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Caractérisation de l'activité biologique de l'entérotoxine STb d'Escherichia coli à l'aide de membranes lipidiques artificielles et de cellules en cultureGonçalves, Carina January 2007 (has links)
Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.
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Caractérisation de l'activité biologique de l'entérotoxine STb d'Escherichia coli à l'aide de membranes lipidiques artificielles et de cellules en cultureGonçalves, Carina January 2007 (has links)
Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal
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Un nouveau clone et une nouvelle méthode pour la production et la purification de l’entérotoxine STb d’Escherichia coliKerhoas, Maud 08 1900 (has links)
Le gène de l’entérotoxine thermostable b (estB) d’Escherichia coli a été
fusionné au gène de la protéine liant le maltose (malE) dans le vecteur
pMAL-p via PCR. Par la suite, deux constructions plasmidiques ont été
realisées à partir de ce nouveau vecteur, nommé pMAL-STb. Dans un premier
temps, un marqueur hexahistidine (His6) a été ajouté entre malE et estB, et
dans un deuxième temps, un marqueur décahistidine (His10) a été placé en
amont de malE. La séquence signal de la protéine liant le maltose (MBP)
dirige l’exportation de la protéine de fusion du cytoplasme vers le périplasme,
où l’entérotoxine STb acquière sa conformation active. MBP est également
reconnue pour améliorer le rendement et la solubilité de la protéine passagère
tandis que le marqueur histidine, connu comme étant le meilleur marqueur
d’affinité pour la purification protéique, facilite sa purification jusqu’à
homogénéité. De plus, les gènes fusionnés sont sous le contrôle du promoteur
tac (Ptac), un promoteur fort et inductible. Suite à l’induction par l’IPTG, la
souche recombinante exprime une protéine d’environ 48 kDa, qui est
facilement identifiable par électrophorèse à partir du surnageant obtenu via
choc osmotique. Une séquence encodant un site de clivage spécifique au
facteur Xa est présente dans le plasmide afin de séparer les marqueurs MBP et
histidine de STb. Le clivage de la protéine de fusion avec le facteur Xa libère
MBP (42 kDa) attachée au marqueur histidine et un polypeptide de 5.2 kDa,
correspondant au poids moléculaire de STb mature. Avec cette méthode, nous
visons à obtenir une méthode plus efficace pour la production et la
purification de STb. / The heat-stable enterotoxin b gene (estB) of Escherichia coli was fused
to the gene for maltose-binding protein (malE) into the pMAL-p vector using
PCR. Afterward, two plasmid constructs were realized from this new vector,
named pMAL-STb. Firstly, a hexahistidine tag (His6) was added between
malE and estB and secondly, a decahistidine tag (His10) was placed upstream
of malE. The signal sequence of maltose-binding protein (MBP) directs the
export of the fusion protein from the cytoplasm to the periplasm, where the
enterotoxin STb acquires its active conformation. MBP is also known to
improve the yield and solubility of the passenger protein while the histidine
tag, viewed as the best affinity tag for protein purification, facilitates its
purification to homogeneity. Furthermore, the fused genes are controlled by
the tac promoter (Ptac), a strong inducible promoter. Following IPTG
induction, the recombinant strain expressed a protein of approximately 48
kDa, which is easily identified from osmotic shock fluid following
electrophoresis. A sequence encoding a factor Xa cleavage site is present in
the plasmid to separate MBP and histidine tags from STb. The cleavage of the
fusion protein with factor Xa generates the maltose-binding protein (42 kDa)
attached to the histidine tag and a polypeptide of 5.2 kDa, corresponding to
the molecular mass of mature STb. With this method, we aim at obtaining a
more efficient way to produce and purify STb.
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Étude d'un variant de la toxine STb produite par Escherichia coliTaillon, Christine 08 1900 (has links)
Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are a major cause of post-weaning diarrhea. STb is one of two heat-stable toxins produced by ETEC and is mostly associated with pathogenic porcine isolates. For the first time, a variant of the toxin was observed in a study in 2003. Our hypothesis is that STb variants are present in ETEC strains from Quebec. To screen for alterations at the gene level, a collection of 100 STb+ ETEC strains isolated from diseased pigs was randomly selected and analyzed. A total of 23 strains had a change from His12 to Asn. An association between the presence of the variant and virulence factors present in those strains was done. These strains were also positive for STa. Since this variant seems to be widely distributed in Quebec, we hypothesize that the variant has different biological properties compared to the wild-type STb. First, the secondary structure of the variant and wild-type toxin and their thermal stability was determined by circular dichroism. Both show similar structures and thermal stability. In addition, the binding affinity with the toxin receptor, the sulfatide, was determined by surface plasmon resonance. The affinity of the wild-type for the sulfatide is slightly superior to the variant. Finally, the internalization inside IPEC-J2 cells of the variant was compared to the wild-type. The variant is able to internalize more cells than the wild-type. Altogether, these results suggest that both the variant and the wild-type toxin are biochemically and structurally similar.
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Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulairesAlbert, Marie-Astrid 12 1900 (has links)
L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli
entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi.
L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales
humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement
compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la
cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur
fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes
murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante
dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les
NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de
sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide
est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des
lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux
lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du
type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb,
le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation
activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de
l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe
dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles
cellulaires représentatifs des conditions in vivo. / Heat-stable enterotoxin b (STb) is one of the toxins produced by enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) and its role in swine post-weaning diarrhea is well established.
Internalization of STb in intestinal human and rat epithelial cells has been shown by
previous studies. However, the uptake mechanism is still not fully understood, especially
in porcine jejunum epithelium, the in vivo STb target. Using flow cytometry, we studied
internalization of fluorescently-labelled STb in porcine epithelial intestinal IPEC-J2 and
murine fibroblast NIH3T3 cell lines. Our results revealed that STb is internalized in both
cell lines. Toxin uptake is not dependent on the temperature in IPEC-J2 cells, whereas it
is in NIH3T3 fibroblasts. Actin reorganization is only required for STb internalization in
NIH3T3 cells. However, membrane sulfatide, the toxin receptor, is similarly present in
both cell lines and similarly internalized with time at 37°C. Disruption of lipid rafts,
known to contain sulfatide, with inhibitors (methyl-βcyclodextrin or genistein), did not
affect toxin uptake in both cell lines. Altogether, these data indicate that STb
internalization mechanisms are cell-type dependent. Moreover, uptake can depend on host
cell activity or not. Sulfatide, the toxin receptor, is not directly involved in these
mechanisms. Uptake independent on cell activity occurs in porcine intestinal epithelium.
The cell activity-dependent uptake suggests an endocytosis, which requires actin
rearrangement and is not mediated by lipid rafts. STb internalization is therefore a
complex process varying upon cell type, which should preferentially be studied in cellular
models representative of in vivo conditions, such as porcine cell lines.
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Étude d'un variant de la toxine STb produite par Escherichia coliTaillon, Christine 08 1900 (has links)
Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are a major cause of post-weaning diarrhea. STb is one of two heat-stable toxins produced by ETEC and is mostly associated with pathogenic porcine isolates. For the first time, a variant of the toxin was observed in a study in 2003. Our hypothesis is that STb variants are present in ETEC strains from Quebec. To screen for alterations at the gene level, a collection of 100 STb+ ETEC strains isolated from diseased pigs was randomly selected and analyzed. A total of 23 strains had a change from His12 to Asn. An association between the presence of the variant and virulence factors present in those strains was done. These strains were also positive for STa. Since this variant seems to be widely distributed in Quebec, we hypothesize that the variant has different biological properties compared to the wild-type STb. First, the secondary structure of the variant and wild-type toxin and their thermal stability was determined by circular dichroism. Both show similar structures and thermal stability. In addition, the binding affinity with the toxin receptor, the sulfatide, was determined by surface plasmon resonance. The affinity of the wild-type for the sulfatide is slightly superior to the variant. Finally, the internalization inside IPEC-J2 cells of the variant was compared to the wild-type. The variant is able to internalize more cells than the wild-type. Altogether, these results suggest that both the variant and the wild-type toxin are biochemically and structurally similar.
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Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulairesAlbert, Marie-Astrid 12 1900 (has links)
L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli
entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi.
L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales
humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement
compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la
cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur
fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes
murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante
dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les
NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de
sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide
est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des
lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux
lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du
type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb,
le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation
activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de
l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe
dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles
cellulaires représentatifs des conditions in vivo. / Heat-stable enterotoxin b (STb) is one of the toxins produced by enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) and its role in swine post-weaning diarrhea is well established.
Internalization of STb in intestinal human and rat epithelial cells has been shown by
previous studies. However, the uptake mechanism is still not fully understood, especially
in porcine jejunum epithelium, the in vivo STb target. Using flow cytometry, we studied
internalization of fluorescently-labelled STb in porcine epithelial intestinal IPEC-J2 and
murine fibroblast NIH3T3 cell lines. Our results revealed that STb is internalized in both
cell lines. Toxin uptake is not dependent on the temperature in IPEC-J2 cells, whereas it
is in NIH3T3 fibroblasts. Actin reorganization is only required for STb internalization in
NIH3T3 cells. However, membrane sulfatide, the toxin receptor, is similarly present in
both cell lines and similarly internalized with time at 37°C. Disruption of lipid rafts,
known to contain sulfatide, with inhibitors (methyl-βcyclodextrin or genistein), did not
affect toxin uptake in both cell lines. Altogether, these data indicate that STb
internalization mechanisms are cell-type dependent. Moreover, uptake can depend on host
cell activity or not. Sulfatide, the toxin receptor, is not directly involved in these
mechanisms. Uptake independent on cell activity occurs in porcine intestinal epithelium.
The cell activity-dependent uptake suggests an endocytosis, which requires actin
rearrangement and is not mediated by lipid rafts. STb internalization is therefore a
complex process varying upon cell type, which should preferentially be studied in cellular
models representative of in vivo conditions, such as porcine cell lines.
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