Reproduction de : Thèse doctorat : Médecine. Biologie cellulaire : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p.140-158.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Clostridium difficile est une bactérie Gram positive anaérobique responsable de plusieurs perturbations intestinales suite à la prise d’antibiotiques et est également reconnue comme une cause majeure de la colite pseudomembraneuse. La pathogenèse des infections à C. difficile est principalement associée aux toxines A et B, qui ont été largement étudiées dans les dernières années. Cependant, plusieurs autres aspects de la virulence de ce pathogène sont encore bien mal compris. Un bon nombre de protéines font partie de l’arsenal de facteurs de virulence qui jouent un rôle au niveau de l’adhésion de la bactérie ou qui dégradent certaines composantes de la paroi intestinale afin de permettre à la bactérie de coloniser son hôte. La régulation de l’expression de telles protéines nous permettrait d’en connaître davantage sur la colonisation de l’hôte par C. difficile. Chez plusieurs espèces bactériennes, le 3’5’ diguanosine monophosphate cyclique (c-di-GMP) est un second messager important qui régule plusieurs phénotypes. La formation de biofilm ainsi que la régulation de la transition de cellules motiles à un mode de persistance sont parmi les fonctions connues du c-di-GMP. Toutefois, la diversité des processus physiologiques bactériens régulés par le c-di-GMP reste encore pour la plupart peu expliquée chez les bactéries à Gram positif. Chez certaines bactéries, le c-di-GMP est impliqué dans le contrôle de la régulation de l’expression de gènes, via la liaison à des récepteurs à ARN, les riborégulateurs. Les riborégulateurs sont des séquences d’ARN non codants localisés dans la partie 5’UTR d’un ARNm et régulant l’expression de gènes par la liaison d’un ligand à son aptamère comme le c-di-GMP. Cette étude s’intéresse à la régulation et à la fonction des gènes CD2831 et CD2830 qui sont regroupés en un seul locus. L’expression de ces gènes est contrôlée par les niveaux de c-di-GMP intracellulaire via deux riborégulateurs en amont de ces gènes. Chez C. difficile, deux classes de riborégulateurs à c-di-GMP, de fonction similaire, mais qui diffèrent structurellement, ont été rapportées; c-di-GMP-I et c-di-GMP-II. L’expression relative du gène CD2830 en aval du riborégulateur à c-di-GMP de type I diminue de 23 à 29 fois lorsque le niveau de c-di-GMP intracellulaire augmente, tandis que pour les mêmes conditions, le gène CD2831 en aval du riborégulateur à c-di-GMP II était de 72 à 96 fois plus exprimé. Des essais β-galactosidase avec des fusions des riborégulateurs et lacZ, ont démontrés que l’expression des gènes CD2830 et CD2831 semble être contrôlée de façon opposée par leurs riborégulateurs transcriptionnels respectifs, selon les concentrations de c-di-GMP intracellulaire. La protéine CD2830 a été décrite comme une métalloprotéase zinc-dépendante ayant une activité sur la fibronectine, le fibrinogène de plasma humain et la protéine CD2831, qui code pour une adhésine putative. La fonction de cette dernière protéine reste encore mal connue. Cette étude n’a pas permis de démontrer que les protéines CD2830 et CD2831 jouent un rôle dans l’agrégation ou dans l’adhésion à la fibronectine et au fibrinogène lorsque la concentration de c-di-GMP intracellulaire varie. Cette étude suggère que chez C. difficile, la zinc-métalloprotéase CD2830 est impliquée dans un mécanisme de clivage de protéines d’adhésion, comme décrit chez plusieurs pathogènes, afin de contrôler l’adhésion cellulaire lors de processus biologique important. Ce mécanisme serait régulé par le c-di-GMP.

De 50 à 100 millions de cas de maladie de dengue sont recensés chaque année dans le monde. Le virus de la dengue présente aujourd’hui un problème de santé publique avec son émergence en Europe et particulièrement en France. L’infection par le virus peut être asymptomatique ou être responsable de trois pathologies: l’une avec des symptômes grippaux (DF), une autre avec des hémorragies modérées (DHF) et une dernière avec des hémorragies sévères entraînant un syndrome de choc (DSS).Les facteurs de l’hôte jouent un rôle important dans le développement de formes sévères mais les facteurs viraux impliqués restent peu décrits. Le but de ce travail de thèse était de mieux comprendre ces facteurs viraux au travers de l’étude des dynamiques de circulation de souches de dengue 3 génotype III en Afrique et de la caractérisation de trois souches de dengue de sérotype I du Cambodge. Ce travail nous a permis de mettre en évidence la circulation de variants pendant les épidémies, permettant de supposer que la présence de variants permet une meilleure dissémination, ainsi que des caractéristiques génotypiques et phénotypiques particulières in vitro aux souches associées aux formes hémorragiques et aux formes avec syndrome de choc chez l’homme. Ces travaux ont été complétés par le développement d’un système original de détection du virus de la dengue et des autres virus du genre Flavivirus. Ce travail de thèse a permis d’identifier de potentiels facteurs de virulence propres au virus, ouvrant la voie à la recherche sur le rôle de certaines protéines virales dans la pathogénicité. / From 50 to 100 million cases of dengue illness occurred every year in the world. Today, dengue virus is a public health problem with its emergence in Europe, particularly in France. DENV infection can be asymptomatic or be responsible for three distinct pathologies: one with flu-like symptoms (DF), another with moderate hemorrhage (DHF) and the last one with severe bleeding leading to shock syndrome (DSS). Host factors have an important role in the development of severe forms but implicated viral virulence factors stay not well described. The aim of this research work was to better understand these viral factors through study of dengue serotype 3 genotype III dynamics of circulation in Africa and through the characterization of three dengue serotype 1 strains in Cambodia. This work highlighted the circulation of variants during epidemics, allowing us to suppose that the presence of variants permits a better dissemination, as well as specific phenotypic and genotypic characteristics in vitro of strains associated with hemorrhagic forms or forms with shock syndrome in humans. These works were completed by the development of an original system of detection of dengue virus and other viruses of genus Flavivirus. This research work allowed identifying potential virulence factor specific to virus, opening the way for research on the role of certain viral proteins in pathogenicity.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Blastocystis spp. est un Straménopile parasite anaérobie fréquemment rencontré dans le tractus gastro-intestinal de l’homme et de divers animaux. Ce parasite est associé à des troubles gastro‐intestinaux aspécifiques, et semble impliqué dans des désordres fonctionnels tels que le syndrome de l’intestin irritable (IBS). Ce travail de thèse s’appuie sur le séquençage du génome de Blastocystis sp. ST7 réalisé en collaboration avec le Génoscope d’Evry, l’Université Nationale de Singapour, l’Institut Pasteur de Lille et l’Université de Provence. Ce génome est constitué d’un génome nucléaire de 18,8 Mpb pour 6020 gènes, et d’un génome mitochondrial de 29 kpb localisé dans des organites apparentés aux mitochondries. L’analyse de ce génome apporte des informations au niveau de l’évolution de ce microorganisme, de son adaptation à l’environnement intestinal et de ces facteurs de virulence potentiels. En effet, les analyses in silico de ce génome ont montré que Blastocystis sp. ST7 possède plusieurs gènes codant des protéines pouvant agir à l’interface entre l’hôte et le parasite et connues chez d’autres protozoaires pour être impliquées dans des phénomènes de pathogénie. Ce sont en particulier des PKS, des NRPS, et des hydrolases dont des protéases. D’autre part, des activités protéolytiques ont été mises en évidence expérimentalement dans les surnageants de culture du parasite. Deux protéases à cystéines (une cathepsine B et une légumaïne) pouvant être impliquées dans la physiopathologie du parasite, ont été identifiées et caractérisées dans les surnageants, confirmant ainsi nos analyses in silico. Ce travail ouvre de nombreuses pistes intéressantes à explorer pour évaluer l’impact de ce parasite en santé humaine. / Blastocystis spp. is a highly prevalent anaerobic Stramenopile parasite found in the intestinal tract of humans and various animals. This parasite is associated with non specific intestinal disorders, and could be involved in functional disorders such as the irritable bowel syndrome (IBS). In this work, the Blastocystis sp. ST7 genome sequencing project was carried out in collaboration with the Génoscope of Evry, the National University of Singapore, the Pasteur Institute of Lille and the University of Provence. This genome consists in a nuclear genome of 18,8 Mpb encoding 6020 genes, and a mitochondria‐like genome of 29 kpb localised in the mitochondrion‐like organelles. The analysis of this genome brings information about the evolution of this micro‐organism, its adaptation to the intestinal environment and its potential virulence factors. Blastocystis sp. ST7 was predicted to harbor several genes coding proteins that could act at the parasite‐host interface, and that are known to be involved in the pathogeny of many protozoa. They are PKS, NRPS, and hydrolases among them proteases. In addition, proteolytic activities were highlighted in the parasite culture supernatants. Two cysteine proteases (a cathepsin B and a legumain) were identified and characterized from the supernatants and could play a role in the physiopathology of the parasite, that confirm our in silico analyses. This work opens new ways to evaluate the impact of this parasite in human health.

Les champignons sont les principaux agents pathogènes des plantes. Leur étude est donc essentielle pour contrôler les maladies et maintenir un bon rendement de production agricole. La nutrition de ces pathogènes est basée sur l'absorption de nutriments, préalablement dégradés par un arsenal d'enzymes lytiques secrétées. La sécrétion des protéines est assurée par le trafic intracellulaire mettant en jeu de nombreuses vésicules. Chez les champignons filamenteux, ces vésicules ont été visualisées en microscopie électronique mais le processus mis en jeu pour leur biogénèse n'est toujours pas élucidé. L'identification de ce mécanisme est un donc un prérequis pour comprendre la sécrétion de facteurs de virulence. Dans ce but, un mutant non pathogène altéré au niveau de l'expression du gène codant la chaine lourde de la clathrine a été sélectionné parmi une banque de mutants générés chez le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea. Le gène codant pour la chaine lourde de la clathrine est essentiel chez de nombreux organismes, ainsi un mutant dominant négatif de la chaine lourde de la clathrine a été généré et confirme la perte de pathogénicité. La caractérisation du mutant par une approche de protéomique a mis en évidence un défaut de sécrétion de 82 protéines incluant des facteurs de virulence connus. Un défaut de production de vésicules intracellulaires a également été constaté. Par ailleurs, le marquage de la clathrine à la GFP a permis de préciser sa localisation dans les cellules fongiques. Enfin, de façon surprenante, aucun défaut d'endocytose n'a été constaté au sein des mutants déficients en clathrine. Cette étude met en évidence pour la première fois le rôle essentiel de la clathrine dans le processus infectieux d'un champignon pathogène ainsi que son rôle dans a sécrétion de facteurs de virulence / Fungi are the most important plant pathogens on agricultural and horticultural crops. Study of fungal pathogens remains essential to understand pathogenic process and control plant diseases. These organisms secrete high amount of degrading enzymes involved in plant decomposition and they feed by absorption of degraded nutriments. Secretory proteins were described to be transported form Endoplasmic Reticulum and Golgi apparatus to extracellular space through intracellular vesicles. In filamentous fungi, intracellular vesicles were observed using electron microscopy but their biogenesis process is still unknown. Therefore, elucidation of the process and the identification of proteins involved in secretory vesicles biogenesis remains a challenge to understand virulence factors delivery. A nonpathogenic mutant altered in the expression of the gene coding for clathrin heavy chain was selected in a random mutant library generated in the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea,. This gene is essential in many organisms, thus a clathrin dominant negative mutant was generated and confirming the nonpathogenic phenotype observed on several host plant. In eukaryotic cells, clathrin heavy chain is mainly described to be involved in endocytosis, but it is also essential for high density secretory vesicles formation in yeast. Characterization of the mutants using a proteomic approach revealed a secretion defect of 82 proteins including known virulence factors, as Plant Cell Wall Degrading Enzymes and elicitors. Furthermore, the clathrin mutant revealed a strong reduction of intracellular vesicles production. Clathrin was also localized in living cells using fluorescent GFP-tag protein. Endocytosis was also studied and surprisingly, any observable defect was observed for clathrin mutants. This study demonstrated for the first time the essential role of clathrin in the infectious process of a fungal pathogen and its role in virulence factors secretion

Legionella pneumophila (Lp) est une bactérie ubiquitaire dans les environnements aqueux et responsable d’une pneumopathie potentiellement sévère : la légionellose. La majorité des souches impliquées appartiennent au sérogroupe 1 (Lp1) et à un sous- groupe spécifique de souches portant un épitope particulier dites mAb3/1+. Cependant, la différence de distribution entre les souches retrouvées dans l’environnement et celles impliquées en clinique n’est pas clairement élucidée. Notre travail a porté sur la détection de deux facteurs de virulence de Lp. Nous avons voulu mettre en évidence l’existence de Phenols Soluble Modulines (PSMs), peptides uniquement décrit chez Staphylocoques et avons ainsi pu démontrer l’activité de peptides prédits par analyse in silico chez Lp capables d’activer la réponse inflammatoire par la voie du NF-?B et sont dotés d’une action cytotoxique. Notre deuxième axe d’étude a porté sur le lipopolysaccharide (LPS) de Lp. Afin de vérifier si la prédominance de certaines souches était liée à un biais diagnostique, nous avons voulu tout d’abord vérifier la sensibilité de 3 tests urinaires diagnostiques envers le LPS extrait de souches de différents sous- groupes de Lp1 et sérogroupes de Lp et avons ainsi pu montrer que ces tests sont capables de détecter tous les LPS de Lp1. La sensibilité envers le LPS des autres sérogroupes est très variable mais reste insuffisante pour permettre leur détection. Nous avons ensuite utilisé ces LPS extraits pour vérifier la réponse immunitaire innée en fonction des souches de Lp1. Ainsi les souches mAb3/1+ activent moins le système immunitaire que les souches mAb3/1-, ce qui pourrait expliquer alors une moins bonne clairance de ces souches permettant leur multiplication à l’origine d’une infection. Au final, notre travail a permis d’étudier deux facteurs de virulence potentiels au sein de Lp, pouvant expliquer partiellement la prédominance de certaines souches en pathologie humaine / Legionella pneumophila (Lp) is a ubiquitous intracellular bacterium found widely in the environment and is the cause of an opportunistic infection named legionellosis. The majority of the strains involved belong to serogroup 1 (Lp1) and to a specific subgroup named mAb3/1+, linked to a specific epitope expressed at the cell membrane. However the distribution difference between the strains found in the environment and the ones involved in pathology is not fully understood. We here studied two virulence factors of Lp. We first demonstrated the existence of Phenols Soluble Modulines (PSMs), smalls peptides that only have been described for Staphylococcus and found that the peptides that were predicted for Lp by in silico analysis were able to activate the innate immune response by NF-?B pathway and were able to have a cytotoxic activity. We also studied the lipopolysaccharide (LPS) of Lp. To found out if the predominance of some strains was linked to a diagnosis biais, we first evaluated the sensitivity of 3 urinary antigens tests against extracted LPS of strains belonging to all the sous-groups of Lp1 and serogroups of Lp. We then demonstrated that those tests are able to detect all LPS of Lp1, independently of mAb3/1 character. The sensitivities of the 3 tests were very variable for the other serogroups of Lp, but were too low to be able to detect those LPS in practice. We then used these extracted LPS to evaluate the innate immune response for different strains of Lp1. We demonstrated that mAb3/1- strains needed lower dose of LPS to activate the innate immune response than mAb3/1+ strains, which could be linked to a better clearance of the bacteria from the host, which doesn’t develop an infection. This work has studied two potentially virulent factors of Lp, which could partially explain the predominance of some strains of Lp in human pathology

Reproduction de : Thèse de doctorat : Physiologie, Biologie des organismes, populations, interactions : Lille 2 : 2008. / Résumé en français et en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 143-175.

La pathogénicité des bactéries a toujours été attribuée à des facteurs de virulence et les bactéries pathogènes sont considérées comme étant mieux armées, comparé à des bactéries ne provoquant pas de maladies. Selon les premières études génomiques, le fait de supprimer un certain nombre de gènes des bactéries pathogènes, limiterait leur capacité à infecter leurs hôtes. Au contraire, des études de génomique comparatives récentes, démontrent que la spécialisation des bactéries dans les cellules eucaryotes est associée à une perte de gènes massive, en particulier pour les endosymbiontes allopatriques qui sont isolés depuis longtemps dans une niche intracellulaire. En effet, les bactéries sympatriques, extracellulaires, ont souvent des génomes plus grands et présentent une résistance et une plasticité plus importante. Ces bactéries constituent, de fait, plutôt des complexes d’espèces que de vraies espèces. Certaines bactéries spécialistes, comme les bactéries pathogènes, arrivent à s’échapper de ces complexes et à coloniser une niche, bénéficiant alors d’un nom d’espèce. Leur spécialisation leur permet de devenir allopatriques et leurs pertes de gènes favorisent une évolution réductive. Ces observations nous ont conduits à réaliser une étude afin de quantifier le taux de perte de gènes lors de l’évolution de ces bactéries extracellulaires vers celle de bactéries spécialistes intracellulaires. Notre objectif était de vérifier que ce qui caractérise l’évolution des bactéries intracellulaires est bien la réduction génomique, en prenant en compte tous les événements possibles de gains de gènes. Par ailleurs, dans une étude neutre comparant les 12 espèces pandémiques les plus dangereuses pour l’homme avec les espèces non-épidémiques les plus proches, nous avons voulu identifier des spécificités génomiques associées à la capacité virulente de bactéries pathogènes et démontrer que, à part les toxines et les modules toxine-antitoxine, ce qui caractérise ces espèces ce ne sont pas les facteurs de virulence, mais la perte des gènes de régulation. Au final, les bactéries pathogènes ont un répertoire virulent dans lequel les gènes absents sont aussi importants que les gènes présents. / The virulence of pathogenic bacteria has been attributed to virulence factors and pathogenic bacteria are considered to have more genes compared to bacteria that do not cause disease. According to the first genomic studies, removing a certain number of genes from pathogenic bacteria impairs their capacity to infect hosts. However, more recent studies have demonstrated that the specialization of bacteria in eukaryotic cells is associated with massive gene loss, especially for allopatric endosymbionts that have been isolated for a long time in an intracellular niche. Indeed, bacteria living in sympatry often have bigger genomes and exhibit greater resistance and plasticity and constitute species complexes rather than true species. Specialists, including specific pathogenic bacteria, escape these bacterial complexes and colonize a niche; thereby gaining a species name. Their specialization allows them to adopt allopatric lifestyle and experience reductive genome evolution. These observations led us to design a study to quantify the rate of gene losses during the evolution of free-living bacteria to intracellular specialists. Our objective was to verify that what characterizes the evolution of intracellular bacteria is genomic reduction, taking under consideration all possible gene gain events. Furthermore, in another neutral study comparing the 12 most dangerous pandemic bacteria to Humans to their closest non-epidemic species, we wished to identify any genomic specificities associated to the virulent capacity of pathogenic bacteria and demonstrate that, besides toxins and surprisingly, toxin-antitoxin modules, pathogenic bacteria are not characterized by more virulence factors, but rather by a loss of regulatory genes. Finally, virulent bacteria exhibit a genomic repertoire in which absent genes are as important as present ones.