La sclérose systémique est une maladie du tissu conjonctif qui se caractérise essentiellement par une fibrose progressive de la peau et des organes internes. Les mécanismes impliqués dans le processus fibrotique sont très peu connus, cependant plusieurs études suggèrent le rôle des cytokines et des facteurs de croissance, plus particulièrement le TGF-P, dans celui-ci. L'objectif de ce projet était d'étudier les mécanismes fibrotiques impliqués dans la sclérodermie ainsi que le rôle du TGF-P dans l'apparition de la fibrose, et ce, grâce à un modèle de peau reconstruite par génie tissulaire. Les résultats obtenus ont montré que la fibrose, à un stade précoce de la maladie était induite par un facteur exogène, possiblement le TGF-P, qui stimulerait la synthèse de la matrice extracellulaire. A un stade tardif, celle-ci serait indépendante de tous stimuli. De plus, la fibrose serait le résultat du déséquilibre dans la synthèse et la dégradation de la matrice extracellulaire ainsi que la prolifération et la mort cellulaire des cellules dermiques. Ces données ont permis d'avancer dans la compréhension de cette pathologie incurable.

Les cas d'infections à Streptococcus suis sont très répandus dans tous les pays producteurs de porcs. Cet organisme est également reconnu comme un agent de zoonose pour les personnes en contact étroit avec les porcs ou leurs produits dérivés. De nombreux rapports indiquent que depuis le début des années soixante-dix, le nombre de cas d'infections ainsi que la gravité des infections à S. suis ont considérablement augmenté. Un temps d'incubation plus court, une progression plus rapide de la maladie, un taux plus élevé de mortalité soulignent la nécessité urgente de mieux comprendre les facteurs associés à la pathogenèse de l'infection par S. suis. Des 35 serotypes décrits, le serotype 2 demeure le plus fréquemment associé à un phénomène de septicémie et à des cas de maladies telles que les méningites, endocardites et pneumonies. C'est également le serotype le plus souvent retrouvé chez l'humain et le porc. La pathogenèse de l'infection causée par S. suis est encore relativement mal connue. La présence d'une capsule riche en acide sialique est classiquement considérée comme un facteur de virulence essentiel, mais récemment d'autres facteurs ont également été cités. Cette étude avait pour but d'identifier et de caractériser de nouveaux déterminants de virulence chez S. suis. Dans un premier temps, la capacité de S. suis à former un biofilm a été étudiée. Il a été démontré que la présence de fibrinogène pouvait induire la formation d'un biofilm chez S. suis. Un mutant déficient pour l'expression de la capsule de même que des souches non-sérotypables de S. suis dépourvues de capsule ont montré une capacité de former un biofilm sans apport de fibrinogène. Il a été suggéré que la capsule chez S. suis pourait cacher des adhésines de surface et ainsi interférer avec la formation du biofilm et les capacités d'adhésion. Dans un second temps, l'utilisation d'un mutant de S. suis déficient pour une pseudo-subtilisine a permis de démontrer le rôle critique de cette protease pour le développement d'une infection dans un modèle de souris. La pseudo-subtilisine de S. suis a été clonée, purifiée et caractérisée. Certaines protéines de l'hôte comme le fibrinogène se sont révélées susceptibles à la protease. Une stimulation de macrophages par la pseudo-subtilisine recombinante a induit à une forte sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Lors d'infections expérimentales à S. suis chez le porc, les animaux ont développé des anticorps dirigés contre la pseudo-subtilisine, suggérant ainsi que cette protease représente un immunogène d'intérêt pour la vaccination. Enfin, un nouveau modèle pour l'analyse de la virulence de S. suis a été mis au point utilisant l'amibe Dictyostelium discoideum. Ce modèle a mis en évidence des différences majeures entre des souches sauvages virulentes de S. suis et des mutants ayant une virulence atténuée dans des modèles animaux classiques. En conclusion, ce projet a permis d'améliorer nos connaissances des mécanismes étiopathogéniques des infections à S. suis et a ouvert de nouvelles perspectives de prévention et traitement de ces infections.

Des effets centraux des peptides gastro-intestinaux (PG) sur la régulation de la prise alimentaire ont été repportés. Par contre, leurs effets périphériques, spécifiquement sur le tissu adipeux, ne sont pas bien connus. L'objectif principal des cinq études présentées dans cette thèse était d'investiguer l’impact de sept PG sur la modulation de la masse du tissu adipeux. Dans la première étude, j’ai montré que la ghréline désacylée, l’obestatine et la ghréline acylée affectent de façons variables la physiologie des cellules 3T3-L1, que seule la ghréline désacylée (DAG) stimule à la fois la prolifération, l’adipogénèse et la lipogénèse. J’ai suggéré que la DAG agit via une voie de signalisation impliquant GHSR-1/PLC/PI3K. Dans une deuxième étude, j’ai démontré que la motiline stimule la synthèse des triacylglycérols et l’ARNm de PPARγ2, C/EBPα, CD36, FABP4 et DGAT1 dans les adipocytes. L'inhibition du récepteur de la motiline réduit ses effets sur le captage d’acide gras dans les adipocytes 3T3-L1. Dans une troisième étude, j’ai identifié pour la première fois la présence du récepteur de la sécrétine sur les cellules 3T3-L1 et adipocytes primaires. J’ai aussi démontré que la sécrétine stimule à la fois la lipogénèse et la lipolyse dans les adipocytes matures. Dans la quatrième étude, j’ai déterminé que la substance P inhibe le captage des acides gras, réprime l’ARNm de IRS-1, GLU4, PPARγ2, C/EBPα, FABP4 et DGAT1 et stimule la sécrétion des adipocytokines pro-inflammatoires par des adipocytes matures. Dans une cinquième étude, j’ai démontré qu’en plus de stimuler la prolifération des préadipocytes et l’adipogénèse, l’amyline possède un effet additif à l’insuline sur le captage d’acide gras. Pris ensemble, ces cinq études démontrent une importante contribution des PG dans la pathogénèse de l’obésité et permet de mettre en évidence les effets directs des PG sur la modulation de la masse du tissu adipeux. / While central effects of gastrointestinal peptides (GP) on the regulation of food intake have been described, their peripheral effects, specifically on fat tissue are not well known. The aim of the five studies presented in this thesis was to investigate the impact of seven GP on the modulation of adipose tissue. In the first study, I showed that desacyl ghrelin, obestatin and acyl ghrelin variably affect 3T3-L1 cells. Only desacyl ghrelin (DAG) stimulates proliferation, adipogenesis and lipogenesis. I demonstrated that the DAG-signalling pathway implicates GHSR-1/PLC/PI3K. In a second study, I showed that motilin stimulated triglyceride synthesis, stimulated fatty acid uptake and up-regulated mRNA of PPARγ2, C/EBPα, CD36, FABP4 and DGAT1 in adipocytes. The inhibition of the motilin receptor significantly impaired motilin-stimulated fatty acid uptake in 3T3-L1 adipocytes. In a third study, I identified for the first time the presence of the secretin receptor in fat cells and showed that secretin stimulated both lipogenesis and lipolysis in mature adipocytes, enhancing substrate cycling. In a fourth study, I determined that substance P reduced fatty acid uptake, down regulated mRNA expression of IRS-1, GLU4, PPARγ2, C/EBPα, FABP4 and DGAT1, and stimulated pro-inflammatory adipocytokine secretion. Finally, in a fifth study I showed that, in addition to stimulating preadipocyte proliferation and adipogenesis, amylin has an additive effect to insulin on fatty acid uptake. Together, these studies show an important contribution of GP in the pathogenesis of obesity and highlight the direct effects of gastrointestinal peptide on modulation of adipose tissue.

L'arthrite rhumatoïde (RA), l'arthrite psoriasique (PsA) et le lupus érythémateux disséminé(SLE) sont trois maladies rhumatismales courantes avec des manifestations articulaires et cutanées. Les synoviocytes de type fibroblaste (FLSs) sont les principaux composants de la synoviale et contribuent directement à l'inflammation synoviale et à la destruction du cartilage. Une augmentation de la phospholipase A1 membre A (PLA1A) dans le sérum a été détectée chez des patients atteints de SLE et était liée à l'activité de la maladie. PLA1A hydrolyse spécifiquement l'acide gras sn-1 sur la phosphatidylsérine (PS) pour produire de la lysophosphatidylsérine, qui a de multiples effets immunomodulateurs. Normalement, la PLA1A sécrétée a une accessibilité limitée à son substrat. Lorsque les cellules subissent une apoptose ou une activation ou forment des microparticules (MPs), la PS peut être exposée sur le feuillet externe de la membrane plasmique des cellules ou des MPs. Les MPs sont des vésicules extracellulaires hétérogènes et peuvent fournir diverses cargaisons pour la communication intercellulaire locale ou longue distance au cours de l'inflammation. Dans la circulation et le liquide synovial des patients atteints de RA, une augmentation des MPs dérivées de cellules sanguines a été détectée, parmi lesquelles les MPs dérivées des plaquettes(PMPs) étaient les plus abondantes, suivi par les MPs de globules rouges (RMPs). Une étude précédente a également rapporté que les PMPs stimulaient le phénotype inflammatoire des FLSs. L'acide lysophosphatidique (LPA) est un médiateur lipidique bioactif qui peut être synthétisé par différentes voies nécessitant des phospholipases A1 ou A2 (PLA1/2) et l'autotaxine (ATX). L'axe de l'ATX-LPA récepteurs est étroitement lié à la pathogenèse de la RA en modifiant la motilité, la migration et la production de cytokines/chimiokines des synoviocytes. Cependant, le mécanisme par lequel la PLA1A et les MPs contribuent au développement des maladies rhumatismales n'est toujours pas bien compris. Dans cette thèse, nous avons exploré le rôle de la PLA1A et des MPs dans les processus de maladies rhumatismales en utilisant des FLSs humains primaires. Nos résultats ont mis en évidence que la PLA1A était élevée dans le plasma et les liquides synoviaux des patients arthritiques, et qu'il y avait une proportion accrue des RMPs et des PMPs PS positives dans le plasma des patients atteints de SLE et d'arthrite précoce. Nous avons découvert que l'incubation des MPs dérivés de cellules sanguines avec de l'ATX recombinant produisait des quantités considérables de LPA, y compris des espèces saturées et insaturées. La PLA1A recombinante pourrait hydrolyser la PS exposée à la surface des FLSs activés ou des MPs, stimulant la sécrétion d'IL-8 par les FLSs via l'axe ATX-LPA récepteur. Ensuite, nous avons exploré l'impact de PLA1A dans la pathogenèse de l'arthrite psoriasique induite en utilisant des souris Pla1a[exposant -/-]. Nous avons découvert que le déficit en PLA1A réduisait la susceptibilité à l'inflammation articulaire et cutanée induite dans le modèle murin. Les symptômes réduits étaient associés au niveau inférieur de cytokines/chimiokines pro-inflammatoires dans les tissus synoviaux, tels que l'IL-17. Le déficit en PLA1A a peut-être modifié l'activation et la polarisation des lymphocytes qui produisent IL-17. Les travaux présentés dans cette thèse ont défini les implications de la PLA1A et des MPs dérivées des cellules sanguines dans le processus inflammatoire in vitro et in vivo des maladies rhumatismales. Il a également souligné que la PLA1A pourrait être utilisée comme biomarqueur potentiel pour surveiller l'activité des maladies rhumatismales et même cible potentiel pour le traitement de l'arthrite psoriasique. / Rheumatoid arthritis (RA), psoriatic arthritis (PsA), and systemic lupus erythematosus (SLE) are three common rheumatic diseases with articular and cutaneous manifestations. Fibroblast-like synoviocytes (FLSs) are the primary components of the synovium and contribute directly to synovial inflammation and cartilage destruction. Elevated serum phospholipase A1 member A (PLA1A) was reported in SLE patients and was related to disease activity. PLA1A specifically hydrolyzes the sn-1 fatty acid on phosphatidylserine(PS) to produce lysophosphatidylserine, which has multi-immunomodulatory effects. Normally, secreted PLA1A has limited access to its substrate. When cells undergo apoptosis, activation or form microparticles (MPs), the outer leaflet of the plasma membrane of cells or MPs can expose PS. MPs are heterogeneous extracellular vesicles and can supply various cargos for local or long-distance intercellular communication during inflammation. In circulation and synovial fluid from RA patients, increased MPs derived from various cells were detected, among which the platelet-derived MPs (PMPs) were the most abundant and followed by the red blood cell (RBC)-derived MPs (RMPs). A previous study also reported that PMPs stimulated the inflammatory phenotype of FLSs. Extracellular lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid mediator which can be synthesized through different pathways requiring PLA1/2 and autotaxin (ATX). The ATX-LPA receptor axis is closely related to RA pathogenesis by modifying synoviocytes motility and migration and stimulating cytokine/chemokine production. However, the underlying mechanism by which PLA1A and MPs contribute to the development of rheumatic disease is still not well understood. In this thesis, we explored the pro-inflammatory effects of PLA1A and MPs in rheumatic disease processes using primary human FLSs. Our results highlighted a high PLA1A level in the plasma and synovial fluids from rheumatoid arthritis patients, and there was an increased proportion of PS-positive RMPs and PMPs in the plasma from SLE and RA patients. We found that incubation of blood cell-derived MPs with recombinant ATX produced considerable amounts of LPA, including saturated and unsaturated species. Recombinant PLA1A could hydrolyze the PS surface exposed by activated FLSs or MPs, stimulating the secretion of IL-8 by FLSs through the ATX-LPA receptor axis. Then we explored the impact of PLA1A in the pathogenesis of induced psoriatic arthritis using Pla1a[superscript -/-] mice. We found out that PLA1A deficiency reduced the susceptibility to induced articular and cutaneous inflammation in the murine model. The reduced symptoms were associated with a low pro-inflammatory cytokine/chemokine level, including IL-17, in synovial tissues. PLA1A deficiency possibly impacts lymphocyte activation and polarization of the lymphocytes that produce IL-17. The work presented in this thesis defined the involvements of PLA1A and blood cell-derived MPs in in vitro and in vivo inflammatory processes of rheumatic diseases. It also highlighted that PLA1A could be used as a potential biomarker for monitoring rheumatic disease activity and even a putative target for psoriatic arthritis treatments.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles

La sténose aortique est la maladie cardiovasculaire la plus fréquente dans les pays industrialisés après la maladie coronarienne et l’hypertension artérielle. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement médical efficace pour réduire sa progression et ses effets néfastes sur le remodelage et la fonction ventriculaire gauche. Le remplacement valvulaire aortique est le seul traitement efficace de la sténose aortique sévère symptomatique. Afin de développer des approches pharmacologiques efficaces pour réduire la progression de la maladie, il est primordial d’élucider les facteurs et les mécanismes qui sont impliqués dans sa pathogénèse. La sténose aortique, qui se caractérise par un dépôt progressif de calcium au niveau des feuillets et de l’anneau de la valve aortique, a longtemps été considérée comme une maladie dégénérative. Cependant, de récentes études ont suggéré que la sténose aortique était un processus actif vraisemblablement lié à l’athérosclérose. La sténose aortique apparait comme une pathologie complexe faisant intervenir différents processus liés à l’obésité viscérale et au syndrome métabolique, mais aussi à la dérégulation du métabolisme phospho-calcique. De plus, ces processus impliqués au niveau valvulaire peuvent aussi intervenir au niveau de l’aorte et du ventricule gauche. L’évaluation des mécanismes physiopathologiques impliqués à la fois au niveau de la valve, de l’aorte et du ventricule, ainsi que leurs interactions, permettrait de mieux connaitre et comprendre la pathologie valvulaire calcifiante et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette population. L’objectif général de mon projet de doctorat est d’identifier et de déterminer l’impact respectif des différents facteurs métaboliques liés à l’obésité viscérale sur la progression de la sténose aortique, et du remodelage et de la dysfonction ventriculaire gauche. / Aortic stenosis is the most common cardiovascular disease in developed countries after coronary artery disease and systemic arterial hypertension. Unfortunately, no medical therapies have been proven to decrease either the progression of valve stenosis or the resulting adverse effects on myocardial remodeling or function. Surgical aortic valve replacement is currently the sole option for the treatment of severe symptomatic aortic stenosis. To develop efficient pharmacological approaches to slow the progression of aortic stenosis, it is crucial to elucidate the factors and mechanisms that are involved in the pathogenesis of this disease. Aortic stenosis, which is characterized by a progressive calcium deposition in aortic valve leaflets and annulus, has long been considered as a degenerative disease. However, recent studies have suggested that aortic stenosis was an active process likely related to atherosclerosis. Aortic stenosis appears as a complex disease involving several processes related to visceral obesity and metabolic syndrome, as well as deregulation of the phosphor-calcic metabolism. Furthermore, these processes involved at the valvular level appear to be also implicated at the level of the aorta and the left ventricle. Assessment of the pathophysiological mechanisms involded both at the valve, aorta and ventricle, as well as their interactions, would better know and understand calcific valvular disease and identify new therapeutic targets in this population. The general objective of my PhD project is to identify and determine the respective impact of different metabolic factors related to visceral obesity on the progression of the valve stenosis, as well as left ventricular remodeling and dysfunction.

L'arthrite rhumatoïde (RA), l'arthrite psoriasique (PsA) et le lupus érythémateux disséminé(SLE) sont trois maladies rhumatismales courantes avec des manifestations articulaires et cutanées. Les synoviocytes de type fibroblaste (FLSs) sont les principaux composants de la synoviale et contribuent directement à l'inflammation synoviale et à la destruction du cartilage. Une augmentation de la phospholipase A1 membre A (PLA1A) dans le sérum a été détectée chez des patients atteints de SLE et était liée à l'activité de la maladie. PLA1A hydrolyse spécifiquement l'acide gras sn-1 sur la phosphatidylsérine (PS) pour produire de la lysophosphatidylsérine, qui a de multiples effets immunomodulateurs. Normalement, la PLA1A sécrétée a une accessibilité limitée à son substrat. Lorsque les cellules subissent une apoptose ou une activation ou forment des microparticules (MPs), la PS peut être exposée sur le feuillet externe de la membrane plasmique des cellules ou des MPs. Les MPs sont des vésicules extracellulaires hétérogènes et peuvent fournir diverses cargaisons pour la communication intercellulaire locale ou longue distance au cours de l'inflammation. Dans la circulation et le liquide synovial des patients atteints de RA, une augmentation des MPs dérivées de cellules sanguines a été détectée, parmi lesquelles les MPs dérivées des plaquettes(PMPs) étaient les plus abondantes, suivi par les MPs de globules rouges (RMPs). Une étude précédente a également rapporté que les PMPs stimulaient le phénotype inflammatoire des FLSs. L'acide lysophosphatidique (LPA) est un médiateur lipidique bioactif qui peut être synthétisé par différentes voies nécessitant des phospholipases A1 ou A2 (PLA1/2) et l'autotaxine (ATX). L'axe de l'ATX-LPA récepteurs est étroitement lié à la pathogenèse de la RA en modifiant la motilité, la migration et la production de cytokines/chimiokines des synoviocytes. Cependant, le mécanisme par lequel la PLA1A et les MPs contribuent au développement des maladies rhumatismales n'est toujours pas bien compris. Dans cette thèse, nous avons exploré le rôle de la PLA1A et des MPs dans les processus de maladies rhumatismales en utilisant des FLSs humains primaires. Nos résultats ont mis en évidence que la PLA1A était élevée dans le plasma et les liquides synoviaux des patients arthritiques, et qu'il y avait une proportion accrue des RMPs et des PMPs PS positives dans le plasma des patients atteints de SLE et d'arthrite précoce. Nous avons découvert que l'incubation des MPs dérivés de cellules sanguines avec de l'ATX recombinant produisait des quantités considérables de LPA, y compris des espèces saturées et insaturées. La PLA1A recombinante pourrait hydrolyser la PS exposée à la surface des FLSs activés ou des MPs, stimulant la sécrétion d'IL-8 par les FLSs via l'axe ATX-LPA récepteur. Ensuite, nous avons exploré l'impact de PLA1A dans la pathogenèse de l'arthrite psoriasique induite en utilisant des souris Pla1a[exposant -/-]. Nous avons découvert que le déficit en PLA1A réduisait la susceptibilité à l'inflammation articulaire et cutanée induite dans le modèle murin. Les symptômes réduits étaient associés au niveau inférieur de cytokines/chimiokines pro-inflammatoires dans les tissus synoviaux, tels que l'IL-17. Le déficit en PLA1A a peut-être modifié l'activation et la polarisation des lymphocytes qui produisent IL-17. Les travaux présentés dans cette thèse ont défini les implications de la PLA1A et des MPs dérivées des cellules sanguines dans le processus inflammatoire in vitro et in vivo des maladies rhumatismales. Il a également souligné que la PLA1A pourrait être utilisée comme biomarqueur potentiel pour surveiller l'activité des maladies rhumatismales et même cible potentiel pour le traitement de l'arthrite psoriasique. / Rheumatoid arthritis (RA), psoriatic arthritis (PsA), and systemic lupus erythematosus (SLE) are three common rheumatic diseases with articular and cutaneous manifestations. Fibroblast-like synoviocytes (FLSs) are the primary components of the synovium and contribute directly to synovial inflammation and cartilage destruction. Elevated serum phospholipase A1 member A (PLA1A) was reported in SLE patients and was related to disease activity. PLA1A specifically hydrolyzes the sn-1 fatty acid on phosphatidylserine(PS) to produce lysophosphatidylserine, which has multi-immunomodulatory effects. Normally, secreted PLA1A has limited access to its substrate. When cells undergo apoptosis, activation or form microparticles (MPs), the outer leaflet of the plasma membrane of cells or MPs can expose PS. MPs are heterogeneous extracellular vesicles and can supply various cargos for local or long-distance intercellular communication during inflammation. In circulation and synovial fluid from RA patients, increased MPs derived from various cells were detected, among which the platelet-derived MPs (PMPs) were the most abundant and followed by the red blood cell (RBC)-derived MPs (RMPs). A previous study also reported that PMPs stimulated the inflammatory phenotype of FLSs. Extracellular lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid mediator which can be synthesized through different pathways requiring PLA1/2 and autotaxin (ATX). The ATX-LPA receptor axis is closely related to RA pathogenesis by modifying synoviocytes motility and migration and stimulating cytokine/chemokine production. However, the underlying mechanism by which PLA1A and MPs contribute to the development of rheumatic disease is still not well understood. In this thesis, we explored the pro-inflammatory effects of PLA1A and MPs in rheumatic disease processes using primary human FLSs. Our results highlighted a high PLA1A level in the plasma and synovial fluids from rheumatoid arthritis patients, and there was an increased proportion of PS-positive RMPs and PMPs in the plasma from SLE and RA patients. We found that incubation of blood cell-derived MPs with recombinant ATX produced considerable amounts of LPA, including saturated and unsaturated species. Recombinant PLA1A could hydrolyze the PS surface exposed by activated FLSs or MPs, stimulating the secretion of IL-8 by FLSs through the ATX-LPA receptor axis. Then we explored the impact of PLA1A in the pathogenesis of induced psoriatic arthritis using Pla1a[superscript -/-] mice. We found out that PLA1A deficiency reduced the susceptibility to induced articular and cutaneous inflammation in the murine model. The reduced symptoms were associated with a low pro-inflammatory cytokine/chemokine level, including IL-17, in synovial tissues. PLA1A deficiency possibly impacts lymphocyte activation and polarization of the lymphocytes that produce IL-17. The work presented in this thesis defined the involvements of PLA1A and blood cell-derived MPs in in vitro and in vivo inflammatory processes of rheumatic diseases. It also highlighted that PLA1A could be used as a potential biomarker for monitoring rheumatic disease activity and even a putative target for psoriatic arthritis treatments.

Les lentivirus sont un groupe de virus appartenant à la famille des Retroviridae. Le modèle par excellence pour l'étude des lentivirus est le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) qui est l'agent causant le syndrome d'immunodéficience acquise ou SIDA. Les études réalisées sur les protéines du virus telles que Nef, Vpu, Tat et Rev ont permis de mieux connaître la biologie et les mécanismes de pathogenèse du VIH de type 1 (VIH-1). Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un lentivirus qui a servi de modèle d'étude de la protéine Tat du VIH. Bien que le VIH-1 et le VIB appartiennent aux lentivirus, les maladies qu'ils causent sont très différentes. Le potentiel pathogénique du VIB est controversé et les mécanismes pathogéniques et la biologie du VIB ne sont pas encore bien connus. Seule la protéine Tat a été bien caractérisée. L'étude approfondie des autres protéines virales nécessaires à la réplication du virus comme la protéine Rev permettront de donner des outils nécessaires à la compréhension de la biologie du VIB et des mécanismes impliqués dans la pathogenèse des lentivirus. La protéine Rev a une fonction essentielle dans la réplication des lentivirus. Le rôle de Rev est d'exporter les ARNs viraux non épissés et partiellement épissés du noyau au cytoplasme pour produire en outre les protéines nécessaires à l'assemblage des nouvelles particules virales. La protéine Rev du VIH-1 contient minimalement quatre domaines fonctionnels importants : un domaine basique riche en arginines nécessaire à la liaison de l'ARN ou RBD qui contient des signaux de localisation nucléaire et nucléolaire (NLS et NoLS), un domaine riche en leucines nécessaire à l'exportation du complexe Rev-ARN (NES) et deux régions nécessaires à la multimérisation de Rev. Le but de ce projet est de caractériser moléculairement et biologiquement la protéine Rev du VIB. Dans ces travaux, nous rapportons la caractérisation des NLS et NoLS de la protéine Rev du VIB. Grâce à la transfection d'une série de protéines mutantes de Rev du VIB fusionnées à la enhanced green fluorescent protein (EGFP). Nous avons démontré que le NLS de la protéine Rev du VIB est bipartite. Ce type de NLS est le premier à être identifié dans la famille des protéines Rev des lentivirus/rétrovirus. De plus, nous avons déterminé que le NoLS était localisé entre les deux motifs basiques du NLS bipartite de Rev du VIB. Le NoLS de Rev du VIB est aussi unique et diffère de la séquence consensus rapportée pour d'autres protéines virales et/ou cellulaires, toute nature confondue. Pour l'importation au noyau, nous avons démontré que la protéine Rev du VIB est importée par la voie classique (importines α:β) et que les importines α3 et α5 sont impliquées, fait qui contraste avec l'importation au noyau de la protéine Rev du VIH-1. Nous avons aussi caractérisé le domaine d'exportation ou NES de Rev du VIB en déterminant que le mécanisme d'exportation était CRM1-dépendant de façon similaire que la proteine Rev du VIH-1. Nous avons aussi identifié les résidus qui composent le NES de la protéine Rev du VIB qui appartient au groupe de PKI NES et non à celui de Rev VIH-1 NES, ce qui constitue une première chez les lentivirus. Pour compléter la caractérisation des domaines fonctionnels de la protéine Rev du VIB, les domaines de multimérisation et de liaison à l'ARN furent identifiés. Nous avons observé que Rev du VIB était capable de multimériser in vitro et in vivo dans le cytoplasme et deux régions impliquées dans cette fonction ont été identifiées. En plus, nous avons cartographié un domaine RBD bipartite chez Rev du VIB. Nous avons montré que le premier motif du RBD était situé dans la région centrale de la protéine et chevauchait le NoLS et le NLS bipartite alors que le deuxième motif était situé à l'extrémité C-terminale de la protéine Rev du VIB. En conclusion, les principaux domaines fonctionnels de la protéine Rev du VIB ont été caractérisés. Les résultats obtenus ont clairement démontré que la protéine Rev du VIB est unique chez les lentivirus et les rétrovirus. Les caractéristiques de la protéine Rev du VIB pourraient aider à expliquer en partie les profondes différences de pathogénicité observées chez les lentivirus. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : VIB, Rev, NLS, NES, VIH

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui cause la mort des neurones moteurs, induisant une paralysie progressive et menant à la mort quelques années après l'apparition des premiers symptômes. Comme dans toutes les maladies neurodégénératives, l'inflammation est une composante principale de la pathogénèse de la SLA. Une des cellules effectrices de cette inflammation, la cellule microgliale est le sujet central de cette thèse. Avec l'apparition des symptômes, la microglie passe d'un phénotype anti-inflammatoire et neuroprotecteur à un phénotype aberrant et neurotoxique. Il est nécessaire d'élucider les mécanismes cellulaires responsable du changement de phénotype et l'identification des facteurs maintenant ces phénotypes pour permettre le développement de thérapies efficaces ciblant l'inflammation. Ainsi dans cette thèse, nous tâchons d'identifier, en utilisant divers outils moléculaires et modèles animaux, la signature microgliale à différents stades de la SLA. Durant le stade présymptomatique, nous identifions, par l'étude du sécrétome microglial, la cytokine immunosuppressive interleukine-10 comme responsable du maintien du phénotype anti-inflammatoire. Cette cytokine est à la fois produite par les cellules microgliales et reconnue par celles-ci, grâce au récepteur IL-10R. Le blocage d'IL-10R a pour conséquence d'accélérer la progression de la maladie et de diminuer la survie dans un modèle murin. Aussi, l'augmentation de l'expression de cette cytokine à l'aide d'un vecteur viral mène à une diminution de la vitesse de la progression de la maladie et allonge la durée de vie chez ce même modèle murin. Dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le changement phénotypique de la microglie avec l'apparition des symptômes de la SLA, nous utilisons un système-modèle pour le profilage moléculaire spécifique à la microglie. Cet outil, EDTA TRAP, consiste en l'immunopurification des ribosomes microgliaux et l'identification subséquente des ARNm et des protéines séquestrés sur ces ribosomes. Il a été possible d'identifier une forte disparité dans la nature des ARNm et des protéines les plus régulés. Le profil transcriptomique de la microglie symptomatique dénote une fonction phagocytaire et possiblement neuroprotectrice pour la microglie alors que son profil protéomique est proliférateur et potentiellement neurotoxique. La disparité de ces deux profils s'explique par la répression de la traduction d'ARNm issus de gènes immunitaires par un mécanisme impliquant l'interaction de leur 3'UTR et de la protéine liant l'ARN SRSF3. La forme phosphorylée de cette protéine s'accumule spécifiquement du cytoplasme des cellules microgliales proportionnellement avec la progression de la maladie. La diminution de l'expression de SRSF3 à l'aide d'un oligonucléotide interférent rétablit la traduction des ARNm immunitaires et la fonction phagocytaire de la microglie associée à ces ARNm. Cela mène à une progression plus lente de la maladie et une plus longue survie dans un modèle murin. Ainsi, l'utilisation d'un oligonucléotide interférant contre SRSF3 pourrait être une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement de la SLA. La compréhension des divers mécanismes cellulaires impliquant la protéine SRSF3 est importante pour comprendre son dynamisme dans la SLA. SRSF3 est la plus petite protéine de la famille SR. Cette famille se distingue par leur structure soit un ou deux motifs de reconnaissance de l'ARN en N-terminus et un domaine riche en arginine et en sérine hautement phosphorylable en C-terminus. SRSF3 peut être phosphorylé dans le noyau par la kinase CLK1 ou dans le noyau et dans le cytoplasme par les kinases SRPK. SRSF3 est impliqué dans l'épissage, le transport nucléo-cytoplasmique et la traduction, entre autres. La dérégulation du niveau d'expression ou de la phosphorylation de SRSF3 peut drastiquement changer son rôle dans la cellule. Ainsi, SRSF3 est impliqué dans diverses maladies comme le cancer, les infections virales ou la SLA. Les mécanismes cellulaires régissant le dynamisme de SRSF3 doivent ainsi être bien compris dans le but de faire de l'oligonucléotide interférent contre SRSF3 une thérapie efficace contre la SLA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder that leads to motoneuron loss, progressive paralysis and death a few years after the first symptoms. As every other neurodegenerative disorder, inflammation is a main component of ALS pathogenesis. One of the cell type implicated in this inflammation, the microglia, is the central subject of this thesis. With the emergence of the symptoms, microglia transforms from an anti-inflammatory and neuroprotective phenotype to an aberrant and neurotoxic phenotype. It is necessary to elucidate the cellular mechanisms underlying this phenotypic change and the factors maintaining these phenotypes to allow the development of effective inflammation-targeting therapies. In this thesis we seek to identify, using multiple molecular tools and animal models, the microglial signature at the different stage of the disease. During the symptomatic stage, we identified the immunosuppressive cytokine IL-10 to be responsible for maintaining the anti-inflammatory phenotype. This cytokine is at the same time produced and recognized by microglial cells. Blocking IL-10 receptor accelerated disease progression and shortened survival in a mouse model. Moreover, the augmentation of the expression of IL-10, using a viral vector, slowed disease progression and lengthened lifespan in the same mouse model. In order to understand the cellular mechanisms implicated in the microglial phenotypic change in ALS, we used a system-model for the microglia-specific molecular profiling. This tool, EDTA-TRAP, consists in the microglial poly-ribosome immunopurification and the subsequent identification of in-translation mRNAs and proteins sequestered on these ribosomes. It was possible to identify a strong mismatch in the nature of the most regulated mRNAs and proteins. The transcriptomic profile of symptomatic microglia denotes a phagocytic and possible neuroprotective function for microglia while its proteomic profile is proliferative and potentially neurotoxic. The discrepancy between these two profiles is explained by the repression of immune gene mRNA translation by a mechanism implicating the interaction of their 3'UTR and the RNA-binding protein SRSF3. The phosphorylated form of SRSF3 specifically accumulates in microglia cytoplasm proportionally with disease progression. The decrease of SRSF3 expression by an interfering oligonucleotide restores immune mRNA translation and the microglial phagocytic function. This leads to and slower disease progression and a longer survival in a mouse model. Hence, the use of an interfering oligonucleotide against SRSF3 could be a new therapeutic avenue in ALS treatment. The understanding of the diverse cellular mechanisms implicating SRSF3 is important in elucidating its dynamic function in ALS. SRSF3 is the shortest protein from the SR family. This family can be distinguished by their structure : one or two N-terminal RNA recognition motif and a C-terminal highly phosphorylatable arginine and serine rich domain. SRSF3 can be phosphorylated in the nucleus by the CLK1 kinase or in the nucleus and the cytoplasm by the SRPK kinases. SRSF3 is implicated in splicing, nucleocytoplasmic transport and translation, among others. The deregulation of the expression level or the phosphorylation of SRSF3 can drastically change its role in the cell. Hence, SRSF3 is implicated in many diseases such as cancer, viral infection and ALS. The cellular mechanisms governing SRSF3 dynamism should then by well understood in order to make the interfering oligonucleotide against SRSF3 an efficient therapy to treat ALS.