La structure de base de la chromatine est le nucléosome contenant 146 pb de l'ADN, enroulé autour d'un octamère d'histone composé de deux dimères d'histone H2A-H2B et d'un tétramère d'histone H3-H4. De nombreuses protéines nonhistone sont impliquées dans la régulation de la structure chromatinienne. Notre laboratoire s'intéresse à l'étude d'une protéine structurale de type HMG retrouvée chez Saccharomyes cerevisiae : Spt2/Sin1. Des études précédentes ont mis en évidence le rôle de cette protéine dans de nombreux mécanismes transcriptionnels tels l'initiation, l'élongation et la terminaison. Pour mieux comprendre la fonction de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle, nous avons décidé d'utiliser un modèle fortement régulé par Spt2. Il a été démontré que la mutation spt2A déréprimait le gène SER3. De façon intéressante, la répression du gène SER3 est due à la transcription active d'un ARN non codant (ARNnc), en amont du gène, appelé SRG1. Ce mécanisme complexe de régulation est appelé interférence à la transcription. Mes résultats montrent clairement que la répression du gène SER3 n'est pas uniquement liée au taux de production de l'ARNnc mais aussi à la formation d'une structure chromatinienne propre permettant la régulation du mécanisme d'interférence. De plus, je montre que, comme Spt6, Spt2 joue un rôle central dans l'établissement de cette structure chromatinienne répressive. Pour finir, en utilisant un test d'échange nucleosomal, je montre que la protéine Spt2 contribue à la déposition des histones H3 dans le sillage de l'ARNP II au niveau de SRG1. Cette nouvelle fonction de Spt2 suggère un rôle de la protéine dans l'assemblage nucleosomal lié à la transcription.

Un mécanisme évolutif très important pour l'acquisition de nouvelles fonctions protéiques est la duplication génique. Les protéines paralogues résultantes subissent une divergence fonctionnelle permettant à leur gène d'être retenus dans le génome. Les événements de duplication étant à l'origine de l'expansion de la famille des domaines SH3, une compréhension de la divergence des propriétés de liaison de ceux-ci sur les protéines paralogues est essentielle pour saisir leur implication dans diverses fonctions cellulaires. La liaison des domaines SH3 peut être très spécifique ou elle peut reconnaître des groupes canoniques de peptides riches en proline. Ainsi, l'objectif de ce projet de maîtrise est d'améliorer notre compréhension sur l'évolution des propriétés de liaison des domaines SH3 portés par des paralogues. En utilisant des données sur les interactions physiques entre les protéines in vivo, nous avons établi que les domaines SH3 des myosines de type I de Saccharomyces cerevisiae, un organisme modèle, montraient une divergence fonctionnelle. Puis, les domaines SH3 ont été échangés entre les paralogues et les domaines ancestraux pré-duplications ont été insérés dans les paralogues. Cette expérience a révélé que le domaine SH3 présent au moment de la duplication montre le même profil d'interaction que les SH3 existants, mais que les SH3 plus anciens perdent graduellement leurs interactions. Ensuite, l'arrimage moléculaire des SH3s avec leurs peptides de liaison prédits ainsi que la caractérisation des interactions des SH3s libres montrent que l'affinité ne diminue pas avec le domaine ancestral. Ces résultats sont confirmés par le patron de PPIs des domaines SH3 libre de contexte protéique. Cela a permis de déterminer que la propriété de liaison n'est pas le facteur principal qui influence sur les interactions des domaines SH3 présent sur des paralogues, mais que c'est leur protéine hôte. Nos résultats s'accordent avec la recherche récente qui suggère que les domaines protéiques ne sont pas des éléments isolés dans une protéine, contrairement à la croyance répandue. / A very important evolutionary mechanism for the acquisition of new protein functions is gene duplication. The resulting paralogous proteins undergo functional divergence allowing them to be retained in the genome. Since duplication events are responsible for the expansion of the SH3 domain family, an understanding of the divergence of the binding properties of SH3 domains on paralogous proteins is essential to grasp their involvement in various cellular functions. The binding of SH3 domains can be very specific or it can recognize canonical groups of proline-rich peptides. The objective of this master project is to improve our understanding of the evolution of the binding properties of SH3 domains carried by paralogs. Using data on physical interactions between proteins in vivo, we established that the SH3 domains of the type I myosins from Saccharomyces cerevisiae, a model organism, show functional divergence. Then, the SH3 domains were exchanged between paralogs and the pre-duplication ancestral domains were inserted into the paralogs. This experiment showed that the SH3 domain at the time of duplication displays the same interaction profile as the extant SH3s, but, as the SH3s get older, they gradually lose their interactions. Next, molecular docking of the SH3s with their predicted binding peptides and characterization of the free SH3s PPIs shows that the affinity does not decrease with the ancestral domain. Those results are confirmed by the PPI network of the SH3 domains free of a protein context. These experiments determined that the host protein is the primary factor influencing paralogous SH3 domain interactions instead of the SH3 binding preferences. Our results are consistent with recent research suggesting that protein domains are not isolated elements in a protein, contrary to popular belief.

Les interactions protéine-protéine (PPI) sont à la base du fonctionnement cellulaire de tous les organismes. Regroupées en deux catégories, les méthodes pour étudier les PPI permettent soit d’identifier les protéines composant le complexe, soit de déterminer les relations entre les protéines. Il existe peu de méthodes hybrides permettant d’obtenir ces deux informations et ces méthodes comportent plusieurs limitations. Le but de ce projet était de développer une nouvelle méthode hybride en modifiant la complémentation de fragments protéiques (DHFR PCA) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le principe de la DHFR PCA repose sur l’association de deux fragments rapporteurs complémentaires en présence d’une interaction protéine-protéine. Les fragments rapporteurs sont fusionnés aux protéines via un connecteur peptidique. La longueur du connecteur limite la distance maximale à laquelle il est possible de détecter une interaction entre deux protéines. Notre hypothèse était qu’en augmentant la longueur du connecteur, nous serions en mesure de détecter des interactions plus éloignées. Nous avons d’abord vérifié que l’augmentation de la longueur du connecteur permettait de modifier notre capacité à détecter des interactions sans toutefois perdre la spécificité de la méthode. De nouvelles interactions ont été détectées à l’intérieur d’un même complexe protéique et entre deux complexes. Nous avons ensuite validé notre capacité à mieux disséquer l’architecture des complexes protéiques en approfondissant le cas de cinq complexes protéiques à l’aide de plusieurs combinaisons de longueurs de connecteurs. Enfin, nous avons confirmé que la méthode permettait effectivement de détecter des interactions entre protéines plus distantes en comparant les résultats obtenus aux distances calculées à partir des structures du protéasome disponibles. La variation apportée à la DHFR PCA permet de moduler la résolution de l’étude des PPI et ainsi de mieux définir l’architecture des complexes protéiques. / Protein-protein interactions (PPI) are central to all cellular processes in all organisms. Grouped in two categories, methods to study PPI allow either to identify proteins composing protein complexes or to determine relationships between proteins. Only a few hybrid methods can be used to obtain both of those informations and these methods present many limitations. The goal of this project was to develop a new hybrid method by modifying the Protein-fragment complementation assay (DHFR PCA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. DHFR PCA is based on the association of two complementary reporter fragments in presence of an interaction. Both fragments are fused to proteins with a peptide linker. Linker length limits the maximal distance at which it is possible to detect an interaction between two proteins. Our hypothesis was that increased linker length would allow the detection of more distant interactions. We first verified if the augmentation of linker length modified our capacity to detect interactions without losing specificity. New interactions were detected inside and between complexes. Then, we validated our capacity to better dissect protein complexes architecture by studying five protein complexes with different linker length combinations. Finally, we confirmed that the method allowed the detection of interactions that were further in space by comparing our results with distances calculated with available proteasome structures. This variation of DHFR PCA allows to modulate the resolution of PPI study and thus better define protein complexes architecture.

Les organismes eucaryotes possèdent plusieurs mécanismes de contrôle qualité en vue d'assurer leur survie en condition de stress. La réponse aux protéines mal repliées (UPR) est un mécanisme à la base de différents volets ayant pour but de ramener l'organisme vers l'homéostasie. L'étude qui suit vise à caractériser plus en profondeur un volet de cette réponse qui est lié non pas à la présence de protéines mal repliées, mais plutôt à des défauts dans l'homéostasie des lipides de la cellule. Notre étude a mis en évidence qu'une forme précise de la protéine à ancrage GPI modèle Yps1p est relâchée de manière importante dans des souches mutantes connues pour déclencher ce volet de la réponse UPR. Nous avons aussi montré que cette relâche ne semble pas être causée par le déclenchement de l'UPR et que des phospholipases sont responsables du clivage de l'ancrage GPI. Une défaillance ou une insuffisance de l'UPR est associée à plusieurs pathologies humaines, dont le diabète de type 2, d'où l'intérêt d'en étudier les différentes facettes.

La transcription est le processus biologique qui permet l'expression des gènes et donc est essentielle à la vie cellulaire. Ce phénomène nécessite une régulation très fine via de nombreux signaux cellulaires menant à un contrôle de la dynamique chromatinienne. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4 participe à cette régulation en acétylant les queues N-terminales des histones H4 et H2A. La chromatine est alors plus relâchée, ce qui facilite l'accès de toute la machinerie transcriptionnelle. Lors de cette étude, nous avons abordé deux aspects distincts de la fonction de NuA4. D'une part, la sous-unité Yng2, homologue de suppresseur de tumeur humain impliqué entre autres dans la régulation de p53, est connue pour interférer dans plusieurs processus cellulaires. In vivo, le mutant Ayng2 entraîne une diminution de l'acétylation de H4 et de la transcription dépendante de NuA4. La création de mutations ponctuelles dans le domaine ± Plant HomeoDomain ¿ (PHD) et la région polybasique de la protéine provoque la perte d'interactions spécifiques avec la modification post-traductionnelle H3K4me3 et les phosphatidylinositol phosphates. L'étude fonctionnelle de ces mutants révèle une répercussion sur l'activité de NuA4 et la transcription. D'autre part, les sous-unités EaO, 5 et 7 existent majoritairement hors de NuA4 sous la forme d'un trimère. Des tests de sensibilité mettent en évidence une corrélation entre ce trimère et la transcription. De plus, le trimère serait présent à la région codante de gènes transcrits suggérant un rôle dans l'élongation transcriptionnelle.