Les interactions protéine-protéine (PPI) sont à la base du fonctionnement cellulaire de tous les organismes. Regroupées en deux catégories, les méthodes pour étudier les PPI permettent soit d’identifier les protéines composant le complexe, soit de déterminer les relations entre les protéines. Il existe peu de méthodes hybrides permettant d’obtenir ces deux informations et ces méthodes comportent plusieurs limitations. Le but de ce projet était de développer une nouvelle méthode hybride en modifiant la complémentation de fragments protéiques (DHFR PCA) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le principe de la DHFR PCA repose sur l’association de deux fragments rapporteurs complémentaires en présence d’une interaction protéine-protéine. Les fragments rapporteurs sont fusionnés aux protéines via un connecteur peptidique. La longueur du connecteur limite la distance maximale à laquelle il est possible de détecter une interaction entre deux protéines. Notre hypothèse était qu’en augmentant la longueur du connecteur, nous serions en mesure de détecter des interactions plus éloignées. Nous avons d’abord vérifié que l’augmentation de la longueur du connecteur permettait de modifier notre capacité à détecter des interactions sans toutefois perdre la spécificité de la méthode. De nouvelles interactions ont été détectées à l’intérieur d’un même complexe protéique et entre deux complexes. Nous avons ensuite validé notre capacité à mieux disséquer l’architecture des complexes protéiques en approfondissant le cas de cinq complexes protéiques à l’aide de plusieurs combinaisons de longueurs de connecteurs. Enfin, nous avons confirmé que la méthode permettait effectivement de détecter des interactions entre protéines plus distantes en comparant les résultats obtenus aux distances calculées à partir des structures du protéasome disponibles. La variation apportée à la DHFR PCA permet de moduler la résolution de l’étude des PPI et ainsi de mieux définir l’architecture des complexes protéiques. / Protein-protein interactions (PPI) are central to all cellular processes in all organisms. Grouped in two categories, methods to study PPI allow either to identify proteins composing protein complexes or to determine relationships between proteins. Only a few hybrid methods can be used to obtain both of those informations and these methods present many limitations. The goal of this project was to develop a new hybrid method by modifying the Protein-fragment complementation assay (DHFR PCA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DHFR PCA is based on the association of two complementary reporter fragments in presence of an interaction. Both fragments are fused to proteins with a peptide linker. Linker length limits the maximal distance at which it is possible to detect an interaction between two proteins. Our hypothesis was that increased linker length would allow the detection of more distant interactions. We first verified if the augmentation of linker length modified our capacity to detect interactions without losing specificity. New interactions were detected inside and between complexes. Then, we validated our capacity to better dissect protein complexes architecture by studying five protein complexes with different linker length combinations. Finally, we confirmed that the method allowed the detection of interactions that were further in space by comparing our results with distances calculated with available proteasome structures. This variation of DHFR PCA allows to modulate the resolution of PPI study and thus better define protein complexes architecture.

Les structures hétérocycliques pipérazines et azépines se retrouvent chez une grande variété de classes de médicaments. Avec leur capacité à mimer des structures secondaires de protéines, ces hétérocycles représentent des prototypes moléculaires de choix pour le développement d’inhibiteurs d’interactions protéine-protéine d’intérêt thérapeutique. Comme ces interactions jouent un rôle important dans un grand nombre de processus biologiques, elles représentent des cibles stratégiques pour le développement d’agents thérapeutiques innovateurs. L’objectif du projet consistait à développer une nouvelle méthode de synthèse rapide et efficace pour des hétérocycles peptidomimétiques pipérazinones et azépinones. La stratégie de synthèse était d’utiliser une réaction multicomposante de type Ugi sur support solide via une approche bifonctionnelle. Cette méthode permet de générer rapidement en une seule étape des molécules peptidomimétiques hétérocycliques à 6 et 7 membres et de générer des chimiothèques à haute diversité moléculaire. De cette manière, la diversité conformationnelle, en plus de la diversité fonctionnelle, peut être explorée, augmentant significativement la diversité moléculaire et la chance de trouver un inhibiteur sélectif. Les résultats obtenus démontrent que le support solide isonitrile peut être produit rapidement et en grande quantité. Les précurseurs bifonctionnels sont aussi synthétisés efficacement et permettent d’ajouter facilement une grande variété de groupements fonctionnels. De plus, nous avons démontré que la réaction de Ugi sur support solide avec des précurseurs bifonctionnels céto-acides commerciaux permet de générer différents hétérocycles. / Cetopiperazines and diazepines are very important privileged structures in medicinal chemistry and are found in a wide variety of bioactive compounds and drugs. With their ability to mimic different protein secondary structures, they constitute an excellent source of peptidomimetic scaffolds for the discovery and development of protein-protein interaction modulators. Since protein-protein interactions play an important role in many biological processes, they represent very attracting targets for the development of new therapeutic agents. The main objective of the project was to develop a new straightforward and efficient method for the synthesis of piperazinones and azepinones peptidomimetic heterocycles. The strategy was to use the Ugi multicomponent reaction on solid support via a bifunctional approach. This method allows in a single step the generation of peptidomimetic heterocycles of 6 and 7 members and the preparation of libraries with a high degree of molecular diversity. By this approach, conformational diversity in addition to the functional diversity can be explored, significantly increasing the molecular diversity ant the probability to find a selective inhibitor. The obtained results show that the isonitrile solid support can be rapidly produced in large quantities. We have also demonstrated that bifunctional compounds can be efficiently synthesized and that the Ugi reaction on solid support with commercial bifonctional keto-acid compounds can generate different heterocycles.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

Malgré les progrès réalisés dans les différentes stratégies thérapeutiques, l’efficacité des principales approches antitumorales a atteint un plateau critique dans le traitement de plusieurs cancers. Il y a donc un besoin urgent de découvrir de nouveaux composés anticancéreux innovateurs et efficaces. Surexprimée dans la plupart des cancers et indétectable dans la majorité des tissus normaux, la Survivine est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle clé dans le contrôle de la division cellulaire et de l’apoptose. Malgré son immense potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers, le portfolio de la Survivine est très mince. Dans le but de développer des inhibiteurs sélectifs de la Survivine deux approches différentes ont été utilisées dans ce projet : 1) une approche par design rationnel à partir d’un ligand et 2) une approche combinatoire. Un point critique dans les fonctions de la Survivine dans les cancers est son association avec la protéine du choc thermique 90kDa (Hsp90). La Shepherdine est un peptide inhibiteur de l’interaction entre la Survivine et la Hsp90. Malheureusement, elle est dégradée rapidement et possède une perméabilité cellulaire très faible. Pour contourner ce problème, la Shepherdine a été utilisée comme référence dans une approche de design rationnel pour réaliser des études de relation structure-activité et ultimement développer des analogues synthétiques possédant des propriétés pharmacologiques améliorées. L’approche combinatoire «one-bead-one-compound» (OBOC) possède un grand potentiel pour découvrir de nouveaux ligands de la Survivine, car elle permet d’exploiter de manière optimale la diversité moléculaire accessible avec les peptides cycliques. Par contre, leur utilisation dans cette approche est limitée par les problèmes associés avec la détermination de la séquence peptidique des composés après le criblage. Pour contourner ce problème, une nouvelle approche par réouverture de cycle a été mise au point pour la synthèse et le décodage de chimiothèques OBOC de peptides cycliques. Cette nouvelle méthode servira pour la préparation d’une chimiothèque OBOC de peptides cycliques qui seront criblés pour découvrir des ligands de la Survivine et de potentiels inhibiteurs.

Les protéines sont les machines moléculaires permettant à la cellule d’accomplir des fonctions biologiques. Pour accomplir ces fonctions, les protéines interagissent souvent entre elles de manière réversible et régulable, ce qui permet à la cellule de s’adapter rapidement à un environnement souvent instable en modulant ces interactions. Par conséquent, l’étude de la dynamique des interactions protéine-protéine est essentielle pour comprendre comment les cellules s’adaptent à diverses perturbations. Les deux chapitres de ce mémoire illustrent respectivement le développement d’une méthode pour identifier et quantifier des modulations d’interactions protéine-protéine en réponse à des perturbations environnementales et comment ces interactions peuvent être utilisées pour disséquer le réseau de régulation d’une protéine phosphatase, la calcineurine, à l’aide de perturbations génétiques. Ensemble, ces deux chapitres illustrent comment l’utilisation d’approches de perturbation du réseau d’interactions protéine-protéine permet de disséquer des processus cellulaires complexes. / Proteins are the molecular machines allowing the cell to accomplish a myriad of biological functions. To do so, proteins physically interact with each other in a reversible and tunable way, providing the cell a mechanism to quickly adapt to a changing environment. Thus, studying the dynamics of protein-protein interactions is key in understanding how cells adapt to various perturbations. The chapters included in this thesis illustrate the development of a method to identify and quantify changes in protein-protein interactions in response to environmental perturbations and how protein-protein interactions can be used as reporters to dissect the regulatory network of a protein phosphatase, calcineurin, using a network perturbation approach. Together, these two chapters illustrate the utility of network perturbation approaches to dissect complex cellular processes.

La sarcopénie (faible masse musculaire) est associée à l’inflammation silencieuse et à une augmentation du risque d’incapacité physique chez la population vieillissante. Une des interventions non pharmacologiques les mieux appuyées scientifiquement pour ralentir la sarcopénie est l’entraînement en résistance. Pour être en mesure de dépister la sarcopénie et évaluer l’efficacité des interventions qui s’y adressent, nous avons besoin d’outils qui permettent de quantifier la masse musculaire. Bien qu’elles soient issues de technologies avancées, les techniques d’imagerie actuelles quantifient la masse musculaire de façon « statique » ; c’est-à-dire qu’elles illustrent ses caractéristiques à un moment précis dans le temps, de manière figée. Or, la masse musculaire est en réalité le résultat d’une balance entre la dégradation et la synthèse des protéines musculaires, deux processus hautement dynamiques sur le plan métabolique. Récemment, les extracellular heat shock proteins 72 (eHSP72) – protéines de choc thermiques – ont été proposées comme biomarqueur de sarcopénie. En effet, des niveaux élevés d’eHSP72 circulants seraient un indicateur de dégradation musculaire et ont été associés à de faibles valeurs de masse musculaire. Ce biomarqueur offre l’avantage de refléter un processus intracellulaire dynamique et indique vraisemblablement qu’un individu se trouve en situation de perte de masse musculaire. Cette association entre eHSP72 et masse musculaire a été proposée comme étant modulée par l’inflammation systémique dans une population cachectique. Toutefois, l’évolution d’eHSP72 n’a jamais été étudiée chez une population sarcopénique en santé à la suite d’une intervention visant spécifiquement l’augmentation de la masse musculaire. L’adéquation entre l’évolution d’un biomarqueur et celle de son vis-à-vis clinique est importante pour justifier la pertinence de son utilisation en contexte longitudinal. Ce projet de maîtrise vise à : 1) évaluer l’effet d’un entraînement en résistance sur l’évolution du biomarqueur eHSP72 et de la masse maigre d’individus sarcopéniques en santé; 2) déterminer s’il existe des relations entre les changements d’eHSP72, de masse maigre et des niveaux de marqueurs inflammatoires circulants. Au total, 26 hommes sarcopéniques en santé ont complété 16 semaines d’entraînement et les variables suivantes ont été mesurées avant et après l’intervention : a) niveaux plasmatiques d’eHSP72 (ELISA), b) masse maigre (DXA), c) indice de masse musculaire appendiculaire [IMMapp : masse maigre appendiculaire (kg) / taille (m)[indice supérieur 2] ], d) niveaux sériques d’interleukine-6 (IL-6), protéine c-réactive (CRP) et facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) (ELISA haute sensibilité). Des concentrations d’eHSP72 ont été détectées chez 9/19 (47%) des participants en préintervention. Une diminution des niveaux d’eHSP72 a été observée à la suite de l’intervention (p=0,04) parallèlement à l’augmentation de l’IMMapp et de plusieurs variables de masse maigre (Ps ≤ 0,035). Une tendance intéressante a été soulevée entre l’évolution d’eHSP72 (diminution), hsIL-6 (diminution) et IMMapp (augmentation), sans corrélation significative entre les changements de ces variables, possiblement en raison d’un manque de puissance statistique. Ces résultats sont les premiers à démontrer l’intérêt d’utiliser eHSP72 comme biomarqueur de sarcopénie dans un devis longitudinal puisque son évolution est en adéquation avec celle de la masse maigre et de l’IMMapp, deux mesures cliniques pertinentes chez une population sarcopénique. Toutefois, les technologies ou protocoles utilisés pour son dosage doivent être raffinés, car nos données indiquent un faible taux de détection. Finalement, la tendance observée entre eHSP72, masse maigre et hsIL-6 indique que, même à des niveaux très bas d’inflammation systémique, des interactions sont possibles dans l’évolution de ces variables. Cette hypothèse mérite à notre avis d’être approfondie et possiblement confirmée chez une plus large population.

La progression du cancer de la prostate s’accompagne d’une augmentation du nombre de cellules neuroendocrines, cellules qui expriment fortement les canaux calciques voltage-dépendants de type T Cav3.2. Ces canaux favorisent la sécrétion de phosphatase acide prostatique, marqueur des cellules épithéliales prostatiques, et d’autres facteurs mitogènes potentiellement responsables de la prolifération des cellules avoisinantes. L'objectif de cette thèse était de déterminer les protéines partenaires du canal Cav3.2 et leur(s) rôle(s) dans la tumorogenèse prostatique. Nous montrons que les canaux Cav3.2 sont couplés aux canaux potassiques BK dans les cellules cancéreuses prostatiques. Ces 2 types de canaux interviennent dans la prolifération cellulaire. De plus, nous montrons que la sous-unité accessoire α2δ2 des canaux calciques voltage-dépendants est exprimée plus fréquemment dans les tissus cancéreux prostatiques par rapport aux tissus sains, et que son expression augmente avec le grade du cancer. Par des études in vitro et in vivo, nous mettons en évidence son rôle promoteur de la croissance tumorale et de l’angiogenèse. Par ailleurs, nous montrons que Cav3.2 et α2δ2 peuvent s’associer dans un même complexe protéique et qu’α2δ2 est capable de moduler l’activité de ce canal. Cependant, nos travaux suggèrent également que le rôle de cette sous-unité dans la prolifération prostatique pourrait être indépendant de son association avec Cav3.2. En conclusion, ce travail amène à une meilleure compréhension de l’implication des canaux calciques de type T et de ses protéines associées dans le cancer de la prostate. / Prostate cancer progression leads to an androgen-refractory aggressive stage. This is associated with an increased number of neuroendocrine cells overexpressing Cav3.2 T-type calcium channels. Cav3.2 channels promote the secretion of prostatic acid phosphatase and other mitogenic factors responsible for the proliferation of epithelial cells. In order to determine the role of T-type channels and to understand their regulation during cancer progression, the aim of this work was to identify proteins that interact with Cav3.2 channels and their role in physiopathology. First, we demonstrate that Cav3.2 channels are coupled with BK channels in prostate cancer cells. We show that both channels are involved in proliferation. Moreover, we show that accessory α2δ2, γ4 and β4 subunits, putative partners of voltage-gated calcium channels, are expressed in prostate cancer cell lines and prostatic tissues. We show that the α2δ2 subunit is more frequently expressed in cancerous tissues than in healthy ones, and that its expression increases with cancer grade. We propose that the α2δ2 subunit may be used as a biomarker for prostate cancer diagnosis. Furthermore, using in vitro and in vivo studies, we highlight the promoting role of α2δ2 on tumor growth and angiogenesis. In addition, we show that Cav3.2 and α2δ2 can associate in a protein complex and that α2δ2 can modulate the activity of Cav3.2 channels. However, our study also suggests that the role of the α2δ2 subunit in prostate cell proliferation could be independent of its association with Cav3.2. In conclusion, this work leads to a better understanding of the role of T-type calcium channel and its partners in prostate cancer.

Plusieurs études ces dernières décennies suggèrent l’importance des canaux TRPs dont TRPM8 dans le développement et la dissémination du cancer de la prostate. Néanmoins, les différentes études menées sur ce canal sont contradictoires. L’objectif de ma thèse a été d’étudier le rôle précis de TRPM8 dans le cancer prostatique par des études in vivo afin d’évaluer l’impact de TRPM8 sur la croissance tumorale, la dissémination de ces cellules et la formation de métastases. De plus, nous avons approfondi les mécanismes moléculaires sous-jacents régulant l’effet anti-migratoire de TRPM8.Grâce à l’utilisation de nanocapsules lipidiques contenant un agoniste du canal TRPM8, nous avons confirmé par des études in vitro et in vivo un rôle inhibiteur de TRPM8 sur les capacités de migration et d’invasion des cellules cancéreuses prostatiques. De plus, nous avons également déterminer un rôle de TRPM8 sur la croissance tumorale grâce à l’utilisation de greffes orthotopiques dans des prostates murines. Nous avons également déterminé les mécanismes de régulation de la migration cellulaire par le canal TRPM8 et des protéines partenaires à ce canal. Dans ce cadre, nous avons défini et déterminé une régulation du canal TRPM8 par les androgènes modulant la migration cellulaire mais également les mécanismes sous-jacents de l’inhibition de la migration cellulaire induite par TRPM8 et impliquant la petite GTPase Rap1.L’ensemble de nos résultats démontrent un rôle antiprolifératif et anti-migratoire du canal TRPM8 sur les cellule cancéreuses prostatiques, suggérant ainsi une action protectrice de ce canal dans la dissémination des métastases prostatiques. / Several studies in recent decades suggest the importance of TRP channel including TRPM8 in the development and metastatic dissemination of prostate cancer. Nevertheless, the different studies conducted on this channel are contradictory. The aim of my thesis was to study the precise role of TRPM8 in prostate cancer by in vivo studies to study the impact of TRPM8 on tumor growth and metastatic dissemination. In addition, we determined the underlying molecular mechanisms regulating the anti-migratory effect of TRPM8.Due to the use of lipid nanocapsules containing a TRPM8 channel agonist, we have confirmed by in vitro and in vivo studies an inhibitory role of TRPM8 on the migration and invasion capacities of prostatic cancer cells. In addition, we also determined an inhibitory role of TRPM8 on tumor growth through the use of orthotopic grafts in murine prostates. We also determined the regulatory mechanisms of cell migration by TRPM8 channel and its partner proteins. In this context, we defined and determined a regulation of the TRPM8 channel by androgens modulating cell migration. Moreover, we determined also the mechanisms underlying the inhibition of TRPM8-induced cell migration involving the small Rap1 GTPase.All of my results demonstrate an anti-proliferative and anti-migratory role of the TRPM8 channel on prostatic cancer cells, suggesting a protective action of this channel in the dissemination of prostatic metastases.

Le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un virus à ARN de polarité positive infectant plus de 130 millions de personnes dans le monde. Les inhibiteurs de Cyclophilines sont prometteurs en tant que nouvelles molécules thérapeutiques contre l'infection par le VHC. La Cyclophiline A, une protéine de l’hôte, joue un rôle essentiel pour la réplication de l’ARN viral mais sa fonction reste à élucider. La protéine non structurale du VHC NS5A (et plus particulièrement son domaine 2, NS5A-D2) est impliquée dans le mécanisme d’action de la CypA, étant donné que des mutations de résistances apparaissent dans ce domaine sous pression de sélection à la Cyclosporine A (CsA), l’inhibiteur connu de la CypA possédant une activité anti-VHC. NS5A est une protéine multifonctionnelle faiblement caractérisée au niveau moléculaire. Cette protéine est strictement requise pour la réplication de l’ARN viral mais ses fonctions moléculaires précises restent à élucider. Le domaine 2 désordonné de NS5A interagit directement avec la CypA et constitue un site substrat pour l’activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase de la CypA. Le site d’interaction au niveau de NS5A-D2 correspond à la région la plus conservée du domaine. Dans cette région la mutation D316E confère une résistance à la CsA. Au cours de ce travail, nous avons identifié et caractérisé par RMN un petit motif structural au sein de NS5A-D2 localisé au niveau de cette région particulière. Nous montrons que ce petit motif structural est essentiel pour la réplication de l’ARN du VHC. Nous avons également analysé les conséquences structurales des mutations de résistances aux inhibiteurs de Cyclophiline A, ainsi que les conséquences fonctionnelles de ces mutations de résistance vis-à-vis de la liaison et de l’activité PPIase de la CypA. L’alisporivir est un analogue non immunosuppresseur de la CsA actuellement en phase III de développement clinique. Nous avons analysé par cristallographie des rayons X la structure du complexe CypA-alisporivir permettant d’apporter une explication moléculaire au caractère non immunosuppresseur de cette molécule. Grâce à l’utilisation de deux stratégies de marquage de NS5A-D2 au fluor, nous avons caractérisé par RMN l’interaction moléculaire entre les protéines NS5A-D2 et NS5B, l’ARN-dépendante ARN polymérase du VHC.NS5A-D2 interagit avec l’Hexokinase 2 humaine, la première enzyme limitante de la glycolyse, cette interaction augmente l’activité enzymatique de l’HK2. Nous nous sommes intéressés aux relations structurales et fonctionnelles entre NS5A-D2 et HK2.Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le rôle de NS5A-D2 dans la réplication du VHC. / Hepatitis C Virus (HCV) is a positive strand RNA virus that has infected more than 130 million people worldwide. Cyclophilin inhibitors hold promise as a novel anti-HCV therapy. The host protein Cyclophilin A (CypA) plays an essential role in HCV RNA replication but its molecular function is unknown. The HCV protein NS5A (in its domain 2, NS5A-D2) has been shown to be implicated in the action of CypA as resistance mutations appeared in this domain under low doses of Cyclosporine A (CsA), the well-known CypA inhibitor with anti-HCV properties. NS5A is still an enigmatic multifunctional protein poorly characterized at the molecular level. This protein is strictly required for viral RNA replication but its precise molecular function(s) remain(s) to be elucidated. Its disordered domain 2 directly interacts with host CypA and is a substrate for the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity of CypA. The binding site onto NS5A-D2 corresponds to the most conserved region of the domain. In this region a mutation D316E has been shown to confer CsA resistance. In this work we identified by NMR spectroscopy a short structural motif including this particular position in the otherwise disordered NS5A-D2, and report its structure. We show that this structural motif is essential for HCV RNA replication. In addition, we analyze the structural consequences of the resistance mutation to CypA inhibitors, and the functional consequences of these mutation regarding the binding and PPIase activity of CypA. Alisporivir in a non-immunosuppressive analogue of CsA with anti-HCV activity currently evaluated in phase III clinical trials, we analyzed by X-ray crystallography the structure of the CypA-Alisporivir complex in order to provide a molecular explanation for its non-immunosuppressive character. We also describe the interaction between NS5A-D2 and the HCV RNA dependent RNA polymerase NS5B. We use two different strategies to incorporate a 19F nucleus in NS5A-D2 and explore the use of 19F NMR to monitor the interaction between NS5A-D2 and NS5B. We also investigated the structural and functional relationship between NS5A-D2 and the human Hexokinase 2 (HK2), the first rate limiting enzyme of glycolysis. NS5A-D2 interacts with HK2 and this interaction is sufficient to increase HK2 activity. These results shed new light on the mechanisms by which NS5A-D2 contributes to the HCV replication cycle.

Les rétrovirus appartiennent à une famille de virus où les protéines virales sont codées par un transcrit sens pleine longueur suite à un épissage alternatif. Récemment, notre équipe a contribué à démontrer pour la première fois la présence d'une transcription antisens chez le rétrovirus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus). Ce transcrit antisens épissé a été caractérisé et semble être initié dans le LTR 3' (Long Terminal Repeat), permettant ainsi la production d'une nouvelle protéine virale, nommée HBZ (HTLV-1 bZIP factor). Cette dernière est une protéine nucléaire et a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. Aussi, nous avons découvert et caractérisé des transcrits antisens chez HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4 et VIH-l (Virus d'Immunodéficience Humaine). Ce projet de maîtrise avait pour objectif de caractériser les nouvelles protéines APH-3 et APH-4 codées par les transcrits antisens de HTLV-3 et HTLV-4 respectivement. Il s'agissait donc d'étudier leur localisation ainsi que leurs fonctions dans la réplication rétrovirale. D'abord, une comparaison de séquence avec HBZ a permis d'identifier deux régions basiques ainsi qu'un motif « bZIP-like ». Des études de localisation cellulaire de ces protéines ont ensuite été réalisées par microscopie confocale. Ainsi, nous avons démontré que APH-3 et APH4 apparaissent nucléaires, sous la forme de granules et, dans le cas d'APH-3 partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ et la nucléoline. Par la suite, des mutants de délétion dépourvus des motifs BR2, BR1 et DBD ont permis de conclure que APH-3 et APH-4 contrairement à HBZ délété se rendent au noyau. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur luciférase précédé d'un promoteur de collagénase (site AP-l), ont démontré que ces deux protéines contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants de délétions ont démontré que le motif « leucine zipper » atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. Toutefois, une étude utilisant ces mutants de délétions et un gène rapporteur contenant le LTR 5' de HTLV-1 ont suggéré que le motif « leucine zipper » atypique ne semble pas être impliqué dans l'inhibition de la trans-activation par Tax. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que les transcrit antisens de HTLV-3 et HTLV-4 sont traduits tout comme chez d'autres rétrovirus. Ces protéines jouent d'importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ. Ces études ont permis d'approfondir la biologie moléculaire concernant la famille des rétrovirus et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives dans ce domaine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : APH, rétrovirus, HTLV, transcription antisens, HBZ, Jun, Tax.