Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Clostridium difficile est une bactérie pathogène responsable de diarrhées nosocomiales et de la plupart des colites pseudomembraneuses. Le principal facteur de risque est la prise d’antibiotiques qui altère la composition du microbiote intestinal, et favorise ainsi l’implantation de la bactérie au niveau colique. Après une étape de colonisation, la bactérie produit ses principaux facteurs de virulence, les toxines A et B. La colonisation est un processus multifactoriel, qui met en jeu différentes protéines de surface dont des adhésines et une cystéine protéase Cwp84.Dans une première partie, nous avons analysé le processus de maturation de la protéase Cwp84, ainsi que sa localisation dans la bactérie, afin de mieux comprendre son rôle dans la virulence de C. difficile. La protéase recombinante, purifiée sous forme de zymogène, présente un processus de maturation particulier comprenant des clivages successifs, qui aboutissent à la forme mature de 47 KDa. La protéase ainsi activée présente une activité protéolytique sur la fibronectine. Dans la bactérie, Cwp84 existe sous deux formes majoritaires, associées à la surface de la bactérie : une première forme, d’environ 80 KDa, associée aux protéines de la couche S, dont le rôle serait de cliver le précurseur des protéines de la couche S en deux protéines matures ; une deuxième forme, d’environ 50 KDa correspondant vraisemblablement à la forme mature de la protéase recombinante de 47 KDa, est retrouvée à la fois dans la fraction extracellulaire et associée à la surface de la bactérie. Nous avons montré que la protéase rélarguée est capable de se ré-associer sous sa forme mature de manière spécifique à la surface de C. difficile. Dans une deuxième partie, nous avons analysé l’impact de conditions environnementales mimant celles rencontrées par la bactérie au cours de son transit dans le tractus digestif de l’hôte, sur la modulation de facteurs de colonisation, dont la protéase. Nous avons montré qu’un pH acide favorise à la fois l’expression et le processus de maturation de la protéase vers sa forme mature de 47 KDa. Des analyses protéomiques et transcriptomiques ont montré que d’autres protéines impliquées dans colonisation sont surexprimées dans un milieu avec glucose, cette régulation étant vraisemblablement liée à la diminution du pH résultant de la fermentation du glucose plutôt qu’à un effet direct de ce sucre. Cette régulation des facteurs de virulence par le pH acide est probablement un élément favorable au processus de colonisation de l’hôte. Ces différentes analyses ont également permis l’identification de facteurs de virulence potentiels, qui devront être caractérisés par la suite. / Clostridium difficile, a gram-positive spore-forming, anaerobic bacterium, is the etiological agent of pseudomembranous colitis and of many cases of nosocomial diarrhea. The main risk factor is the use of antibiotics that alters the intestinal microbiota, predisposing to C. difficile intestinal colonization. C. difficile pathogenicity is mediated mainly by its A and B toxins, secreted after host colonization that involves various surface proteins, including different adhesins and proteolytic enzymes as the cysteine protease Cwp84.We sought to analyze the localization and the maturation process of the proteaseCwp84. We showed that the recombinant protein Cwp8430-803, purified as zymogen form, presents a particular maturation process including consecutive cleavages, leading to the mature form of 47 kDa. This protease has a proteolytic activity against the fibronectin. Two identifiable forms of the protease were found to be associated in the bacteria: a form of about 80 kDa and a cleaved one of 47 kDa, identified as the mature protease. They were found mainly in the bacterial cell surface fractions, and weakly in the extracellular fraction. The 80 kDa protein was non covalently associated to the S-layer proteins, while the 47 kDa form was found to be tightly associated with the underlying cell wall. Our data supported that the anchoring of the Cwp84 47 kDa form is presumably due to a re-association of the secreted protein.We also studied the regulation of virulence factors depending of environmental conditions that mimic those encountered by the bacterium in the digestive tract. We showed that an acidic pH affects the expression and the proteolytic process of Cwp84. The mature form was only recovered with an acidic pH. Proteomic and transcriptomic analysis of some surface proteins involved in colonization revealed that their expression was increased in media containing glucose. However, this regulation is probably related to the decrease in pH resulting from fermentation of glucose, rather than a direct effect of glucose. The acidic pH could lead in vivo to modulation of virulence factors expression and is probably a favorable feature in the colonisation process. We also identified new surface associated-proteins, that could represent potential virulence factors; they will be characterized later.

Le parasite microsporidien Nosema ceranae est un pathogène émergent de l’abeille européenne (Apis mellifera). Il provoque une maladie appelée nosémose qui peut induire de fortes mortalités dans les colonies. La présence de N. ceranae dans les ruches n’est pas toutefois pas systématiquement associée à des symptômes ou à une dépopulation, ce qui suggère une variabilité de sa virulence. Une hypothèse proposée pour expliquer cette variation repose sur l'existence potentielle de variants parasitaires de niveaux de virulence différents. Ce travail a eu pour objectif d’évaluer le polymorphisme de N. ceranae par une approche multilocus, dans le but de savoir s’il est possible de différencier des isolats parasitaires. La diversité nucléotidique de dix marqueurs génétiques a été évaluée dans des abeilles géographiquement éloignées. L’analyse du polymorphisme de ces gènes a révélé un fort contenu allélique au sein même d'un individu hôte mais une absence de divergence entre les populations parasitaires issues d'hôtes distincts. Ces données montrent que cette approche multilocus ne permet de pas de différencier des isolats de N. ceranae, mais que des populations parasitaires similaires infectent des abeilles géographiquement distantes. Ces données sont en accord avec l'hypothèse d'une colonisation récente d'A. mellifera par N. ceranae mais posent de nombreuses questions quand à l'origine de la diversité parasitaire au sein d'un seul individu. Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de rechercher dans le génome de N. ceranae des gènes codant de potentiels facteurs de virulence puis de produire des protéines recombinantes et des anticorps dirigés contre ces facteurs. Ces anticorps devaient permettre de localiser ces protéines d'intérêt au niveau subcellulaire dans des tissus infectés. / The microsporidian parasite Nosema ceranae is an emergent pathogen of the Western honeybee (Apis mellifera). It is associated to a disease called nosemosis that can lead to high mortality of honybees in colonies. Its presence in hives has not been systematically linked to symptoms or depopulation, suggesting a variation in its virulence. Thus, the existence of several N. ceranae variants with different virulence levels has been proposed. In this work aimed to assess N. ceranae polymorphism through a multilocus approach to test whether is it possible to discriminate between parasite taxa. Thus the nucleotide diversity of ten marker genes has been measured in parasite populations isolated from single A. mellifera individuals in distant locations. While high nucleotide diversity and allele content have been observed for all genes in single individuals, the absence of isolate differentiation precluded any taxa discrimination. These data support the hypothesis of a recent host-jump to A. mellifera and suggest that similar populations of parasites infect honeybees in distant locations. However they question the origin of such polymorphism within one host. In the second part of this work genes encoding putative virulence factors have been searched within N. ceranae genome, in order to produce recombinant proteins and then specific antibodies. Such antibodies would allow the subcellular localization of those proteins in infected tissues.

Pseudomonas aeruginosa (PA) représente une des causes principales d'infections respiratoires acquises chez les patients aux défenses immunitaires altérées et la colonisation par PA est une étape marquante de la dégradation de la fonction pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose. Le traitement de ces infections est difficile à cause de la résistance naturelle du pathogène à un grand nombre d'antibiotiques et d'une augmentation de la prévalence des souches ayant acquis une multi-résistance.<br />Les facteurs de virulence de PA induisent une augmentation des sécrétions apicale de fluide par l'activation des transports transépithéliaux ainsi qu'une perturbation de l'homéostasie calcique au niveau de l'épithélium respiratoire ; cependant l'impact de ces effets reste encore mal compris. <br />Sur un modèle de culture cellulaire de cellules épithéliales respiratoires en co-culture avec différentes souches de PA, nous montrons un effet protecteur d'un chélateur calcique (EGTA) sur la mort cellulaire induite par l'activation du système de sécrétion de type III (TTSS), un des principaux facteurs de virulence de PA. L'EGTA agit en diminuant l'adhésion de la bactérie et l'injection des exotoxines du TTSS dans le cytoplasme de la cellule épithéliale. Sur ce modèle, nous montrons aussi que les toxines du TTSS et l'EGTA induisent des modifications du cytosquelette des cellules épithéliales. L'autre partie de ce travail démontre le rôle du LPS de PA dans l'augmentation du calcium intracellulaire et la sécrétion de chlore des cellules épithéliales bronchiques humaines. Le LPS induit un relargage du calcium du réticulum ainsi qu'une entrée de calcium extracellulaire par des canaux membranaires. Cet effet est corrélé avec une augmentation de la sécrétion de chlore apicale dépendante de l'activation du CFTR mais aussi des canaux chlores activés par le calcium.<br />Ces effets rapides et encore peu décrits des facteurs de virulence de PA associés au rôle important du calcium intracellulaire et de la sécrétion de chlore des cellules épithéliales dans la signalisation de l'infection constituent probablement un des premiers signaux perçus par l'hôte. Ces mécanismes constituent une étape essentielle en recherche fondamentale afin de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques pour développer de nouvelles approches thérapeutiques en alternative aux antibiotiques.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections graves chez les individus immunodéprimés et chez les personnes atteintes de mucoviscidose. Cette pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence, dont l'un, le système de sécrétion de type III (SSTT) est présent chez un grand nombre de bactéries pathogènes à Gram négatif. Ce système de sécrétion permet à la bactérie d'injecter des effecteurs cytotoxiques directement dans le cytoplasme de la cellule eucaryote cible. Chez P. aeruginosa, le SSTT est constitué d'un appareil de sécrétion, appelé Psc (Pop secretion) permettant le passage des effecteurs à travers les membranes bactériennes, et d'un translocon, codé par l'opéron pcrGVHpopBD, permettant l'injection des effecteurs cytotoxiques dans le cytosol de la cellule eucaryote. Nous avons montré dans le laboratoire que l'isolat clinique CHA de P. aeruginosa est capable d'échapper à l'activité bactéricide des polymorphonucléaires neutrophiles humains (PMNs) et d'induire une mort rapide par oncose des phagocytes (Dacheux et al., 2000). Dans un premier volet, l'utilisation des hématies comme modèle cellulaire m'a permis de montrer que cette oncose est précédée par la formation de pores, de taille estimée entre 28 et 35 Å, dans la membrane cytoplasmique de ces cellules. Des expériences de mutagénèse montrent que la formation de ces pores requiert les protéines PcrV, PopB et PopD. L'analyse par Western blot de membranes isolées d'hématies infectées par P. aeruginosa indiquent que les protéines PopB et PopD constituent le pore de translocation inséré dans la membrane cytoplasmique des cellules eucaryotes. La protéine PcrV, qui n'est jamais retrouvée dans la fraction membranaire d'hématies infectées par P. aeruginosa, agit à la surface de la bactérie comme une « chaperonne extracellulaire » responsable de l'assemblage de PopB et PopD en un complexe hétéro-oligomérique. Le second volet traite du mécanisme d'action des anticorps protecteurs anti-PcrV contre les infections à P. aeruginosa. Des expériences de fractionnement d'hématies infectées par P. aeruginosa en présence de ces anticorps protecteurs a permis d'établir que ces derniers inhibent l'assemblage du pore de translocation du SSTT.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le parasite microsporidien Nosema ceranae est un pathogène émergent de l'abeille européenne (Apis mellifera). Il provoque une maladie appelée nosémose qui peut induire de fortes mortalités dans les colonies. La présence de N. ceranae dans les ruches n'est pas toutefois pas systématiquement associée à des symptômes ou à une dépopulation, ce qui suggère une variabilité de sa virulence. Une hypothèse proposée pour expliquer cette variation repose sur l'existence potentielle de variants parasitaires de niveaux de virulence différents. Ce travail a eu pour objectif d'évaluer le polymorphisme de N. ceranae par une approche multilocus, dans le but de savoir s'il est possible de différencier des isolats parasitaires. La diversité nucléotidique de dix marqueurs génétiques a été évaluée dans des abeilles géographiquement éloignées. L'analyse du polymorphisme de ces gènes a révélé un fort contenu allélique au sein même d'un individu hôte mais une absence de divergence entre les populations parasitaires issues d'hôtes distincts. Ces données montrent que cette approche multilocus ne permet de pas de différencier des isolats de N. ceranae, mais que des populations parasitaires similaires infectent des abeilles géographiquement distantes. Ces données sont en accord avec l'hypothèse d'une colonisation récente d'A. mellifera par N. ceranae mais posent de nombreuses questions quand à l'origine de la diversité parasitaire au sein d'un seul individu. Le second volet de cette thèse a eu pour objectif de rechercher dans le génome de N. ceranae des gènes codant de potentiels facteurs de virulence puis de produire des protéines recombinantes et des anticorps dirigés contre ces facteurs. Ces anticorps devaient permettre de localiser ces protéines d'intérêt au niveau subcellulaire dans des tissus infectés.

Le genre Aeromonas regroupe des bactéries ubiquitaires vivant essentiellement dans les environnements hydriques. Ces pathogènes opportunistes de l’homme et de nombreux animaux possèdent un large répertoire de facteurs associés à la virulence. Bien que des pathotypes aient été proposés et que certaines espèces semblent plus fréquemment isolées en clinique humaine et vétérinaire, leur pouvoir pathogène demeure mal compris, notamment en raison du faible nombre d’études fonctionnelles et du manque d’investigations tenant compte de la diversité génétique et de la complexité des comportements biologiques du genre Aeromonas.Nous avons émis l’hypothèse que chez un pathogène opportuniste d’origine environnementale aussi polyvalent et ubiquitaire qu’Aeromonas, la structuration en complexes d’espèces avec une remarquable diversité génétique/génomique des populations, le polymorphisme des facteurs de virulence et les interactions au sein de communautés « pathogènes » puissent être des facteurs d’adaptation au comportement pathogène. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié i) la diversification au sein d’un complexe d’espèces, « A. media », utilisé comme modèle au moyen d’une étude de population intégrant la génétique et la phylogénie multilocus, les mécanismes d’évolution, la génomique comparative mais également les données phénotypiques, de modes de vie et d’habitats et, ii) la patho-génomique de facteurs de virulence reconnus (aérolysine, entérotoxines thermostable et thermolabile, exotoxine A, protéase à sérine, composants et effecteurs du système de sécrétion de type III, et flagelline latérale) pour une population représentative de la diversité des espèces actuellement connue dans le genre (30 espèces) et iii) le comportement pathogène in vivo (modèle Caenorhabditis elegans) et in vitro (cytotoxicité et cytoadhésion, production de biofilm, motilité) et la signalisation intercellulaire (quorum-sensing de type I) à l’échelle de populations impliquées dans les aéromonoses mixtes (5% des aéromonoses humaines) définies par l’isolement d’au moins 2 clones distincts d’Aeromonas.Le phénomène de spéciation décrit avec l’exemple du complexe A. media, agrégeant 3 espèces génomiques, démontre qu’Aeromonas possède une structure de population en complexes d’espèces dont la diversité génétique et génomique ainsi que les modes d’évolution (mutations et recombinaisons) révèlent divers potentiels adaptatifs et patho-adaptatifs associés à l’émergence de lignées. Au sein du complexe A. media, l’espèce A. rivipollensis semble plus adaptée à un mode de vie associé à des hôtes et possède des gènes spécifiques de résistance à des stress environnementaux. Aeromonas possède de nombreux facteurs de virulence présentant diverses histoires évolutives. Certains montrent une phylogénie dépendante de l’évolution du core-génome, suggérant l’implication de ces gènes dans des processus de spéciation en relation avec l’adaptation à diverses niches. L’étude des performances de PCRs de virulence a révélé des insuffisances majeures dans la sensibilité des méthodes évaluées principalement liées au polymorphisme génétique des facteurs de virulence. Nous avons également montré que des populations mixtes d’Aeromonas isolées d’échantillons cliniques pouvaient modifier le déroulement de l’infection en modèles in vivo et in vitro probablement par mécanisme de coopération ou de compétition avec mise en jeu de signaux de communication cellule-cellule.L’importante complexité d’Aeromonas retrouvée à travers la structure de population, le polymorphisme des facteurs de virulence et les comportements de multicellularité sont autant de facteurs potentiels d’adaptation au comportement infectieux qui permettent d’expliquer au moins en partie les difficultés rencontrées dans l’élucidation de pouvoir pathogène de ces bactéries. / Aeromonas groups ubiquitous bacteria mainly living in aquatic environments. These opportunistic pathogens for human and numerous animals have a large repertoire of virulence-associated factors. Although pathotypes were proposed and despite some species are more frequently isolated in human and animal infections, their pathogenicity is still poorly understood, mostly because very few comprehensive functional studies are available and because investigations taking into account the genetic diversity and the biological complexity within the genus are lacking.We assumed that for an opportunistic bacterial pathogen of environmental origin as versatile and ubiquitous as Aeromonas, the population structure in complex of species, the outstanding genetic/genomic diversity, the polymorphism of virulence factors and the interactions within pathogenic populations can act as factors driving the adaptation to a pathogenic behaviour. To test this hypothesis, we studied i) the diversification within “A. media”, a complex of species used as a model by a population study that included multilocus genetics, phylogenetics, evolutionary features, comparative genomics, as well as phenotypics, lifestyle and habitat ii) the patho-genomics of well-known virulence factors in aeromonads (aerolysin, thermolabile and thermostable enterotoxins, exotoxin A, serine protease, components and effectors of type III secretion system, and lateral flagellin) in a population that is representative of the known taxonomic diversity in the genus (30 species) and iii) the pathogenic behaviour using an in vivo model (Caenorhabditis elegans), an in vitro model (cytotoxicity, cytoadhesion, biofilm production, motility), and intercellular signals production (type I quorum-sensing) for populations involved in mixed aeromonosis, i.e. 5% of human aeromonosis defined by the isolation of at least 2 distinct clones.The phenomenon of speciation described in the complex “A. media” that aggregates 3 genomic species demonstrates that Aeromonas harbours a population structured in complexes of closely related species whose genetic and genomic diversity, as well as evolution mode (mutations and recombinations) reveal a wide adaptative and patho-adaptative potential linked to lineage emergence. Among the complex “A. media”, the species A. rivipollensis seems to be more adapted to a host-associated lifestyle and harbours specific genes for the resistance to environmental stress. Aeromonas has a wide range of virulence-associated genes, which presented diverse evolutive history. Some of them display a phylogeny linked to the core-genome evolution. These results suggest that these genes are involved in speciation processes probably related to niches adaptation. The evaluation of performances of virulence PCRs revealed major lacks of sensitivity of tested methods mainly due to the genetic polymorphism of the virulence factors. By using in vivo models and in vitro models, we also showed that Aeromonas mixed populations recovered from clinical samples could change the course of infection, likely through a cooperative or competitive mechanism that involves cell-to-cell signalling.The high complexity of Aeromonas results from its population structure, virulence factors polymorphism and multicellular behaviours. They are all putative adaptation factors to a pathogenic behaviour that may explain at least partially the difficulties encountered to elucidate pathogenicity of these bacteria.

Chez les procaryotes, les protéines sont synthétisées dans le cytoplasme avant d'être transportés vers différentes destinations, intra- ou extra-cellulaires. Les bactéries Gram-négatives ont mis au point une grande collection de mécanismes et systèmes, appelés systèmes de sécrétion bactérienne, pour sécréter des protéines à travers leur paroi cellulaire vers l'extérieur. Le système de sécrétion de type VI, identifié dans les années 2006-2008, est une nano-machine polyvalente répandue chez les bactéries pathogènes. Il y a de nombreuses preuves que T6SS injecte des protéines toxiques (effecteurs) directement dans les cellules eucaryotes et procaryotes pour les tuer. Pour empêcher la destruction cellules provenant de la même espèce, les bactéries possédant un T6SS produisent également des protéines d'immunité qui neutralisent les effets toxiques des effecteurs de leurs congénères. Le T6SS est formé de 13 composants de coeur (nommés TssA-M) en une structure souvent comparée à un "bactériophage inversé". La queue, semblable à celle de phages, a une forme tubulaire (la gaine et le tube interne) et polymérise à partir d'une plaque basale ancrée sur un complexe membranaire trans-périplasmique. La contraction de la gaine fournit l'énergie nécessaire pour propulser le tube intérieur à travers la paroi vers les cellules proies. Dans le cadre de ma thèse, je me suis impliqué dans la détermination de la structure et la dynamique de certains composants du T6SS de la d’Escerichia coli enteroaggrégatif (EAEC). Plusieurs structures ont été déterminées et analysées. Quatre articles ont été publiés et deux autres sont en préparation. / In prokaryotes, proteins are synthesized in the cytoplasm before being transported to various destinations, intra- or extra-cellular. Gram-negative bacteria have developed a large collection of mechanisms and systems, termed bacterial secretion systems, to secrete proteins through their cell wall to the exterior. The type VI secretion system, identified in years 2006-2008, is a versatile nano-machine prevalent in pathogenic bacteria. There have been many evidences that T6SS delivers toxic proteins directly into both eukaryotic and prokaryotic cells to kill them. To prevent killing of sibling cells (cells from the same species), T6SS+ cells produce also immunity proteins that neutralize the toxic effects of their cognate effectors. T6SS contains 13 core-components (TssA-M), assembling a structure often quoted as an “inverted bacteriophage”. A phage-like tubular tail (the sheath and the internal tube) polymerizes from a baseplate-like complex, anchored to the cell internal and outer membranes via a membrane anchored complex spanning the periplasm. Contraction of the sheath provides the necessary energy to propel the internal tube through the wall towards the prey cells. In the framework of my PhD, I became involved in determining the structure and dynamics of some components of the EAEC sci1 T6SS, mostly on the membrane and baseplate subcomplexes. Several structures have been determined and analysed. Four articles have been published and two other are in preparation.

Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are a major cause of post-weaning diarrhea. STb is one of two heat-stable toxins produced by ETEC and is mostly associated with pathogenic porcine isolates. For the first time, a variant of the toxin was observed in a study in 2003. Our hypothesis is that STb variants are present in ETEC strains from Quebec. To screen for alterations at the gene level, a collection of 100 STb+ ETEC strains isolated from diseased pigs was randomly selected and analyzed. A total of 23 strains had a change from His12 to Asn. An association between the presence of the variant and virulence factors present in those strains was done. These strains were also positive for STa. Since this variant seems to be widely distributed in Quebec, we hypothesize that the variant has different biological properties compared to the wild-type STb. First, the secondary structure of the variant and wild-type toxin and their thermal stability was determined by circular dichroism. Both show similar structures and thermal stability. In addition, the binding affinity with the toxin receptor, the sulfatide, was determined by surface plasmon resonance. The affinity of the wild-type for the sulfatide is slightly superior to the variant. Finally, the internalization inside IPEC-J2 cells of the variant was compared to the wild-type. The variant is able to internalize more cells than the wild-type. Altogether, these results suggest that both the variant and the wild-type toxin are biochemically and structurally similar.