Le travail présenté dans ce document correspond à huit années de recherche sur la problématique de l'interaction entre protéines. J'ai abordé le problème de la prédiction des interactions entre protéines sous l'angle de l'apprentissage supervisé. Je me suis donc intéressé à l'apprentissage de modèles prédictifs aux interactions entre protéines. J'ai étudié deux types d'interactions différentes : - l'interaction protéine-protéine au sens réseau d'interactions ; - l'interaction physique entre protéines consistant à prédire quels résidus se trouvent effectivement en interaction (amarrage protéine-protéine). Le document est structuré de la manière suivante : après avoir présenté la problématique de l'apprentissage supervisé et non-supervisé dans le premier chapitre, un second chapitre est consacré à la prédiction d'interaction protéine-protéine. Les résultats obtenus sur l'amarrage protéine-protéine est présenté dans le troisième chapitre et enfin, un dernier chapitre est consacré aux perspectives associées à ces travaux.

La protéine nucléolaire Dbp4 est impliquée dans la biogenèse de l'ARN ribosomique (ARNr) 18S chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle présente une interaction génétique avec le petit ARN nucléolaire (snoRNA) U14. Dbp4 est une RNA hélicase de la famille «DEAD-box» et elle est hautement conservée dans l'évolution. Son homologue chez l'humain (DDX10) serait impliqué dans certains types de cancers. La plupart des «DEAD-box » RNA hélicases sont essentielles à la croissance de la levure indiquant ainsi une absence de redondance de leurs fonctions sur leurs substrats spécifiques. De façon plus intéressante, il a été démontré que plusieurs hélicases seraient aussi impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Les protéines «DEAD-box» sont caractérisées par la présence de neuf motifs conservés formant la région centrale catalytique de l'enzyme. Cette dernière est flanquée par deux extensions de composition variable aux extrémités N- et C-terminales. Ces extensions joueraient un rôle déterminant dans la reconnaissance du substrat et/ou la liaison de cofacteurs. Nos analyses bioinformatiques prédisent la présence d'un domaine d'interaction protéine-protéine appelé domaine «coiled-coil» (CC) à chacune des extrémités N-et C-terminale. Notre hypothèse est que Dbp4 serait associé à des protéines par l'intermédiaire de ces domaines CC. Afin d'identifier les partenaires protéiques potentiels de Dbp4, nous avons utilisé le système double hybride chez la levure en criblant une banque génomique de Saccharomyces cerevisiae. Parmi les clones positifs, nous avons identifié la présence des protéines Ifh1, Rrn5, Rps20, Rps2 et Msb2. Curieusement à l'exception de Msb2, toutes ces protéines sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes et renferment des domaines CC comme Dbp4. Cela suggère que ces protéines sont des partenaires potentiels de Dbp4 pour la biogenèse des ribosomes. Pour confirmer ces résultats de double hybride, nous avons réalisé des tests in vivo par co-immunoprécipitation dont les résultats préliminaires n'ont pas été concluants. Des études complémentaires seront nécessaires afin d'éclaircir ces résultats. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Saccharomyces cerevisiae, Nucléole, Ribosomes, RNA hélicases, Dbp4.

Différentes formes plus courtes de la protéine de la matrice (M) du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) peuvent être produites lors de l'infection de cellules in vitro à cause des phénomènes d'initiation interne de la traduction (Jayakar et Whitt, 2002) et de protéolyse (Rosen et al., 1983). L'objectif de la présente étude était de caractériser les formes plus courtes de M produites lors de l'infection de cellules par une souche sauvage du VSV (HR), ou par un variant (T1 026-R1) qui possède une mutation sur sa protéine M (M51R). Pour ce faire, des cellules HeLa, BHK-21 et L929 ont été infectées par ces deux variants lors d'expériences séparées. Des immunobuvardages et des tests de type «pulse-chase» ont permis d'observer l'existence d'au moins quatre formes de M à l'intérieur des cellules infectées (M1, M', M" et Mfc) et ce, indépendamment de la souche virale employée. Lors de l'infection des cellules par la souche sauvage du VSV (HR), les formes M" et Mfc pourraient être produites par initiation interne de la traduction aux positions 33 et 51 de M, respectivement. L'existence de la forme Mfc, ou d'une protéine de taille semblable, à l'intérieur des cellules infectées par T1026-R1, ne peut cependant pas être expliquée par un évènement d'initiation interne de la traduction en position 51 à cause de la mutation M51 R. L'origine de cette protéine pourrait être attibuable à l'action de la trypsine ou une autre protéase activée au cours de l'infection. Des expériences de «pulse-chase» en présence de l'inhibiteur z-VAD ont montré que l'apparition de Mfc pouvait dépendre de l'activation des cystéines protéases. L'analyse des séquences des différentes formes de M par dégradation de Edman et par spectrométrie de masse n'a pas permis d'identifier la portion manquante de la protéine. Aussi, afin de tenter de déterminer le rôle physiologique des formes de M produites par initiation interne de la traduction, des vecteurs d'expression inductible des gènes tronqués ont été construits. L'expression de ces protéines à l'intérieur de cellules HeLa transfectantes stables n'a pu être détectée. La protéase impliquée dans la production de la forme Mfc du mutant T1 026-R1 reste à identifier ainsi que le rôle des différentes formes plus courtes de la protéine M dans la cytopathogénèse et le cycle de réplication du VSV. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Virus stomatite vésiculeuse, Protéine matrice, Initiation interne de la traduction, Protéolyse.

Les lentivirus sont un groupe de virus appartenant à la famille des Retroviridae. Le modèle par excellence pour l'étude des lentivirus est le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) qui est l'agent causant le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA. Les études réalisées sur les protéines du virus telles que Nef, Vpu, Tat et Rev ont permis de mieux connaître la biologie et les mécanismes de pathogenèse du VIH de type 1 (VIH-1). Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un lentivirus qui a servi de modèle d'étude de la protéine Tat du VIH. Bien que le VIH-1 et le VIB appartiennent aux lentivirus, les maladies qu'ils causent sont très différentes. Le potentiel pathogénique du VIB est controversé et les mécanismes pathogéniques et la biologie du VIB ne sont pas encore bien connus. Seule la protéine Tat a été bien caractérisée. L'étude approfondie des autres protéines virales nécessaires à la réplication du virus comme la protéine Rev permettront de donner des outils nécessaires à la compréhension de la biologie du VIB et des mécanismes impliqués dans la pathogenèse des lentivirus. La protéine Rev a une fonction essentielle dans la réplication des lentivirus. Le rôle de Rev est d'exporter les ARNs viraux non épissés et partiellement épissés du noyau au cytoplasme pour produire en outre les protéines nécessaires à l'assemblage des nouvelles particules virales. La protéine Rev du VIH-1 contient minimalement quatre domaines fonctionnels importants : un domaine basique riche en arginines nécessaire à la liaison de l'ARN ou RBD qui contient des signaux de localisation nucléaire et nucléolaire (NLS et NoLS), un domaine riche en leucines nécessaire à l'exportation du complexe Rev-ARN (NES) et deux régions nécessaires à la multimérisation de Rev. Le but de ce projet est de caractériser moléculairement et biologiquement la protéine Rev du VIB. Dans ces travaux, nous rapportons la caractérisation des NLS et NoLS de la protéine Rev du VIB. Grâce à la transfection d'une série de protéines mutantes de Rev du VIB fusionnées à la enhanced green fluorescent protein (EGFP). Nous avons démontré que le NLS de la protéine Rev du VIB est bipartite. Ce type de NLS est le premier à être identifié dans la famille des protéines Rev des lentivirus/rétrovirus. De plus, nous avons déterminé que le NoLS était localisé entre les deux motifs basiques du NLS bipartite de Rev du VIB. Le NoLS de Rev du VIB est aussi unique et diffère de la séquence consensus rapportée pour d'autres protéines virales et/ou cellulaires, toute nature confondue. Pour l'importation au noyau, nous avons démontré que la protéine Rev du VIB est importée par la voie classique (importines α:β) et que les importines α3 et α5 sont impliquées, fait qui contraste avec l'importation au noyau de la protéine Rev du VIH-1. Nous avons aussi caractérisé le domaine d'exportation ou NES de Rev du VIB en déterminant que le mécanisme d'exportation était CRM1-dépendant de façon similaire que la proteine Rev du VIH-1. Nous avons aussi identifié les résidus qui composent le NES de la protéine Rev du VIB qui appartient au groupe de PKI NES et non à celui de Rev VIH-1 NES, ce qui constitue une première chez les lentivirus. Pour compléter la caractérisation des domaines fonctionnels de la protéine Rev du VIB, les domaines de multimérisation et de liaison à l'ARN furent identifiés. Nous avons observé que Rev du VIB était capable de multimériser in vitro et in vivo dans le cytoplasme et deux régions impliquées dans cette fonction ont été identifiées. En plus, nous avons cartographié un domaine RBD bipartite chez Rev du VIB. Nous avons montré que le premier motif du RBD était situé dans la région centrale de la protéine et chevauchait le NoLS et le NLS bipartite alors que le deuxième motif était situé à l'extrémité C-terminale de la protéine Rev du VIB. En conclusion, les principaux domaines fonctionnels de la protéine Rev du VIB ont été caractérisés. Les résultats obtenus ont clairement démontré que la protéine Rev du VIB est unique chez les lentivirus et les rétrovirus. Les caractéristiques de la protéine Rev du VIB pourraient aider à expliquer en partie les profondes différences de pathogénicité observées chez les lentivirus. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : VIB, Rev, NLS, NES, VIH

Chez le poulet, le déterminisme du sexe est génétique (ZZ/ZW) mais à la différence des mammifères le déterminant majeur du sexe n’a pas été identifié. Néanmoins, un certain nombre d’acteurs moléculaires impliqués en aval dans la différenciation du testicule (DMRT1, AMH, SOX9…) ou de l’ovaire (CYP19A1, FOXL2, RSPO1…) ont été identifiés. D’autre part, le modèle poulet présente deux particularités que sont l’asymétrie du développement ovarien et la sensibilité aux stéroïdes donnant la possibilité d’inversions du sexe par des hormones exogènes. Par une analyse par PCR en temps réel à moyen débit, nous avons identifié des gènes dont l’expression est sexuellement dimorphique et/ou asymétrique au cours de la différenciation gonadique. Parmi ces gènes plusieurs membres de la famille des bone morphogenetic protein sont préférentiellement exprimés dans l’ovaire en comparaison au testicule. L’étude des effets de BMP4 sur la culture organotypique d’ovaires ou de testicules a montré qu’il était un inhibiteur de la stéroïdogénèse basale et induite par la FSH et d’autre part qu’il est un inhibiteur de l’expression de l’AMH. Résultats qui nous ont amené à émettre l’hypothèse que BMP4 était un facteur « anti-testiculaire ». / In chicken, sex is determined by a ZZ/ZW sex chromosome system, where the female is heterogametic (ZW). However, the mechanism involved in the sex determination is still unknown. Several genes involved in testicular (DMRT1, AMH, SOX9…) or in ovarian (CYP19A1, FOXL2, RSPO1...) differentiation have been identified. Furthermore, gonadal development in chicken embryos presents two particularities which are the asymmetrical ovarian development and the sensitivity to exogenous hormones leading to sex reversal. By real-time PCR analysis, we have identified several genes whose expression is sexually dimorphic and/or asymmetric. In particularly, we showed that several members of bone morphogenetic protein family are preferentially expressed in the ovary compared to the testis. Using organotypic culture of embryonic ovaries and testes, we showed that BMP4 inhibits the basal and FSH induced steroidogenesis and is an inhibitor of AMH mRNA expression. These findings lead us to propose that BMP4 is an “anti-testicular” factor.

Cette thèse porte sur le développement d’une plateforme microfluidique polyvalente pour la cristallisation des protéines alliant études statistiques, économie de matière, rapidité d’exécution et facilité d’utilisation. L’objectif est de développer un outil unique pour répondre aux différentes problématiques de la cristallisation des protéines : identification d’une condition de cristallisation robuste via le criblage et l’optimisation et co-cristallisation d’une protéine et de ligands pour le structure-based drug design. Une méthode microfluidique versatile à base de gouttes sans tensioactif est utilisée. Elle permet la génération de centaines voire milliers de gouttes de quelques nL dans lesquelles la cristallisation peut avoir lieu indépendamment. La composition des gouttes est contrôlée par les débits des différentes solutions et vérifiée en ligne par spectrométrie UV-vis. De nombreuses conditions de cristallisation différentes peuvent ainsi être testées rapidement : nature et concentration de(s) agent(s) de cristallisation, ajout d’un ligand... Les cristaux obtenus à l’aide de cette plateforme sont caractérisés in situ et ex situ par DRX.Cette plateforme est appliquée à la cristallisation de deux protéines, une protéine modèle, le lysozyme, et une protéine d’intérêt pharmaceutique, la quinone réductase 2. Ainsi, nous avons développé un outil adapté aux contraintes de l’industrie pharmaceutique pouvant être transféré dans un laboratoire de recherche pour une utilisation de routine par des non-spécialistes de la microfluidique. La plateforme permet une approche de criblage à haut débit (HTS) et tend vers l’automatisation à la fois du criblage et de la DRX. / The aim of this work is the development of a versatile microfluidique platform for protein crystallization, combining statistical studies, material saving, speed of execution and ease of use. The aim is to develop a unique tool to address the different issues of proteins crystallization: identification of a robust crystallization condition via screening and optimization, and co-crystallization of a protein with ligands for structure-based drug design. For this purpose, a versatile droplet-based microfluidic method without adding any surfactant is used. It allows the generation of hundreds or even thousands of droplets of a few nanoliters in which the crystallization takes place independently. Droplets composition is controlled by the flow rates of the different solutions using programmable syringe pumps and checked on-line by UV-visible spectroscopy. Many different crystallization conditions can thus be tested quickly: nature and concentration of crystallization agent(s), addition of a ligand, etc. In addition, the crystals obtained using this microfluidic platform are characterized in situ and ex situ by X-ray diffraction.The platform is applied to the crystallization of two proteins, first a model protein, lysozyme, and then a protein of pharmaceutical interest, quinone reductase 2. Thus we have developed a tool suitable to constraints of pharmaceutical industry, in order to be transferred to research laboratories for routine use by non-specialists of microfluidics. This platform permits a high throughput screening approach, or HTS, and tends to the automation of both screening and X-ray diffraction.

Les anomalies congénitales de la glycosylation (CDG) sont des maladies génétiques rares caractérisées par une glycosylation aberrante des protéines. Récemment, un sous-groupe de CDG dues à des perturbations de l'homéostasie de l’appareil de Golgi a fait son apparition. En 2012, notre équipe a identifié TMEM165 comme étant une protéine golgienne impliquée dans les CDG, mais dont les fonctions biologiques et cellulaires demeurent inconnues. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que l'homéostasie golgienne du Mn2+ était altérée en absence de TMEM165. Alors que de forts défauts de glycosylation, en particulier des défauts de galactosylation, ont été observés dans des cellules déficientes en TMEM165, nous avons découvert que la supplémentation en Mn2+ était suffisante pour rétablir une glycosylation normale. De façon intéressante, nous avons également démontré que ce défaut de glycosylation pouvait également être supprimé par une supplémentation en galactose. Fort de cette observation, la supplémentation orale en galactose a été testée chez des patients déficients en TMEM165 et il a été prouvé que ce traitement améliorait significativement les paramètres biochimiques et cliniques. De plus, nous avons mis en évidence que la stabilité de TMEM165 était altérée en présence d'une concentration élevée de Mn2+. En effet, nous avons montré que l'exposition à des concentrations élevées de Mn2+ entraînait une dégradation lysosomale rapide de TMEM165. Dans l'ensemble, notre étude montre que TMEM165 est (i) un acteur clé de la glycosylation golgienne en régulant finement l'homéostasie du Mn2+ et (ii) une nouvelle protéine de l’appareil de Golgi sensible au manganèse. / Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) are severe inherited diseases in which aberrant protein glycosylation is a hallmark. From this genetically and clinically heterogeneous group, a significant subgroup due to Golgi homeostasis defects is emerging. Our team previously identified TMEM165 as a Golgi protein involved in CDG. But despite strong efforts, the biological and cellular functions of TMEM165 were not known so far. During my thesis, we highlighted that Golgi Mn2+ homeostasis was impaired due to TMEM165 deficiency. While strong glycosylation defects, especially galactosylation defects, were observed in TMEM165 depleted cells, we discovered that Mn2+ supplementation was sufficient to fully restore a normal glycosylation. Interestingly, we also demonstrated that the observed glycosylation defects in mammalian cells could be overcome by galactose supplementation. Strong of this observation, oral galactose supplementation in TMEM165 deficient patients was assayed and this treatment was proven to significantly improve biochemical and clinical parameters. Moreover, we highlighted TMEM165 as a novel Golgi protein whose stability is altered in the presence of high manganese concentration. Indeed, we showed that exposure to high Mn2+ concentrations led to a rapid lysosomal degradation of TMEM165. Altogether, our study points TMEM165 as (i) a key player in Golgi glycosylation by finely regulating Golgi Mn2+ homeostasis and (ii) a novel Golgi protein sensitive to manganese.

La pathologie Tau est une lésion commune à plus d’une vingtaine de maladies neurodégénératives, regroupées sous le terme de Tauopathies. Elle correspond à l’accumulation intracellulaire de matériel fibrillaire constitué de protéines Tau hyper- et anormalement phosphorylées. Dans la maladie d’Alzheimer (MA), démence la plus courante chez la personne âgée, la progression et la distribution topographique de ces agrégats évoluent au cours du temps et sont corrélés aux déficits cognitifs observés. A ce jour, les traitements sont principalement symptomatiques. Cependant, plusieurs stratégies thérapeutiques sont étudiées parmi lesquelles l’immunothérapie. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif d’étudier les effets de l’immunothérapie Tau, active et passive, dans un modèle transgénique murin mimant la pathologie Tau de type Alzheimer. Les souris THY-Tau22, surexpriment une isoforme de Tau humaine mutée sur deux sites et sous contrôle d’un promoteur neuronal. Ce modèle présente dès l’âge de trois mois des altérations progressives de l’apprentissage et de la mémoire en parallèle d’une accumulation de protéine Tau principalement au niveau hippocampique, sans perte neuronale majeure, ce qui lui confère les caractéristiques d’un stade précoce de MA. Au sein du modèle THY-Tau22, on retrouve la protéine Tau phosphorylée en Ser422, un épitope particulièrement pertinent pour l’immunothérapie. En effet, la pSer422 est un épitope de phosphorylation anormale unique, présent dans la plupart des Tauopathies. Dans ces travaux de thèse, nous montrons que la vaccination précoce contre la Ser422 phosphorylée de la protéine Tau peut prévenir l'altération de mémoire spatiale mesurée par le test du labyrinthe en Y. Cette diminution de l'atteinte cognitive est associée à une diminution de la phosphorylation anormale de Tau au niveau de l'hippocampe et à une réduction significative des espèces insolubles de Tau. Les résultats de cette vaccination nous ont amenés à générer un anticorps monoclonal dirigé contre la pSer422 (2H9) afin d’évaluer les effets de l’immunothérapie passive. Selon la même cinétique d’âge, nous avons injecté, chaque semaine, par voie intrapéritonéale, des souris THY-Tau22 avec 5mg/kg et 10mg/kg de 2H9 ou une solution saline. Cette approche prévient l’apparition de déficits de mémoire spatiale mesurée par les tests du labyrinthe en Y et de la piscine de Morris. Les analyses immunohistochimiques révèlent également une réduction des protéines Tau anormalement phosphorylées au niveau de l’hippocampe. Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents à l’immunothérapie anti Tau, nous avons injecté des anticorps anti-phosphoTau par stéréotaxie au niveau de l’hippocampe de souris THY-Tau22. Nous montrons, qu’une fois au sein du cerveau, ils sont capables d’entrer dans les neurones contrairement au contrôle isotypique. Plusieurs études récentes d’immunothérapie, suggèrent une implication de la macroautophagie dans la dégradation médiée par les anticorps. Nous montrons que les anticorps internalisés dans les neurones colocalisent avec différents marqueurs de la voie lysosomiale (NPC1, Lamp2) confirmant l’hypothèse d’une dégradation par le lysosome. Cependant, la barrière hémato encéphalique étant très sélective, il est fort probable que les anticorps générés restent en périphérie. [...] / Tau pathology is a common lesion observed in more than twenty neurological disorders, refered to as Tauopathies. It corresponds to the aggregation of the microtubule associated protein Tau hyper and abnormally phosphorylated into neurofibrillary tangles. In Alzheimer's disease (AD), the most common age-related dementia, the distribution and progression of Tau pathology have been reported to be well-correlated to the cognitive decline. Currently, treatments remain essentially symptomatic. However, several therapeutic approaches, including immunotherapy, are being developed to treat Tau pathology. The work presented in this thesis aim to investigate the effects of both active and passive Tau immunotherapy in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease-like Tau pathology. THY-Tau22 mice overexpress a double-mutated isoform of the human Tau protein, whose expression is under the control of a neuronal promoter. Several lines of evidence suggest that this transgenic mouse model is reproducing early stages of AD. Indeed, at three month old, the THY-Tau22 mouse model presents a progressive impairment of learning and memory without major neuronal loss, in parallel to Tau accumulation in the hippocampus. Moreover, Tau is hyper and abnormally phosphorylated at different sites including Ser422. Noteworthy, the pSer422 epitope is a single abnormal site of phosphorylation present only in pathological conditions, rendering it of particular interest for immunotherapy. In this present thesis work, we showed that early vaccination against the phosphorylated Ser422 Tau protein reduced spatial memory impairment as measured by the Y-maze test. Interestingly, this is associated with the decrease of the abnormal phosphorylation of Tau in the hippocampus and with a significant reduction of insoluble Tau species. Based on these results, we generated a new monoclonal antibody raised against pSer422 (2H9) to evaluate the effects of passive immunotherapy. The antibody was injected every week, intraperitoneally (5mg/kg and 10mg/kg of 2H9 or saline buffer) in the THY-Tau22 mice. We show that this approach can prevent the appearance of spatial memory deficits as measured by the Y maze and the Morris water maze tests. Immunohistochemical analysis also revealed a reduction of abnormally phosphorylated Tau proteins in the hippocampus. To investigate the mechanisms underlying Tau immunotherapy, we performed stereotaxic injections of anti-phosphoTau antibodies in the hippocampus of THY-Tau22 mice. We showed that, once in the brain, anti-phosphoTau antibodies were located inside the neurons in contrast to the isotype control. Several recent studies of immunotherapy, suggest an involvement of macroautophagy in the antibody-mediated degradation. We showed that internalized antibodies colocalized with different markers of the lysosomal pathway (NPC1, Lamp2) confirming this hypothesis of a lysosomal-mediated degradation. However, since the blood-brain barrier is highly selective, the antibodies may more likely act in the periphery. Indeed, we showed that peripheral administration of 250μg of the 2H9 generates a significant increase of Tau proteins levels in plasma, suggesting a peripheral sink mechanism as for Aβ immunotherapy. Vaccination, which generates a polyclonal response, leads to a greater increase of plasmatic Tau that confirms the peripheral degradation of Tau. Overall, the results of this PhD work confirmed the promising potential of Tau immunotherapy for Alzheimer\\\\\\\'s disease and other Tauopathies treatment. Moreover, it address a new hypothesis suggesting that the antibodies mediated degradation of Tau proteins might be through a peripheral sink such as for Aβ.

Le PtdIns5P est un phosphoinositide très peu connu et émerge dernièrement en tant qu’important nouveau second messager. D’ailleurs, l’augmentation artificielle de PtdIns5Pdans les cellules épithéliales, favorise la voie pro-oncogénique Phosphoinositide 3-kinase/AKT. Plus récemment, il a été fait état d’un possible rôle du PtdIns5P dans le processus de lymphomagenèse.Notre laboratoire étudie depuis de nombreuses années les voies de signalisations importantes de l’activation lymphocytaire T et notamment la voie pro-oncogénique PI3K. Le laboratoire s’est tourné notamment vers l’étude des protéines adaptatrices de la famille Dok(Downstream of Kinase) lors de l’activation lymphocytaire T.Ainsi le but de ce travail a été dans un premier temps l’étude des protéines adaptatrices Dok-1 et Dok-2 durant l’activation lymphocytaire T. Plus précisément, nous nous sommes focalisés sur le rôle de leur domaine pleckstrin homology (PH) dans leur fonction inhibitrice durant l’activation lymphocytaire T. De manière intéressante nous avons pu caractériser lePtdIns5P comme un ligand convaincant des domaines PH de Dok-1 et Dok-2 et engendrant leur phosphorylation et donc leur activation. Des dosages de PtdIns5P effectués après une stimulation du récepteur des cellules T (TCR) nous ont permis d’observer une augmentation de PtdIns5P suite à cette activation lymphocytaire T.Dans un second temps nous nous sommes intéressés à caractériser les autres ligands des domaines PH de la famille Dok. De manière intéressante nous avons pu identifier le domaine PH de Dok-5 comme un interacteur fort avec le PtdIns5P. La caractérisation plus précise de l’impact du PtdIns5P, nous a permis de montrer la modulation positive de protéines clés des voies de signalisation intracellulaire telles que les Src kinases et AKT qui sont retrouvées phosphorylées suite à une augmentation de PtdIns5P.L’ensemble de ces résultats faisant du PtdIns5P un nouveau messager de l’activation lymphocytaire T, pouvant contribuer au maintien de l’homéostasie des lymphocytes T / PtdIns5P is a rare phosphoinositide and is starting to emerge as a potential second messenger.Bacterial infection by Shigella flexnerii via the virulence factor IpgD, generates PtdIns5P in thehost cells and induces Akt activation. Recent evidences report that enhanced tyrosinephosphorylation increase cellular PtdIns5P levels and that PtdIns5P could have a role inoncogenesis. Altogether, these data argue for an important role of PtdIns5P in cell signalling.Recently, we demonstrated a PtdIns5P production in T cells upon TCR triggering.Interestingly we showed that Dok-1 and Dok-2 proteins (for Downstream of tyrosine kinase)tyrosine phosphorylation correlated with PtdIns5P increase. These structurally related adaptermolecules contain a pleckstrin homology (PH) domain generally acting as a lipid/proteininteractingmodule. We found that Dok-1/Dok-2 PH domains bind in vitro to PtdIns5P. Thepresence of this PH domain is necessary for the tyrosine phosphorylation of Dok-1 and Dok-2proteins and their negative functions in T cells. Together, our data identify a novel lipid mediatorin T cell signalling and suggest that PtdIns5P could be a new yet uncharacterized secondmessenger in T cell activation.We next focused on a new PtdIns5P binding module, the PH domain Dok-5. Our in vitrodata revealed a stronger interaction between Dok-5 PH and PtdIns5P. We used Dok-5 PHdomain and IpgD as tools to characterize PtdIns5P functional effects on T cells. Our results showthat IpgD expression induces Src-kinase and Akt activation, but not ERK activation andenhances IL-2 promoter activity in T cells. Expression of this PtdIns5P interacting domainblocks IpgD-induced T cell activation and selective signaling molecules downstream of TCRtriggering. Altogether, these data suggest that PtdIns5P may play a sensor function in setting thethreshold of T cell activation and contributing to maintain T cell homeostasis

La protéine découplante aviaire (avUCP), majoritairement exprimée dans le muscle, pourrait être impliquée dans le transport de substrats énergétiques, la limitation de la production de radicaux libres et/ou la thermogenèse sans frisson. La stimulation in vivo chez le poulet du système ß-adrénergique par l’isoprotérénol augmente l’expression d’avUCP. Cette régulation pourrait faire intervenir la voie de signalisation post-ß2-adrénorécepteur des cellules musculaires, mais aussi des modifications du statut thyroïdien, des métabolismes du glucose et des acides gras. Sur myoblastes de poussin en culture primaire, nous mettons en évidence l’implication de l’AMPK et du facteur de transcription PPARa dans la régulation de l’expression d’avUCP, qui est modulée par l’isoprotérénol et les acides gras. L’expression d’avUCP diffère en fonction du type contractile et métabolique de muscle, ce qui pourrait être lié à un rôle dans l’utilisation des substrats énergétiques par le muscle. / Avian uncoupling protein (avUCP), mainly expressed in muscle, could be involved in energy substrates transport, limitation of reactive oxygen species production and/or non-shivering thermogenesis. The in vivo stimulation of the ß-adrenergic system by isoproterenol increased avUCP expression in chicken. This regulation may involve the post-ß2-adrenoreceptor signaling pathway in muscle cells, but also modulations of thyroid status, glucose and fatty acid metabolisms. By using primary culture of chick myoblasts, we showed the involvement of AMPK and of the transcription factor PPARa in the regulation of avUCP expression, that was controlled by isoproterenol and fatty acids. AvUCP expression depended on the contractile and the metabolic types of chicken muscles, which could be related to a role of avUCP in the regulation of fuel substrate utilisation in chicken muscles.