L’épissage alternatif en 3’ du gène UGT1A entraîne la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui ne possèdent pas de domaine transmembranaire (TMD) et d’activité de glucuronidation, mais plutôt des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 via des interactions protéiques. Nous croyons que les interactions i1-i2 impliquent plusieurs domaines d’interactions et qu’ils sont différents de ceux impliqués dans l’homo-oligomérisation des i1. Des expériences de co-immunoprécipitation démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide +/- le TMD empêchent l’homo-oligomérisation sans affecter l’interaction i1-i2. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non-réductrices démontre l’implication potentielle de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus supportent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans les complexes i1-i1. / Alternative splicing of UDP-glucuronosyltranferase UGT1A gene results in the production of enzyme, isoforms i1 and i2. Unlike the active i1 proteins, i2 are truncated proteins which lack the transmembrane domain and glucuronic acid transferase activity, but have an inhibitory effect on UGT1A activity likely through the formation of hetero-oligomers with i1. We believe that i1-i2 interaction involves binding of more than one domain. Our results showed that i1, in the presence or absence of the transmembrane domain, without the signal peptide did not self-interact but instead interacted with i2. In addition, high molecular weight complexes were observed by immunoblotting under non-reducing conditions. It demonstrates the involvement of disulfide bonds in the formation of i1-i2 complexes. In summary, these results support that i1-i2 interactions involve multiple protein domains and they differ from those involved in homo-oligomerization of i1.

Le terme de sulfoprotéomique est utilisé pour désigner l’étude de la sulfatation des protéines. Bien que la sulfatation soit depuis peu considérée comme une MPT d’une importance majeure, il y a toujours peu de travaux scientifiques qui y sont consacrés en comparaison avec ce qui se fait sur la phosphorylation notamment. Ce retard s’explique notamment par la difficulté à analyser les espèces protéiques sulfatées dans les conditions classiques utilisées en protéomique, notamment par spectrométrie de masse. Ces travaux de thèse visent justement à développer des méthodes d’analyses par spectrométrie de masse dédiées à l’étude de la sulfatation des protéines, afin d’augmenter le champ des connaissances de cette MPT. Pour cela, nous avons largement utilisé le mode d’ionisation négatif, très peu, voire jamais utilisé en protéomique, avec deux techniques de fragmentation pour réaliser des spectres MS/MS, à savoir les fragmentations CID et HCD. Les résultats obtenus nous ont permis de mettre en évidence une méthode d’analyse permettant la formation d’ions spécifiques de la sulfatation et de la phosphorylation (qui sont isobariques), permettant ainsi une identification certaine de chacune des deux MPTs. Nous avons également entrepris d’étudier le rôle de la sulfatation d’un récepteur cellulaire, CXCR4, dans son interaction avec son ligand naturel, la chimiokine SDF-1/CXCL12. Cette étude a été menée par électrophorèse capillaire, et pourra constituer une base de travail solide pour des futures analyses mettant en œuvre le couplage entre l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse pour une meilleure caractérisation des complexes formés entre les partenaires protéiques. / Sulfoproteomics term designs protein sulfation studies. It appears during the 2000’s, when the interest for others Post-Translational Modifications (PTMs) than phosphorylation and glycosylation was growing up. Even though sulfation is thought to be an important PTM, a weak number of publications has emerged about it, notably if we compare with the huge quantity of phosphorylation papers. This difference is mainly due to the difficulty to correctly analyze sulfated proteins and peptides in the classical ways of proteomics, as in mass spectrometry for example. The goal of this thesis is to develop mass spectrometry methods dedicated to the characterization of sulfated species, in order to improve the knowledge of this PTM. To do that, we have mainly used negative ion mode, which is almost never used, with two fragmentations techniques for the MS/MS spectra, which are CID and HCD. Results obtained allow us to pinpoint an analytical method allowing the differentiation between sulfation and phosphorylation (they are isobaric), based on the presence of specific ion for each PTM in MS/MS. In another part of the project, we have investigated the role of sulfation in the interaction between a cellular receptor, CXCR4, and its in vivo ligand, the chemokine SDF-1/CXCL12. We used capillary electrophoresis for this work, and it could be a good basis for future analyses using capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry, in order to have a better characterization of the observed complexes.

Pour que la vie puisse exister, des milliers de protéines doivent interagir ensemble pour permettre les divers processus biochimiques essentiels que l’on retrouve au niveau cellulaire. Le dérèglement d’une seule interaction protéine-protéine peut avoir des conséquences catastrophiques sur la qualité de vie d’une personne. C’est ainsi que de nombreux programmes de recherches sont basés sur l’exploration d’une ou de plusieurs cibles protéiques impliquées dans diverses maladies. Étant donné la localisation intracellulaire des nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que l’absence de ligands connus, le développement d’agents thérapeutiques devient de plus en plus ardu. En effet, la chimie combinatoire classique et le design rationnel ont leurs limitations et il y a un besoin évident de développer de nouvelles approches pour faire l’étude et la modulation des interactions protéine-protéine. C’est dans cet esprit que s’imbrique les suivants travaux, qui portent sur les peptoïdes comme outil moléculaire peptidomimétique. Ces oligomères de glycine N-substitutée présentent notamment des propriétés pharmacologiques avantageuses et représentent une base moléculaire de choix pour élaborer de nouvelles méthodologies de criblage à haut débit. En passant par le développement de nouvelles approches de synthèse sur support solide, jusqu’à l’évaluation de la pénétration cellulaire de peptoïdes macrocycliques, le suivant mémoire devrait être lu comme un préambule à l’utilisation des peptoïdes en chimie combinatoire pour la découverte d’inhibiteurs ou de modulateurs d’interactions protéine-protéine.

La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

La ribonucléase III humaine Dicer est responsable de la biosynthèse des microARN et représente un pilier de la régulation génique, et donc de l’homéostasie cellulaire. Les microARN sont de petits éléments régulateurs de 19 à 24 nt qui régulent ~60% des gènes chez l’humain et sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires. De ce fait, il n’est pas étonnant qu’il y ait, dans la majorité des cancers, une diminution globale du niveau des microARN et que, dans plusieurs cas, un changement d’expression ou de localisation de la protéine Dicer ait été noté. Malgré le rôle important que joue Dicer dans la cellule, sa régulation n’est pas très bien connue, ni même les complexes de nature protéique au sein duquel il se trouve. Pour pallier à ce manque, nous avons criblé une librairie d’ADN complémentaires par double-hybride chez la levure, ce qui nous a permis de découvrir, et de caractériser, de nouvelles protéines pouvant interagir avec Dicer. Les résultats obtenus démontrent que Dicer est stabilisé par son interaction avec la protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE) cytoskeleton-linking endoplasmic réticulum (ER) membrane protein of 63 kDa (CLIMP-63). La protéine Dicer forme un complexe avec CLIMP-63 peu de temps après sa traduction de novo. Les protéines semblent interagir à l’intérieur du RE et mener à l’export de la protéine Dicer hors de la cellule. Durant la mitose, où les niveaux de protéines Dicer sont réduits, Dicer peut être acétylé par l’acétyl-transférase General Control of Amino-acid Synthesis 5 (GCN5), une modification qui semble stabiliser Dicer. La localisation nucléaire de Dicer peut être causée par la protéine Mitogen-activated protein kinase upstream kinase-binding inhibitory protein (MBIP), au cours d’un processus nécessitant une lysine acétylable à la position 301 du signal de localisation nucléaire de MBIP. Finalement, la cytokine (TWEAK) pourrait moduler l’activité de clivage de Dicer via une interaction directe entre les deux protéines. L’utilisation du double-hybride chez la levure a permis de jeter un éclairage nouveau sur les protéines pouvant réguler la fonction et la localisation de l’enzyme Dicer dans les cellules humaines, au-delà de sa simple activité catalytique.

Un des défis de l’ère post-génomique est de déterminer la fonction des protéines et plus précisément d’établir une cartographie protéomique de la cellule. Ainsi le défi de la génomique fonctionnelle et plus précisément de la protéomique est de comprendre les événements qui ont lieu au cours de la maturation des protéines. Plusieurs approches ont été décrites pour comprendre la fonction des protéines dont les interactions protéiques. Traditionnellement, les études des interactions protéiques étaient basées sur des approches ciblées ou sur des hypothèses d’interactions. Récemment, le développement des analyses à haut débit a généré une quantité impressionnante d’information. Face à l’accumulation des données, une approche uniquement expérimentale n’apparaît plus suffisante. Par conséquent, la création de méthodes bioinformatiques développant des procédures de prospection de données couplées avec des approches expérimentales permettra de prédire les interacteurs in silico. C’est dans cette optique que le laboratoire a développé son projet de recherche sur la famille des poly (ADP-ribose) polymérases (PARPs). La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout d’une chaîne d’ADP-ribose sur des protéines cibles.L’objectif principal de notre étude est de caractériser par des expériences d’immunoprécipitation le rôle dynamique de la poly(ADP-ribosyl)ation. L’identification des interacteurs des PARPs s’effectuera par spectrométrie de masse. Cette technique va générer d’importantes quantités de données et nécessitera une plate-forme d’analyse et de grandes capacités de calcul informatique. Dans ce contexte général, l’objectif de ce travail de thèse était de développer la plateforme bioinformatique d’analyse, d’implémenter les outils d’identifications des protéines, d’établir un contrôle de qualité des méthodes d’identification (spécificité/sensibilité) et enfin d’explorer le contenu des bases de connaissances. A l’aide du système mis en place au sein de la plateforme de protéomique, nous avons identifié de nouvaux interacteurs de la famille des PARPs comme par exemple RFC1, 2, 3, 4, 5. / An ambitious goal of proteomics is to elucidate the structure, interactions and functions of all proteins within cells and organisms. In the “post-genome” era, mass spectrometry (MS) has become an important method for the analysis of proteome data. One strategy to determine protein function is to identify protein–protein interactions. The rapid advances made in mass spectrometry in combination with other methods used in proteomics results in an increasing of proteomics projects. The increasing use of high-throughput and large-scale bioinformatics-based studies has generated a massive amount of data stored in a number of different databases. A challenge for bioinformatics is to explore array of information to uncover biologically relevant interactions and pathways. Thus for protein interaction studies, there is clearly a need to develop a systematic and stepwise in silico approach that can predict potential interactors or are most likely to improve our understanding of how complex biological systems work. The focus of our laboratory is the study of the activity of poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) and their role in the cell. Poly(ADP-ribosylation) is a post-synthetic protein modification consisting of long chains of poly(ADP-ribose) (pADPr) synthesized by PARPs at the expense of NAD+. The overall objective of this research is to extensively characterize the dynamic roles of poly(ADP-ribosyl)ation in response to cellular stresses that cause DNA damage. Our approach utilizes immunoprecipitation and affinity purification followed by mass spectrometry identification of associated proteins. One part of this thesis projet is to develop the architecture and major features of a web-based utility tool, which is designed to rationally organize protein and peptide data generated by the tandem mass spectrometry. Next, we have performed benchmarking to optimize protein identification. The system will be expanded as needed in order to make the analysis more efficient. We have also explored the public database information for protein identification data mining. Using the described pipeline, we have successfully identified several interactions of biological significance between PARP and other proteins such as RFC1, 2, 3, 4, 5.

La duplication de gènes est l’un des plus importants mécanismes évolutifs pour la génération de diversité fonctionelle. Lorsqu’un gène est dupliqué, la nouvelle copie partage toutes ses fonctions avec la copie ancestrale car elles encodent pour des protéines identiques. Donc, les deux protéines, appelées paralogues, auront le même réseau d’interactions physiques protéine-protéine. Cependant, dans le cas de la duplication des gènes qui codent des protéines qui interagissent avec elles-mêmes (homomères), la nouvelle protéine interagira aussi avec la copie ancestrale, ce qui introduit une nouvelle interaction (heteromère) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). Puisque ces interactions peuvent avoir des différents motifs de rétention et de fonction (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), il est important de mieux comprendre comment ces états sont atteints et quelles forces évolutives les favorisent. Dans ce memoire, je cible ces questions avec des simulations in silico de l’évolution des protéines suite à la duplication de gènes en travaillant avec des structures crystallographiques de haute qualité, provenant de la Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). Les simulations montrent que les sous-unités et interfaces partagées entraînent une forte corrélation entre les trajectoires évolutives de ces complexes. Ainsi, les simulations prédisent que la préservation de seulement les deux homomères ou seulement l’hétéromère ne devrait pas être fréquente. Toutefois, la simulation qui applique la sélection seulement sur un homomère montre que l’homomère neutre est destabilisé plus rapidement que l’hétéromère neutre. Nous avons comparé ces prédictions avec des résultats expérimentaux du réseau d’interactions protéine-protéine de la levure. Comme suggéré par les simulations, les patrons d’interactions les plus fréquents ont été la formation des trois complexes (deux homomères et un hétéromère) ou la formation de seulement un homomère. Les patrons correspondants à deux homomères sans hétéromères ou un hétéromère sans homomères sont rares. Nos résultats démontrent l’extension de l’hétéromérisation entre paralogues dans le réseau d’interactions physiques protéine-protéine de la levure, les mécanismes sous-jacents et ses implications. / Gene duplication is one of the most important evolutionary mechanisms for the generation of functional diversity. When a gene is duplicated, the new copy shares all of the ancestral copy’s functions because they encode identical proteins. Therefore, the two proteins, called paralogs, will have the same protein-protein interaction network. However, in the case of the duplication of genes encoding proteins that self-interact (homomers), the new protein will also interact with the ancestral copy, introducing a novel interaction (heteromer) (Kaltenegger and Ober, 2015; Pereira-Leal et al., 2007). As these interactions can have different retention and functional patterns (Ashenberg et al., 2011; Baker et al., 2013; Boncoeur et al., 2012; Bridgham et al., 2008), it is important to understand better how these states are reached and what evolutionary forces favor each of them. In this thesis, I approach these questions by means of in silico simulations of protein evolution after gene duplication by working with high-quality crystal structures from the Protein Data Bank (Berman et al., 2000; Dey et al., 2018). The simulations show that the shared subunits and interfaces lead to these complexes having highly correlated evolutionary trajectories. Thus, the simulations predict that the preservation of only the two homomers or only the heteromer is not likely to happen often. Nevertheless, simulating evolution with selection on only one homomer shows that the neutral homomer is destabilized faster than the neutral heteromer. We compared these predictions against experimental results from the yeast protein-protein interaction network. As suggested by the simulations, the most abundant interaction patterns were either the formation of all three complexes (two homomers and one heteromer) or the formation of only one homomer, with motifs corresponding to two homomers without a heteromer or a heteromer without homomers being rare. Our results highlight the extent of heteromerization between paralogs in the yeast protein-protein interaction network, the underlying mechanisms, and its implications

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les interactions protéine-protéine (PPI) sont à la base du fonctionnement cellulaire de tous les organismes. Regroupées en deux catégories, les méthodes pour étudier les PPI permettent soit d’identifier les protéines composant le complexe, soit de déterminer les relations entre les protéines. Il existe peu de méthodes hybrides permettant d’obtenir ces deux informations et ces méthodes comportent plusieurs limitations. Le but de ce projet était de développer une nouvelle méthode hybride en modifiant la complémentation de fragments protéiques (DHFR PCA) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le principe de la DHFR PCA repose sur l’association de deux fragments rapporteurs complémentaires en présence d’une interaction protéine-protéine. Les fragments rapporteurs sont fusionnés aux protéines via un connecteur peptidique. La longueur du connecteur limite la distance maximale à laquelle il est possible de détecter une interaction entre deux protéines. Notre hypothèse était qu’en augmentant la longueur du connecteur, nous serions en mesure de détecter des interactions plus éloignées. Nous avons d’abord vérifié que l’augmentation de la longueur du connecteur permettait de modifier notre capacité à détecter des interactions sans toutefois perdre la spécificité de la méthode. De nouvelles interactions ont été détectées à l’intérieur d’un même complexe protéique et entre deux complexes. Nous avons ensuite validé notre capacité à mieux disséquer l’architecture des complexes protéiques en approfondissant le cas de cinq complexes protéiques à l’aide de plusieurs combinaisons de longueurs de connecteurs. Enfin, nous avons confirmé que la méthode permettait effectivement de détecter des interactions entre protéines plus distantes en comparant les résultats obtenus aux distances calculées à partir des structures du protéasome disponibles. La variation apportée à la DHFR PCA permet de moduler la résolution de l’étude des PPI et ainsi de mieux définir l’architecture des complexes protéiques. / Protein-protein interactions (PPI) are central to all cellular processes in all organisms. Grouped in two categories, methods to study PPI allow either to identify proteins composing protein complexes or to determine relationships between proteins. Only a few hybrid methods can be used to obtain both of those informations and these methods present many limitations. The goal of this project was to develop a new hybrid method by modifying the Protein-fragment complementation assay (DHFR PCA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DHFR PCA is based on the association of two complementary reporter fragments in presence of an interaction. Both fragments are fused to proteins with a peptide linker. Linker length limits the maximal distance at which it is possible to detect an interaction between two proteins. Our hypothesis was that increased linker length would allow the detection of more distant interactions. We first verified if the augmentation of linker length modified our capacity to detect interactions without losing specificity. New interactions were detected inside and between complexes. Then, we validated our capacity to better dissect protein complexes architecture by studying five protein complexes with different linker length combinations. Finally, we confirmed that the method allowed the detection of interactions that were further in space by comparing our results with distances calculated with available proteasome structures. This variation of DHFR PCA allows to modulate the resolution of PPI study and thus better define protein complexes architecture.

Les structures hétérocycliques pipérazines et azépines se retrouvent chez une grande variété de classes de médicaments. Avec leur capacité à mimer des structures secondaires de protéines, ces hétérocycles représentent des prototypes moléculaires de choix pour le développement d’inhibiteurs d’interactions protéine-protéine d’intérêt thérapeutique. Comme ces interactions jouent un rôle important dans un grand nombre de processus biologiques, elles représentent des cibles stratégiques pour le développement d’agents thérapeutiques innovateurs. L’objectif du projet consistait à développer une nouvelle méthode de synthèse rapide et efficace pour des hétérocycles peptidomimétiques pipérazinones et azépinones. La stratégie de synthèse était d’utiliser une réaction multicomposante de type Ugi sur support solide via une approche bifonctionnelle. Cette méthode permet de générer rapidement en une seule étape des molécules peptidomimétiques hétérocycliques à 6 et 7 membres et de générer des chimiothèques à haute diversité moléculaire. De cette manière, la diversité conformationnelle, en plus de la diversité fonctionnelle, peut être explorée, augmentant significativement la diversité moléculaire et la chance de trouver un inhibiteur sélectif. Les résultats obtenus démontrent que le support solide isonitrile peut être produit rapidement et en grande quantité. Les précurseurs bifonctionnels sont aussi synthétisés efficacement et permettent d’ajouter facilement une grande variété de groupements fonctionnels. De plus, nous avons démontré que la réaction de Ugi sur support solide avec des précurseurs bifonctionnels céto-acides commerciaux permet de générer différents hétérocycles. / Cetopiperazines and diazepines are very important privileged structures in medicinal chemistry and are found in a wide variety of bioactive compounds and drugs. With their ability to mimic different protein secondary structures, they constitute an excellent source of peptidomimetic scaffolds for the discovery and development of protein-protein interaction modulators. Since protein-protein interactions play an important role in many biological processes, they represent very attracting targets for the development of new therapeutic agents. The main objective of the project was to develop a new straightforward and efficient method for the synthesis of piperazinones and azepinones peptidomimetic heterocycles. The strategy was to use the Ugi multicomponent reaction on solid support via a bifunctional approach. This method allows in a single step the generation of peptidomimetic heterocycles of 6 and 7 members and the preparation of libraries with a high degree of molecular diversity. By this approach, conformational diversity in addition to the functional diversity can be explored, significantly increasing the molecular diversity ant the probability to find a selective inhibitor. The obtained results show that the isonitrile solid support can be rapidly produced in large quantities. We have also demonstrated that bifunctional compounds can be efficiently synthesized and that the Ugi reaction on solid support with commercial bifonctional keto-acid compounds can generate different heterocycles.