Xanthomonas oryzae pv. oryae (Xoo) est l'agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BLB), maladie entraînant des pertes de rendement importantes dans la plupart des régions rizicoles, notamment en Afrique. La virulence des souches Asiatiques de Xoo dépend des effecteurs de la famille AvrBs3/PthA ou TAL (pour Transcription Activator-Like). Des études appro fondies sur le mode d'action des effecteurs TAL ont montré que l'activité de virulence ou d'avirulence que les TAL confèrent à la bactérie dépend essentiellement de leur interaction avec les gènes de sensibilité et/ou de résistance correspondants chez le riz. Les souches de Xoo originaires d'Afrique isolées récemment ne présentent que huit effecteurs de type TAL dans leur génome et leur rôle dans la virulence est jusqu'à présent inconnu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effecteurs de type TAL dans la souche africaine de Xoo BAI3. Une mutagenèse systématique par recombinaison homologue sur l'ensemble des huit gènes tal de la souche BAI3 a été effectuée et a conduit à l'identification et à la caractérisation du gène talC. TalC se caractérise par 21.5 répétitions et est phylogénétiquement proche des TAL de Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc). Le mutant BAI3ΔtalC est incapable de développer les symptômes de la maladie sur plante sensible. Toutefois, les bactéries se multiplient très bien au niveau de l'apex foliaire proche du site d'inoculation, laissant supposer que TalC est requis pour la colonisation du système vasculaire. Parmi les cibles directes potentielles identifiées via l'analyse du transcriptome de feuilles de riz sensible (BAI3 versus BAI3ΔtalC), Os11N3 code une protéine de la famille des noduline-3 MtN3 et est fortement induit durant l'infection par la souche sauvage BAI3. Nous avons identifié dans la région promotrice de Os11N3 une séquence nucléotidique ciblée par TalC et démontré qu'elle était fonctionnelle via des expériences d'expression en trans dans N. benthamiana. Les travaux de cette thèse montrent pour la première fois que les effecteurs de type TAL contribuent de manière importante à la virulence de la souche africaine Xoo BAI3. Ces travaux contribueront à l'amélioration génétique des lignées de riz pour la résistance à la bactériose vasculaire du riz en Afrique. / Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the causal agent of Bacterial Leaf Blight (BLB) on rice, a serious disease causing important yield losses in the main rice growing regions including Africa. The virulence of Asian Xoo strains mainly depends on the type III effectors of avrBs3/pthA gene family, namely TAL (for Transcription Activator Like) effectors. In depth studies on the function of TAL effectors revealed that the virulence and/or the avirulence activities conferred by these effectors requires the binding and the induction of the corresponding S and/or R genes. African Xoo strains was shown to harbor 8 TAL effectors in their genomes. However, the contribution of these TAL effectors to Xoo virulence is still unknown. This work reports on the identification and characterization of TAL effectors in the African Xoo strain BAI3R. A random mutagenesis based on homologous recombination in the genes encoding TAL effector was conducted in Xoo str ain BAI3R and led to the identification of talC. TalC harbors 21.5 repeats in its central domain and is phylogenetically more related to TAL effectors of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc). The BAI3RΔtalC mutant is seriously impaired in its virulence on susceptible rice varieties. Interestingly, bacteria are still able to grow at wild-type levels in the apex of the leaf, suggesting a requirement of talc for vascular colonization. Potential direct host targets were identified by conducting a transcriptomic analysis of rice leaves challenged with Xoo strain BAI3R vs. BAI3RΔtalC. Among the identified targets, the rice gene Os11N3 was found to be highly induced upon infection by the wild type strain but not the mutant one. A DNA target box for TalC was located in the Os11N3 upstream region and proved to be functional using GUS assays. We also show that the Os11N3 341-bp upstream region is transcriptionnally activated by TalC. Our results demonstrated for the first time that TAL effectors play an important role in the virulence of Xoo strain BAI3R. Our work will contribute to better improve rice for resistance to bacterial leaf blight.

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) est une bactérie à gram négatif causant le Cassava Bacterial Blight (CBB) sur Manihot esculenta Crantz. Le manioc représente une des sources les plus importantes de carbohydrates pour près d'un milliard de personnes sur terre et une source importante d'énergie du fait de sa forte concentration en amidon. Le CBB constitue une limitation importante à la production massive de manioc et nos connaissances sur cette maladie sont encore insuffisantes. La pathogénie de nombreuses phytobactéries dépend de l'injection d'effecteurs de type III via un système de sécrétion de type III dans la cellule eucaryote hôte Parmi tous les effecteurs référencés aujourd'hui, les effecteurs de type TAL pour Transcription Activator-Like sont particulièrement intéressant. Une fois injectés dans la cellule végétale, les effecteurs TAL sont importés au noyau et y modulent l'expression de gènes cibles au bénéfice de la bactérie. Chez Xam, TALE1Xam est le seul gène de cette famille qui a été étudié au niveau fonctionnel. Cette étude a pour objectif majeur d'identifier les gènes de manioc dont l'expression est modifiée en présence de TALE1Xam. Le transcriptome de plantes de manioc inoculées avec XamΔTALE1Xam vs. XamΔTALE1Xam (TALE1Xam) a été analysé par RNAseq. Les données obtenues confrontées à la recherche bioinformatique de promoteurs de gènes potentiellement directement activés par TALE1Xam ont permis d'établir une liste de gènes ciblés par TALE1Xam candidats. Un candidat majeur ressort de cette analyse comme étant particulièrement intéressant, il s'agit d'un gène codant un facteur de transcription de type B3 régulant l'activité de protéines de type "Heat Shock". L'analyse fonctionnelle de ce candidat permettra de valider sa fonction en tant que gène de sensibilité du manioc à Xam. / Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is a gram negative bacteria causing the Cassava Bacterial Blight (CBB) in Manihot esculenta Crantz . Cassava represents one of the most important sources of carbohydrates for around one billion people around the world as well as a source of energy due to its high starch levels content. The CBB disease represents an important limitation for cassava massive production and little is known about this pathosystem. Bacterial pathogenicity often relies on the injection in eucaryotic host cells of effector proteins via a type III secretion system (TTSS). Between all the type III effectors described up to now, Transcription Activator-Like Type III effectors (TALE) appear as particularly interesting. Once injected into the plant cell, TAL effectors go into the nucleus cell and modulate the expression of target host genes to the benefit of the invading bacteria by interacting directly with plant DNA. In Xam, only one gene belonging to this family has been functionally studied so far. It consists on TALE1xam. This work aim to identify cassava genes whose expression will be modified upon the presence of TALE1xam. By means of cassava plants challenged with Xam Δ TALE1xam vs. Xam + TALE1xam together with the TAL effectors code, statistical analyses between RNAseq experiments and a microarray containing 5700 cassava genes, we seek out direct TALE1xam target genes. Hence, through transcriptomic, functional qRT validation and specific artificial TALEs design we proposed that TALE1xam is potentially interacting with a Heat Shock Transcription Factor B3. Moreover we argue that this gene is responsible of the susceptibility during Xam infection. Furthermore this work represents the first complete transcriptomic approach done in the cassava/Xam interaction and open enormous possibilities to understand and study CBB.

Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) est un champignon filamenteux de la classe des Dothideomycètes faisant partie du complexe d’espèces Leptosphaeria maculans-Leptosphaeria biglobosa composé d’agents pathogènes des crucifères. Lmb est particulièrement adapté au colza (Brassica napus) et provoque la maladie qui lui est la plus dommageable : la nécrose du collet. Dans le but de mieux comprendre et contrôler cette maladie, l’équipe d’accueil a initié un projet de génomique visant à identifier de façon systématique les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène. Les premières données génomiques montraient deux aspects très importants et potentiellement spécifiques de Lmb : (i) tous les gènes d'avirulence caractérisés expérimentalement étaient localisés dans de grandes régions riches en bases AT et composées d'éléments transposables (ET), (ii) ces régions riches en AT préfiguraient une structure génomique particulière, qui, si elle se généralisait à l'ensemble du génome, aurait été totalement inédite chez un micro-organisme eucaryote. La première partie de cette thèse présente la description du génome de Lmb en se focalisant sur sa structure en isochores, résultant d’une invasion du génome par des ET qui ont ensuite été inactivés par un mécanisme de défense spécifique aux champignons ascomycètes, le RIP (Repeat-Induced Point mutation). Puis, l’impact potentiel de cette structure sur la diversification et l’évolution des protéines jouant un rôle clé lors de l’interaction agent pathogène-plante a été évalué, mettant ainsi en avant l’existence d’un génome à « deux vitesses ». Afin de mieux comprendre le rôle potentiel joué par les ET au niveau des capacités d’adaptation de Lmb au colza, une étude de génomique comparative et évolutive de cinq membres du complexe d’espèces a été réalisée. Ce travail montre que Lmb est la seule espèce du complexe dont le génome a été envahi par les ET, et que ces derniers sont impliqués dans (i) des réarrangements intrachromosomiques potentiellement liés à la spéciation entre Lmb et l’espèce la plus proche, (ii) la présence de gènes espèce-spécifiques et (iii) des déplacements dans des régions génomiques très dynamiques de gènes codant des effecteurs. Les travaux constituant cette thèse participent à la généralisation du concept selon lequel un lien fort existe chez les champignons filamenteux phytopathogènes entre ET et gènes impliqués dans la pathogenèse ou l’adaptation à l’hôte. / Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) is a filamentous ascomycete from class Dothideomycetes. It belongs to the Leptosphaeria maculans-Leptosphaeria biglobosa species complex which comprises pathogens of crucifers. Lmb is specifically adapted to oilseed rape (Brassica napus) and is responsible for the most damaging disease of this crop: “stem canker”. In order to better understand and control the disease, the host team initiated a genomic project aiming at systematically identify genes involved in pathogenicity, analyse genome plasticity and evaluate their incidence on adaptability to host. Preliminary genome data firstly showed that all characterized avirulence genes were localized in large AT-rich regions, mainly composed of Transposable Elements (TEs). In addition, these AT-rich regions were the first hints that the Lmb genome may present a very unusual structure compared to other microorganisms. The first part of this thesis describes the Lmb genome with a special focus on its isochore structure, which is the result of a massive TE invasion of the genome followed by an inactivation of TEs by an ascomycete-specific defense mechanism called RIP (Repeat-Induced Point mutation). The potential impacts of this genome structure on diversification and evolution of proteins involved in the plant-pathogen interaction were assessed and highlighted the existence of a “two speed” genome. To better understand how TEs are involved in adaptation of Lmb towards oilseed rape, a comparative and evolutionary genomic analysis of five members of the species complex was conducted. This study shows that Lmb is the only species of the complex with genome invaded by TEs at such an extent, and that TEs are involved in (i) intrachromosomal rearrangements putatively related to the speciation event between Lmb and its closest relative species, (ii) the presence of species-specific genes, (iii) translocations of effector genes into highly dynamic genomic regions. Our data contribute to the generalization of the “two speed” genome concept in filamentous phytopathogens postulating that highly plastic regions of the genome are enriched in genes involved in niche adaptation and that a strong link exists between TEs and genes involved in pathogenesis or host adaptation.

Erwinia chrysanthemi 3937 est une bactérie phytopathogène responsable de maladies de type pourriture molle sur une large gamme de plantes. Durant l'infection, les bactéries se disséminent de manière extracellulaire, au niveau de l'apoplasme des tissus aériens du végétal où elles doivent s'adapter à des conditions de stress oxydant et une faible disponibilité en fer. Comme cet élément est essentiel et paradoxalement génère des radicaux hydroxyles hautement toxiques via la réaction de Fenton, une régulation fine des quantités intracellulaires en fer est primordiale pour la bactérie. L'homéostasie du fer implique une classe de protéines dénommées ferritines qui séquestrent le fer sous forme non réactive et biodisponible notamment lorsque le métal devient limitant dans l'environnement. Le génome d'E. chrysanthemi 3937 comporte une centaine de gènes dédiés au métabolisme du fer dont 4 sont supposés être impliqués dans le stockage intracellulaire du fer : le gène ftnA codant une ferritine de type eucaryote, le gène bfr codant une bacterioferritine contenant des groupements hème et les gènes dps1 et dps2 codant deux protéines Dps (DNA-binding proteins from starved cells). L'inactivation de ces gènes a montré que la ferritine FtnA contribue principalement au stockage intracellulaire du fer. Le rôle des ferritines ne se limite pas à servir de réserves de fer intracellulaire : ainsi la protéine FtnA participe à la résistance au stress oxydant et la protéine Dps1 pourrait jouer un rôle dans la détoxication du peroxyde d'hydrogène. Conformément à leur rôle dans le stockage intracellulaire du fer, les gènes ftnA, bfr et dps1 sont exprimés en réponse à la biodisponibilité en fer par la protéine Fur (Ferric uptake repressor), mais de manière temporellement différentielle au cours de la croissance bactérienne et selon des mécanismes distincts. Seule l'induction du gène ftnA par le fer et Fur est dépendante de l'ARN anti-sens RyhB. Par ailleurs, les gènes bfr et dps1 sont induits en phase stationnaire de croissance par le facteur σS. Les travaux réalisés au cours cette thèse ont permis de caractériser les intervenants de l'homéostasie du fer chez E. chrysanthemi 3937, d'acquérir une vue globale du trafic intracellulaire du fer et d'en apprécier leur contribution respective dans la pathogénie.

L'induction par un hôte d'un stress oxydatif chez un parasite représente l'une des stratégies de défense chimique les plus répandues. Chez les Brassicacées, famille de plantes comprenant des espèces à fort intérêt agronomique comme le chou ou le colza, ou d'intérêt scientifique comme Arabidopsis thaliana, le stress oxydatif peut être généré soit par des formes actives d'oxygène libérées au niveau de la zone d'agression lors du burst oxydatif soit par des molécules issues du métabolisme secondaire de la plante telles que les isothiocyanates (ITC). Bien que fortement exposé à un tel stress lors de l'infection, Alternaria brassicicola, champignon pathogène nécrotrophe inféodé aux Brassicacées, est capable d'accomplir son cycle parasitaire et donc de s'y adapter. Cette thèse met en évidence que la tolérance du champignon aux stress oxydatif est partiellement dépendante du métabolisme du mannitol qui participe à la résistance des conidies lors du burst oxydatif in planta ou à la protection contre les dommages intracellulaires des FAO générées par les ITC lors des phases précoces de l'interaction. Les travaux réalisés montrent également que la charge fongitoxique des dérivés des glucosinolates peut être inhibée par leur conjugaison au glutathion via des Glutathion-Stransférases (GST) spécifiques. L'altération du métabolisme du mannitol ou l'inactivation de ces GST diminue significativement le pouvoir pathogène d'A. brassicicola et la régulation de ces voies métaboliques est donc à considérer dans l'optique de développer de nouvelles stratégies de protection des cultures.

Les nématodes à kyste du genre Globodera sont des vers microscopiques, hétérotrophes qui parasitent les racines des plantes essentiellement de la famille des Solanacées. Ces organismes sont des endoparasites obligatoires qui établissent une relation très étroite avec leur plante hôte. Ils peuvent ainsi se nourrir par le biais d'un site nourricier très élaboré. Celui-ci est mis en place grâce à des protéines sécrétées par le nématode, directement injectées dans les cellules végétales grâce à leur stylet (organe de la partie antérieure assimilable à une aiguille creuse). La fonction des protéines du pouvoir pathogènes identifiées est très souvent inconnue. Nous avons étudié la variabilité des gènes codant ces protéines au sein de la famille des nématodes à kyste ainsi que leur mode évolutif. Les gènes du pouvoir pathogène semblent avoir des tempos d'évolution nettement plus rapide que les gènes de ménage et semblent être soumis à des pressions de sélection diversificatrices.

Leptosphaeria maculans est un Dothideomycète phytopathogène capable d’alterner des modes de vie saprophyte, hemibiotrophe endophyte et nécrotrophe durant son cycle infectieux sur le colza. Afin de comprendre cette plasticité infectieuse, une mutagenèse aléatoire à grande échelle par ATMT a permis de générer une collection de 5000 transformants. L’objectif principal de cette thèse était d’exploiter cette collection en prenant avantage de la disponibilité d’outils de génomique, pour, d’une part, comprendre les mécanismes d’intégration de l’ADN-T dans le génome, et d’autre part, identifier des déterminants du pouvoir pathogène ciblés par l’ADN-T dans des mutants affectés dans leur capacité infectieuse. Une analyse systématique de 318 pieds d’insertion a été réalisée dans le but de d’évaluer les caractéristiques de l’insertion de l’ADN-T. Ce dernier est fréquemment inséré dans les régions actives riches en gènes, et favorise des gènes impliqués dans des processus biologiques indicatifs d’une conidie germante. Un biais marqué des insertions en faveur des régions régulatrices est observé ainsi qu’une corrélation entre la densité des insertions et le skew CG près du site d’initiation de la transcription. Ces observations sont cohérentes avec le modèle de ciblage intranucléaire de l’ADN-T. Enfin, l’existence de micro-homologies entre le site de pré-insertion et la bordure gauche de l’ADN-T indique une intégration par voie de recombinaison homologue (HR) et/ou microhomologue (MMEJ). Une approche multicritère a été utilisée pour caractériser cette collection. Un test d’inoculation a permis d’identifier 166 mutants altérés dans leur pouvoir pathogène. La validation génétique de la co-ségrégation entre le phénotype altéré et la présence de l’ADN-T indique que 44% des mutants montrant un déterminisme monogénique de l’altération sont effectivement étiquetés. Parmi les mutants altérés, 35 ont été analysé pour : (i) le phénotype de croissance en conditions usuelles de culture et en réponse aux stress oxydatif, UV et nutritif, (ii) le lien entre altération de la germination et pouvoir pathogène. Les gènes affectés par l’intégration de l’ADN-T, ont été identifié et analysé dans la souche sauvage à l’aide de données de transcriptomique. Ces cribles ont permis de décomposer le phénotype d’altération in planta en plusieurs phénotypes in vitro. Le plus fréquemment, les mutants ne sont pas altérés dans leur in vitro croissance, mais la plupart sont sensibles aux ROS. Les analyses d’expression au cours de l’infection indiquent que les gènes codant pour des effecteurs et ceux impliqués dans la détoxification des ROS, ont des dynamiques d’expression inverses et bi-phasiques, en lien avec le style de vie hemibiotrophe de L. maculans. Les 42 gènes ciblés par l’ADN-T dans ces mutants ont été identifiés et leur fonction putative disséquée par bioinformatique et transcriptomique. Au final, nous avons identifié six mutants d’intérêt pour une caractérisation fonctionnelle. Deux de ceux-ci deux ont atteint un niveau de caractérisation suffisant pour l’émission d’une hypothèse de travail. Dans le mutant µ1165, l’ADN-T cible un gène codant pour une protéine ribosomale S17 (LmRPS17), dont la régulation dépendrait de la voie de signalisation du complex TORC1. Nos résultats préliminaires suggèrent, d’une part, que TORC1 est une cible potentielle de LmRPS17 et, d’autre part, que la phase biotrophe de l’infection chez L. maculans est probablement régulée par TORC1 via l’enzyme de détoxication des ROS SOD2. Dans le mutant µ444, l’ADN-T cible un gène codant pour un élément rétroviral putatif LmHYP1, largement conservé parmi les ascomycètes. Nos résultats suggèrent que LmHYP1 interviendrait dans la régulation de gènes impliqués dans le pouvoir pathogène, via la production de petits ARN interférents issus hypothétiquement du clivage de son ARN messager par la machinerie de défense anti-rétrovirale. La validation de ces deux hypothèses est en cours au laboratoire. / The Dothideomycete phytopathogen Leptosphaeria maculans is capable to alternate saprophytic, hemibiotrophic, endophytic and necrotrophic life styles during a single infectious cycle on its host plant, Brassica napus. However, little is known about the determinants of such plasticity. As part of a large-scale insertional mutagenesis project aiming at the discovery of pathogenicity factors a collection 5000 transformants has been generated by ATMT. The main objective of my PhD was to take advantage of “omics” to extract biological value from L. maculans mutants collection for a better understanding of T-DNA integration features and further identification of pathogenesis determinants in this fungus. A systematic analysis of 318 T-DNA tags was performed in a large collection of transformants in order to evaluate the features of T-DNA integration in its particular TE-rich compartmentalized genome. The T-DNA integration was mainly targeted to gene-rich, transcriptionally active regions, and favored biological processes that are consistent with the physiological status of a germinating conidia. In addition, T-DNA integration was strongly biased towards regulatory regions, and mainly promoters. Consistently with the T-DNA intranuclear targeting model, the density of T-DNA insertion correlated with CG skew near the transcription initiation site. The existence of microhomologies between promoter sequences and the T-DNA LB flanking sequence was also consistent with T-DNA integration to host DNA mediated by homologous recombination and/or the microhomology-mediated end joining pathways. Based on this data, a multi-criteria approach was used to draw the more possible information from this collection by identifying all 166 mutants reliably affected in pathogenicity, and expanding the genetic analysis. Considering single-gene segregation of the pathogenicity phenotype, our data indicate a 44% ratio of actual tagging. In parallel, for a subset of 35 isolates of the collection, we (i) described growth patterns in regular culture conditions or in response to oxidative, UV or starvation stresses, (ii) evaluated the link between altered germination and pathogenicity, (iii) identified and annotated the genes putatively affected by the T-DNA integration, and (iv) analyzed kinetics of expression of these genes in the WT isolate using available microarrays. Our results showed that pathogenicity alteration phenotype could be broken down into a pattern of phenotypes in vitro including growth, germination defect and susceptibilities to oxidative burst, starvation and UV stresses. Our results showed that most of these mutants were not altered in axenic growth but showed enhanced sensitivity to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, our results showed that effectors and ROS scavengers have inverted dynamics during plant infection, consistently with the biphasic hemibiotrophic growth of L. maculans. Also, 42 genes targeted by the T-DNA in these mutants were recovered and dissected. This catalogue allowed us to identify a series of promising mutants for further functional studies. Based on this screening, six mutants were subjected to further analyses but only two reached sufficient advance for hypothesis building. In mutant µ1165, the T-DNA targeted a ribosomal protein S17 (LmRPS17), a downstream component of target of rapamycin complex 1 (TORC1) pathway. Our preliminary results suggested that TORC1 is a potential a target of LmRPS17. Also, biotrophic growth is probably tuned by TORC1 via Super oxide dismutase 2 (SOD2). In mutant µ444, the T-DNA targeted a retroviral-like element LmHyp1 widely conserved among ascomycetes. Our results suggest that LmHyp1 probably acts as a regulatory element during plant infection as its cleavage by the antiretroviral defences is hypothesized to generate siRNAs that silences distant genes. Work on these mutants is in progress.

Le genre Aeromonas regroupe des bactéries ubiquitaires vivant essentiellement dans les environnements hydriques. Ces pathogènes opportunistes de l’homme et de nombreux animaux possèdent un large répertoire de facteurs associés à la virulence. Bien que des pathotypes aient été proposés et que certaines espèces semblent plus fréquemment isolées en clinique humaine et vétérinaire, leur pouvoir pathogène demeure mal compris, notamment en raison du faible nombre d’études fonctionnelles et du manque d’investigations tenant compte de la diversité génétique et de la complexité des comportements biologiques du genre Aeromonas.Nous avons émis l’hypothèse que chez un pathogène opportuniste d’origine environnementale aussi polyvalent et ubiquitaire qu’Aeromonas, la structuration en complexes d’espèces avec une remarquable diversité génétique/génomique des populations, le polymorphisme des facteurs de virulence et les interactions au sein de communautés « pathogènes » puissent être des facteurs d’adaptation au comportement pathogène. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié i) la diversification au sein d’un complexe d’espèces, « A. media », utilisé comme modèle au moyen d’une étude de population intégrant la génétique et la phylogénie multilocus, les mécanismes d’évolution, la génomique comparative mais également les données phénotypiques, de modes de vie et d’habitats et, ii) la patho-génomique de facteurs de virulence reconnus (aérolysine, entérotoxines thermostable et thermolabile, exotoxine A, protéase à sérine, composants et effecteurs du système de sécrétion de type III, et flagelline latérale) pour une population représentative de la diversité des espèces actuellement connue dans le genre (30 espèces) et iii) le comportement pathogène in vivo (modèle Caenorhabditis elegans) et in vitro (cytotoxicité et cytoadhésion, production de biofilm, motilité) et la signalisation intercellulaire (quorum-sensing de type I) à l’échelle de populations impliquées dans les aéromonoses mixtes (5% des aéromonoses humaines) définies par l’isolement d’au moins 2 clones distincts d’Aeromonas.Le phénomène de spéciation décrit avec l’exemple du complexe A. media, agrégeant 3 espèces génomiques, démontre qu’Aeromonas possède une structure de population en complexes d’espèces dont la diversité génétique et génomique ainsi que les modes d’évolution (mutations et recombinaisons) révèlent divers potentiels adaptatifs et patho-adaptatifs associés à l’émergence de lignées. Au sein du complexe A. media, l’espèce A. rivipollensis semble plus adaptée à un mode de vie associé à des hôtes et possède des gènes spécifiques de résistance à des stress environnementaux. Aeromonas possède de nombreux facteurs de virulence présentant diverses histoires évolutives. Certains montrent une phylogénie dépendante de l’évolution du core-génome, suggérant l’implication de ces gènes dans des processus de spéciation en relation avec l’adaptation à diverses niches. L’étude des performances de PCRs de virulence a révélé des insuffisances majeures dans la sensibilité des méthodes évaluées principalement liées au polymorphisme génétique des facteurs de virulence. Nous avons également montré que des populations mixtes d’Aeromonas isolées d’échantillons cliniques pouvaient modifier le déroulement de l’infection en modèles in vivo et in vitro probablement par mécanisme de coopération ou de compétition avec mise en jeu de signaux de communication cellule-cellule.L’importante complexité d’Aeromonas retrouvée à travers la structure de population, le polymorphisme des facteurs de virulence et les comportements de multicellularité sont autant de facteurs potentiels d’adaptation au comportement infectieux qui permettent d’expliquer au moins en partie les difficultés rencontrées dans l’élucidation de pouvoir pathogène de ces bactéries. / Aeromonas groups ubiquitous bacteria mainly living in aquatic environments. These opportunistic pathogens for human and numerous animals have a large repertoire of virulence-associated factors. Although pathotypes were proposed and despite some species are more frequently isolated in human and animal infections, their pathogenicity is still poorly understood, mostly because very few comprehensive functional studies are available and because investigations taking into account the genetic diversity and the biological complexity within the genus are lacking.We assumed that for an opportunistic bacterial pathogen of environmental origin as versatile and ubiquitous as Aeromonas, the population structure in complex of species, the outstanding genetic/genomic diversity, the polymorphism of virulence factors and the interactions within pathogenic populations can act as factors driving the adaptation to a pathogenic behaviour. To test this hypothesis, we studied i) the diversification within “A. media”, a complex of species used as a model by a population study that included multilocus genetics, phylogenetics, evolutionary features, comparative genomics, as well as phenotypics, lifestyle and habitat ii) the patho-genomics of well-known virulence factors in aeromonads (aerolysin, thermolabile and thermostable enterotoxins, exotoxin A, serine protease, components and effectors of type III secretion system, and lateral flagellin) in a population that is representative of the known taxonomic diversity in the genus (30 species) and iii) the pathogenic behaviour using an in vivo model (Caenorhabditis elegans), an in vitro model (cytotoxicity, cytoadhesion, biofilm production, motility), and intercellular signals production (type I quorum-sensing) for populations involved in mixed aeromonosis, i.e. 5% of human aeromonosis defined by the isolation of at least 2 distinct clones.The phenomenon of speciation described in the complex “A. media” that aggregates 3 genomic species demonstrates that Aeromonas harbours a population structured in complexes of closely related species whose genetic and genomic diversity, as well as evolution mode (mutations and recombinations) reveal a wide adaptative and patho-adaptative potential linked to lineage emergence. Among the complex “A. media”, the species A. rivipollensis seems to be more adapted to a host-associated lifestyle and harbours specific genes for the resistance to environmental stress. Aeromonas has a wide range of virulence-associated genes, which presented diverse evolutive history. Some of them display a phylogeny linked to the core-genome evolution. These results suggest that these genes are involved in speciation processes probably related to niches adaptation. The evaluation of performances of virulence PCRs revealed major lacks of sensitivity of tested methods mainly due to the genetic polymorphism of the virulence factors. By using in vivo models and in vitro models, we also showed that Aeromonas mixed populations recovered from clinical samples could change the course of infection, likely through a cooperative or competitive mechanism that involves cell-to-cell signalling.The high complexity of Aeromonas results from its population structure, virulence factors polymorphism and multicellular behaviours. They are all putative adaptation factors to a pathogenic behaviour that may explain at least partially the difficulties encountered to elucidate pathogenicity of these bacteria.

Les espèces du genre Colletotrichum sont majoritairement des agents pathogènes de nombreuses plantes et provoquent des dégâts importants aux cultures partout dans le monde. Colletotrichum higginsianum est un champignon phytopathogène hémibiotrophe capable d’infecter de nombreuses Brassicaceae dont la plante modèle Arabidopsis thaliana. L’intérêt du pathosystème C. higginsianum – A. thaliana réside dans la possibilité de manipuler génétiquement les deux partenaires. Par ailleurs, la disponibilité de très nombreuses lignées transgéniques et d’outils génétiques aide à disséquer les mécanismes de résistance et de sensibilité de la plante. Nous avons re-séquencé (technologie PacBio) le génome de C. higginsianum afin d’obtenir les séquences complètes des 12 chromosomes. L’analyse détaillée de cette seconde version du génome a permis de mettre en évidence l’un des plus grands arsenaux fongiques de gènes du MS et de résoudre les problèmes de fragmentation de la première version du génome. Afin d’identifier les métabolites secondaires que C. higginsianum produit au cours de l’infection de la plante, nous avons supprimé des répresseurs du MS qui modifient l’état de la chromatine (Kmt1, Kmt6, Hep1, CclA) et sur-exprimé des inducteurs du MS (LaeA, Sge1) décrits chez d’autres mycètes. Grâce à des analyses de transcriptomique (RNA-Seq), des gènes du MS différentiellement exprimés dans ces mutants ont pu être identifiés. Ensuite, par des analyses de chimie analytique nous avons pu identifier et caractériser deux familles de métabolites secondaires. Enfin, nous avons mis en évidence des activités inédites pour ces deux familles de composés. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour aborder le déterminisme du pouvoir pathogène de C. higginsianum. / Colletotrichum spp. are major plant pathogens of numerous crops worldwide. Colletotrichum higginsianum uses a hemibiotrophic lifestyle to infect many members of the Brassicaceae including the model plant Arabidopsis thaliana. The C. higginsianum – A. thaliana pathosystem facilitates dissection of the mechanisms of plant resistance and susceptibility and the traits underlying fungal pathogenicity. Both partners can be genetically manipulated and powerful genetic tools and transgenic lines are available on the plant side. With a view to obtain a more complete inventory of C. higginsianum secondary metabolism (SM) genes, we re-sequenced the genome de novo using PacBio technology, providing 12 complete chromosome sequences. The in-depth analysis of this second version of the genome revealed one of the largest SM repertoires described to date for any ascomycete and solved numerous fragmentation problems in the first genome assembly. In order to identify secondary metabolites produced by C. higginsianum during plant infection, we deleted negative SM regulators that modify chromatin status (Kmt1, Kmt6, Hep1, CclA), and over-expressed positive SM regulators (LaeA, Sge1), all of which were well-described in other fungi. Using transcriptomics (RNASeq), we identified SM genes differentially expressed in these mutants. Using metabolite profiling, we also identified and characterised two families of secondary metabolites. Finally we describe novel biological activities for these compound families. These results provide new insights into the molecular basis of pathogenicity in C. higginsianum.

La bactériose vasculaire du riz (BLB) et bactériose non-vasculaire du riz (BLS), causées respectivement par Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) et X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), sont les deux plus importantes maladies bactériennes du riz. Ces maladies limitent le rendement de la production de riz dans les zones rizicoles en Asie et dans certaines régions d'Afrique. L'infection et la multiplication bactérienne dans les tissus de l'hôte dépendent souvent des facteurs de virulence de ces bactéries dont le type le système de sécrétion de type III (T3SS) et ses substrats. Dans cette thèse, nous avons identifié neuf effecteurs non-TAL (transcription Transcription activator-like) sécrétés par des effecteurs de type III de la souche chinoise 13751 de Xoo en utilisant le domaine d'induction HR de la protéine avirulente AvrBs1 comme gène reporter. Parmi eux, XopAE13751 a été expérimentalement confirmé pour la première fois comme étant un effecteur non-TAL. Ensuite, par l'analyse mutationnelle de ces gènes effecteurs identifiés dans Xoo, nous avons constaté que l'effecteur non-TAL XopR13751 était nécessaire pour la virulence de la souche chinoise de Xoo sur le riz hybride Teyou63. En parallèle, nous avons démontré que le gène rsmA (repressor of secondary metabolism) - comme le gène rsmAXoo de l'espèce chinoise Xoo 13751- régule positivement l'expression des gènes associés aux facteurs de virulence, tels que le système de sécrétion de type III, les enzymes extracellulaires et le DSF (diffusible signal factor). De plus, le gène effecteur non-TAL xopO s'est avéré être peu répandu chez les Xanthomonas puisqu'il est présent uniquement chez X. euvesicatoria (Xe) et Xoc mais est absent chez Xoo. En considérant les deux pathovars de X. oryzae, avec deux modes d'infection différents, xopO a été examiné comme un facteur de la spécificité du tissu par l'inactivation mutationnelle du gène dans Xoc et par l'expression du gène dans Xoo. Les résultats ont montré que xopO n'est pas la cause déterminante de la spécificité de tissu chez Xoc. Enfin, nous avons étudié les VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) comme outil de typage moléculaire rapide, fiable et rentable, pour améliorer le contrôle des épidémies et pour évaluer la structure de population des souches de Xoc. 28 loci candidats VNTR ont été prédits par le criblage de trois génomes de Xoc (souche philippine BLS256, souche chinoise GX01 et souche malienne MAI10). Des paires d'amorces pour l'amplification de PCR de chacun des 28 loci ont été conçues et testées à un pannel de 20 souches de Xoc provenant de l'Asie et de l'Afrique. Le séquençage des amplicons de PCR a confirmé 25 loci VNTR robustes et polymorphes communs entre les souches Xoc asiatiques et africaines. Un dendrogramme, construit à partir de la combinaison des 25 loci de VNTR (MLVA-25), a montré que la plupart des souches asiatiques sont clairement distinguables des souches africaines. Cependant, en accord avec de précédents rapports, une souche Malienne se distingue et semble être liée aux souches asiatiques, suggérant une introduction possible de souches sur le continent africain. Ce nouvel outil de typage basé sur les VNTR sera utile pour l'étude de structures de populations et pour la surveillance épidémiologique de Xoc. / Bacterial leaf blight (BLB) and Bacterial leaf streak (BLS), caused respectively by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), are two most important bacterial diseases on rice, constraining severely the rice yield in the rice-growing areas in Asia and in parts of Africa. Successful infection and bacterial multiplication in host tissue often depend on virulence factors from these bacteria including type Ⅲ secretion system (T3SS) and its substrates. In this thesis, we identified nine type Ⅲ secreted non-TAL (Transcription activator-like) effectors of Xoo Chinese strain 13751 using HR-inducing domain of avirulence protein AvrBs1 as the reporter, among them, XopAE13751 was first found experimentally to be non-TAL effector. Subsequently, through mutational analysis of these identified effector genes in Xoo, we showed non-TAL effector XopR13751 was found to be required for full virulence of Xoo Chinese strain in hybrid rice Teyou63. In parallel, we demonstrated that rsmA (repressor of secondary metabolism)-like gene rsmAXoo of Xoo Chinese strain 13751 positively regulated the expression of genes associated with virulence factors such as type Ⅲ secretion system, extracellular enzymes and diffusible signal factor (DSF). Furthermore, non-TAL effector gene xopO was found to be narrowly distributed in Xanthomonas, which was only present in X. euvesicatoria (Xe) and Xoc, but not in Xoo. Based on the consideration of two X. oryzae pathovars carrying two different infection ways, xopO was tested in host and tissue specificity by analysis of mutational analysis of the gene in Xoc and expression of the gene in Xoo. The results showed that xopO of Xoc did not function as a determinant in host and tissue specificity. Finally, we explored Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) as a fast, reliable and cost-effective molecular typing tool, to better monitoring epidemics and assess the population structure of Xoc strains. 28 candidate VNTR loci were predicted by screening of three Xoc genome sequences (Philippine strain BLS256, Chinese strain GX01 and Malian strain MAI10). Primer pairs for PCR amplification of all 28 loci were designed and applied to a panel of 20 Xoc strains originating from Asia and Africa. Sequencing of PCR amplicons revealed 25 robust and polymorphic VNTR loci which are shared among Asian and African strains of Xoc. A dendrogram was constructed from 25 VNTR loci-combinating data (MLVA-25), indicating that most Asian strains were clearly discriminated from African strains. However, in agreement with previous reports, one strain from Mali appeared to be related to Asian strains, pointing to a possible introduction of strains to the African continent. A detailed analysis of the evolutionary relationships among a larger set of Xoc strains from China will be presented, considering different spatial scales. In conclusion, a new VNTR-based tool useful for studies of population structures and epidemiological monitoring of Xoc was successfully established.