC, 2011 ).

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / L’anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare due à un défaut de réparation de l’ADN au niveau des pontages inter-brins. La protéine FANCG est impliquée, avec 15 autres protéines, dans cette réparation via la voie de Fanconi. En plus de ce rôle, FANCG a été identifié comme faisant partie du complexe B2D2GX3. Néanmoins, le rôle exact de ce complexe reste à être élucidé. Cette étude a permis de mettre en évidence de nouveaux interacteurs de FANCG, connus pour être impliqués dans diverses voies de réparation de l’ADN et dans le choix de la voie de réparation à utiliser. Ainsi, nous posons l’hypothèse que FANCG possède des fonctions additionnelles, via ces nouveaux partenaires. Les données recueillies montrent qu’indépendamment de son rôle dans la voie de Fanconi, et bien que ne liant pas l’ADN, FANCG est recruté aux sites de dommages à l’ADN et permet d’engendrer sa réparation.

L’épissage alternatif en 3’ du gène UGT1A entraîne la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui ne possèdent pas de domaine transmembranaire (TMD) et d’activité de glucuronidation, mais plutôt des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 via des interactions protéiques. Nous croyons que les interactions i1-i2 impliquent plusieurs domaines d’interactions et qu’ils sont différents de ceux impliqués dans l’homo-oligomérisation des i1. Des expériences de co-immunoprécipitation démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide +/- le TMD empêchent l’homo-oligomérisation sans affecter l’interaction i1-i2. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non-réductrices démontre l’implication potentielle de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus supportent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans les complexes i1-i1. / Alternative splicing of UDP-glucuronosyltranferase UGT1A gene results in the production of enzyme, isoforms i1 and i2. Unlike the active i1 proteins, i2 are truncated proteins which lack the transmembrane domain and glucuronic acid transferase activity, but have an inhibitory effect on UGT1A activity likely through the formation of hetero-oligomers with i1. We believe that i1-i2 interaction involves binding of more than one domain. Our results showed that i1, in the presence or absence of the transmembrane domain, without the signal peptide did not self-interact but instead interacted with i2. In addition, high molecular weight complexes were observed by immunoblotting under non-reducing conditions. It demonstrates the involvement of disulfide bonds in the formation of i1-i2 complexes. In summary, these results support that i1-i2 interactions involve multiple protein domains and they differ from those involved in homo-oligomerization of i1.

Le Ca[exposant]2+ joue un rôle majeur dans la régulation de processus physiologiques et biochimiques de l'organisme. Chez les cellules non-excitables, les TRPCs (transient receptor potential canonical) sont des canaux calciques impliqués dans l'influx de Ca[exposant]2+ à la membrane plasmique. Bien que de nombreux efforts soient déployés, le mécanisme régulant l'activité et le routage des TRPCs est encore mal connu. Au cours des dernières années, l'étude de domaines conservés au sein des protéines a connu un engouement. Tous les TRPCs possèdent un domaine de répétitions similaires à l'ankyrine (ANK), un motif bien connu pour son implication dans des interactions protéine-protéine. Le but de la présente étude était d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de double-hybride chez la levure afin de cribler une librairie d'ADNc, ce qui nous a permis d'identifier MxA et RNF24. MxA est une protéine faisant partie de la superfamille de la dynamine. Elle possède plusieurs propriétés de la dynamine classique, dont celle d'oligomériser. La première partie de l'étude démontre que MxA interagit au niveau de la deuxième répétition similaire à l'ankyrine de TRPC6 et que cette protéine peut lier tour les TRPCs, autant in vitro qu'in cellulo. Des mesures de Ca[exposant]2+ intracellulaire effectuées sur des cellules HEK 293T démontrent que l'interaction entre MxA et TRPC6 modifie significativement l'activité de TRPC6. De plus, l'utilisation de mutants de MxA démontre que la modulation de l'activité de TRPC6 s'effectue lorsque MxA est sous sa forme monomérique liée au GTP. Les résultats démontrent que MxA lie le domaine ANK de TRPC6 et modifie son activité. La découverte de RNF24 a permis d'identifier une nouvelle protéine membranaire localisée au niveau de l'appareil de Golgi. L'expression de RNF24 réduit spécifiquement l'insertion des TRPCs a la membrane plasmique, cause une rétention intracellulaire des TRPC3 et TRPC6, mais n'affecte pas le processus de maturation de TRPC6. De plus, dans les cellules HEK 293T stimulées par le carbachol, l'influx de Ca[exposant]2+ endogène ou médié par TRPC6 n'est pas affecté par la co-expression de RNF24. Ainsi, les résultats démontrent que RNF24 interagit avec les TRPCs, affecte le routage intracellulaire de ceux-ci sans modifier leur activité. Ces deux études ont permis d'identifier les premiers partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs, soit MxA et RNF24, et de caractériser l'effet des interactions sur la modulation du routage et de l'activité des TRPCs.

Le terme de sulfoprotéomique est utilisé pour désigner l’étude de la sulfatation des protéines. Bien que la sulfatation soit depuis peu considérée comme une MPT d’une importance majeure, il y a toujours peu de travaux scientifiques qui y sont consacrés en comparaison avec ce qui se fait sur la phosphorylation notamment. Ce retard s’explique notamment par la difficulté à analyser les espèces protéiques sulfatées dans les conditions classiques utilisées en protéomique, notamment par spectrométrie de masse. Ces travaux de thèse visent justement à développer des méthodes d’analyses par spectrométrie de masse dédiées à l’étude de la sulfatation des protéines, afin d’augmenter le champ des connaissances de cette MPT. Pour cela, nous avons largement utilisé le mode d’ionisation négatif, très peu, voire jamais utilisé en protéomique, avec deux techniques de fragmentation pour réaliser des spectres MS/MS, à savoir les fragmentations CID et HCD. Les résultats obtenus nous ont permis de mettre en évidence une méthode d’analyse permettant la formation d’ions spécifiques de la sulfatation et de la phosphorylation (qui sont isobariques), permettant ainsi une identification certaine de chacune des deux MPTs. Nous avons également entrepris d’étudier le rôle de la sulfatation d’un récepteur cellulaire, CXCR4, dans son interaction avec son ligand naturel, la chimiokine SDF-1/CXCL12. Cette étude a été menée par électrophorèse capillaire, et pourra constituer une base de travail solide pour des futures analyses mettant en œuvre le couplage entre l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse pour une meilleure caractérisation des complexes formés entre les partenaires protéiques. / Sulfoproteomics term designs protein sulfation studies. It appears during the 2000’s, when the interest for others Post-Translational Modifications (PTMs) than phosphorylation and glycosylation was growing up. Even though sulfation is thought to be an important PTM, a weak number of publications has emerged about it, notably if we compare with the huge quantity of phosphorylation papers. This difference is mainly due to the difficulty to correctly analyze sulfated proteins and peptides in the classical ways of proteomics, as in mass spectrometry for example. The goal of this thesis is to develop mass spectrometry methods dedicated to the characterization of sulfated species, in order to improve the knowledge of this PTM. To do that, we have mainly used negative ion mode, which is almost never used, with two fragmentations techniques for the MS/MS spectra, which are CID and HCD. Results obtained allow us to pinpoint an analytical method allowing the differentiation between sulfation and phosphorylation (they are isobaric), based on the presence of specific ion for each PTM in MS/MS. In another part of the project, we have investigated the role of sulfation in the interaction between a cellular receptor, CXCR4, and its in vivo ligand, the chemokine SDF-1/CXCL12. We used capillary electrophoresis for this work, and it could be a good basis for future analyses using capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry, in order to have a better characterization of the observed complexes.

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de HMGB1 et son récepteur RAGE dans l'étiopathogenèse des maladies parodontales. Nos résultats montrent que les macrophages de la lignée U937 sécrètent HMGB1 suite à une stimulation avec les lipopolysaccharides des bactéries parodontopathogènes, alors que son niveau intracellulaire demeure inchangé. Le récepteur RAGE est faiblement exprimé par cette lignée et sa forme membranaire reste inchangée suite à ces stimulations alors que sa forme soluble est indétectable. De plus, la protéine HMGB1 n'induit pas la production des cytokines pro-inflammatoires TNF-a et IL-1ß par les macrophages U937 et la neutralisation de HMGB1 et de RAGE n'affecte pas la sécrétion de ces cytokines. D'autre part, le dosage du HMGB1 plasmatique révèle un taux plus élevé chez les patients atteints de parodontites que chez les sujets sains. Cette étude a permis d'analyser l'induction de la sécrétion de HMGB1 et de RAGE par les lipopolysaccharides des parodontopathogènes.

Pour que la vie puisse exister, des milliers de protéines doivent interagir ensemble pour permettre les divers processus biochimiques essentiels que l’on retrouve au niveau cellulaire. Le dérèglement d’une seule interaction protéine-protéine peut avoir des conséquences catastrophiques sur la qualité de vie d’une personne. C’est ainsi que de nombreux programmes de recherches sont basés sur l’exploration d’une ou de plusieurs cibles protéiques impliquées dans diverses maladies. Étant donné la localisation intracellulaire des nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que l’absence de ligands connus, le développement d’agents thérapeutiques devient de plus en plus ardu. En effet, la chimie combinatoire classique et le design rationnel ont leurs limitations et il y a un besoin évident de développer de nouvelles approches pour faire l’étude et la modulation des interactions protéine-protéine. C’est dans cet esprit que s’imbrique les suivants travaux, qui portent sur les peptoïdes comme outil moléculaire peptidomimétique. Ces oligomères de glycine N-substitutée présentent notamment des propriétés pharmacologiques avantageuses et représentent une base moléculaire de choix pour élaborer de nouvelles méthodologies de criblage à haut débit. En passant par le développement de nouvelles approches de synthèse sur support solide, jusqu’à l’évaluation de la pénétration cellulaire de peptoïdes macrocycliques, le suivant mémoire devrait être lu comme un préambule à l’utilisation des peptoïdes en chimie combinatoire pour la découverte d’inhibiteurs ou de modulateurs d’interactions protéine-protéine.

La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

La ribonucléase III humaine Dicer est responsable de la biosynthèse des microARN et représente un pilier de la régulation génique, et donc de l’homéostasie cellulaire. Les microARN sont de petits éléments régulateurs de 19 à 24 nt qui régulent ~60% des gènes chez l’humain et sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires. De ce fait, il n’est pas étonnant qu’il y ait, dans la majorité des cancers, une diminution globale du niveau des microARN et que, dans plusieurs cas, un changement d’expression ou de localisation de la protéine Dicer ait été noté. Malgré le rôle important que joue Dicer dans la cellule, sa régulation n’est pas très bien connue, ni même les complexes de nature protéique au sein duquel il se trouve. Pour pallier à ce manque, nous avons criblé une librairie d’ADN complémentaires par double-hybride chez la levure, ce qui nous a permis de découvrir, et de caractériser, de nouvelles protéines pouvant interagir avec Dicer. Les résultats obtenus démontrent que Dicer est stabilisé par son interaction avec la protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE) cytoskeleton-linking endoplasmic réticulum (ER) membrane protein of 63 kDa (CLIMP-63). La protéine Dicer forme un complexe avec CLIMP-63 peu de temps après sa traduction de novo. Les protéines semblent interagir à l’intérieur du RE et mener à l’export de la protéine Dicer hors de la cellule. Durant la mitose, où les niveaux de protéines Dicer sont réduits, Dicer peut être acétylé par l’acétyl-transférase General Control of Amino-acid Synthesis 5 (GCN5), une modification qui semble stabiliser Dicer. La localisation nucléaire de Dicer peut être causée par la protéine Mitogen-activated protein kinase upstream kinase-binding inhibitory protein (MBIP), au cours d’un processus nécessitant une lysine acétylable à la position 301 du signal de localisation nucléaire de MBIP. Finalement, la cytokine (TWEAK) pourrait moduler l’activité de clivage de Dicer via une interaction directe entre les deux protéines. L’utilisation du double-hybride chez la levure a permis de jeter un éclairage nouveau sur les protéines pouvant réguler la fonction et la localisation de l’enzyme Dicer dans les cellules humaines, au-delà de sa simple activité catalytique.