Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Les mycotoxines sont des métabolites fongiques toxiques qui contaminent une variété d’aliments destinés à l’alimentation humaine et animale, notamment les céréales. Les porcs et les humains sont très sensibles aux mycotoxines. La mycotoxine zéaralénone (ZEN) se retrouve dans les aliments pour animaux et dans l'alimentation humaine principalement la suite d’une contamination fongique des céréales par Fusarium spp. la ZEA peut se fixer au 17-β-estradiol récepteur en raison de sa flexibilité, explique ses effets délétères sur les fonctions reproductives. Différentes stratégies de décontamination ont été développées pour réduire l’exposition des animaux d’élevage aux mycotoxines, parmi lesquelles des méthodes de conversion enzymatique de ZEN par certains micro-organismes. Cependant, les données préliminaires indiquent que certains de ces produits de biotransformation peuvent être reconvertis en ZEN. Des données récentes indiquent que Bacillus spp. S62-W peut phosphoryler ZEN sur ses 14e ou 16e carbones, la convertissant respectivement en ZEN-14-phosphate (ZEN-14-P) ou en ZEN-16-phosphate (ZEN-16-P). Cependant, la toxicité résiduelle et la stabilité de ZEN-14-P et de ZEN-16-P par rapport à ZEN sont encore inconnues. Cette étude visait à étudier la cytotoxicité, le stress oxydatif, l'activité pro-inflammatoire et l'activité œstrogénique des ZEN phosphorylés en utilisant des cellules épithéliales intestinales et endométriales porcines et humaines, ainsi que des explants d’utérus de cochettes prépubères. Nous avons également analysé les voies métaboliques de biotransformation des ZEN phosphorylés par les cellules porcines et humaines. Nos résultats ont démontré que l’exposition à ZEN-14-P ou à ZEN-16-P diminue significativement la viabilité des cellules intestinales porcines IPEC-J2 et des cellules endométriales humaines d’Ishikawa. ZEN, les produits de phosphorylation ont induit de manière significative un stress oxydatif dans les cellules IPEC-J2 à 10 µM. De même, 5 μM ou 25 μM de ZEN-14-P et ZEN-16-P ont activé de manière significative l'expression de cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-1β, IL-6 et IL-8 dans les cellules IPEC-J2 différenciées. Pour ce qui est des effets œstrogéniques, de manière similaire à ZEN, l'activité intracellulaire de la phosphatase alcaline a été augmentée de façon significative et dose dépendante par ZEN-14-P et ZEN-16-P, dans les cellules d'Ishikawa. Ces produits de phosphorylation ont également, à l’image de ZEN, activé de manière significative l'expression de gènes sensibles aux œstrogènes ALPP, ALPG, PGR, ESR1, ESR2 et GPER1 dans les cellules d'Ishikawa. Enfin, l’exposition à ZEN ou aux ZEN phosphorylés a induit la prolifération des glandes endométriales dans les explants utérins de cochettes prépubères. L'analyse LC-MS/MS des surnageants de culture cellulaire de IPEC-J2 et Ishikawa indique que, bien que les ZEN phosphorylés aient été partiellement hydrolysés en ZEN, leurs métabolites de phase I et de phase II sont différents de ceux de ZEN. Globalement, ces résultats indiquent que la phosphorylation ne réduit pas la toxicité de ZEN pour les lignées cellulaires porcine et humaine. De plus, les voies métaboliques impliquées dans la biotransformation de ZEN et celle des produits de phosphorylation sont différentes, ce qui suggère une toxicité intrinsèque des ZEN phosphorylés. / Pigs and humans are highly susceptible to mycotoxins, which are toxic fungal metabolites that contaminate a variety of food and feedstuffs. Among these, Zearalenone (ZEN) is found in the feed and food supply from Fusarium fungal contamination in cereals. ZEN is functionally similar to 17-β estradiol, and therefore exerts deleterious effects on reproductive functions. Different decontamination strategies are developed to reduce the exposure of farm animals to mycotoxins. At many of these, there are methods of biotransformation of ZEN by the enzymatic activity of certain microorganisms. Bacillus sp. S62 reportedly phosphorylates ZEN on its 14th or 16th carbons, yielding, ZEN-14-P and ZEN-16-P. However, the residual toxicity and stability of ZEN-14-P and ZEN-16-P compared to ZEN are still unknown. This study aimed to investigate the cytotoxicity, oxidative stress, pro-inflammatory activity, and estrogenic activity of phosphorylated ZENs, as well as its metabolic fate when incubated either with intestinal or reproductive cells. Our results showed that ZEN-14-P and ZEN-16-P did not decrease the cytotoxic effect of ZEN in porcine intestinal IPEC-J2 cells and human endometrial Ishikawa cells. ZEN and both phosphorylated ZENs significantly induced oxidative stress in IPEC-J2 cells at 10 µM. Likewise, 5 μM or 25 μM ZEN-14-P and ZEN-16-P altered the expression of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-8 in differentiated IPEC-J2 cells. In addition, intracellular activity of alkaline phosphatase increased by ZEN, ZEN-14-P and ZEN-16-P in Ishikawa cells. ZEN, ZEN-14-P and ZEN-16-P activated the expression of estrogen-responsive genes ALPP, ALPG, PGR, ESR1, ESR2, and GPER1 at 10 μM in Ishikawa cells. Furthermore, ZEN and phosphorylated ZENs induced the proliferation of endometrial glands in prepubertal gilt uterine explants at 30 µM. Finally, LC-MS/MS analysis of the supernatant of IPEC-J2 and Ishikawa cell cultures exposed to ZEN or its phosphorylated metabolites showed that the latter were partially hydrolyzed back to ZEN, but their phase-I and phase-II metabolites still differ from the ones of ZEN. Overall, these results suggest that phosphorylation does not reduce the toxicity of ZEN for pigs and humans. Moreover, different metabolic fate is involved in the biotransformation of ZEN and phosphorylation products.

In der vorliegenden Arbeit wurde in einem in vitro-Modell mit porcinen intestinalen Epithelzellen (IPEC-J2) der Einfluss des probiotischen E. coli Nissle 1917 (EcN) auf die Infektion mit atypischen EPEC (aEPEC) untersucht. EcN reduzierte bei Vorinkubation auf IPEC-J2 die aEPEC-Infektion drastisch. Konfokale Laserscanning- und Elektronenmikroskopie zeigten, dass EcN die Adhäsion und Mikrokoloniebildung inhibierte, jedoch nicht die Ausbildung von Attaching and Effacing-Läsionen adhärenter aEPEC. Der inhibierende Effekt von EcN wurde durch dessen sehr gute Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 vermittelt. Die F1C-Fimbrien wurden als wichtigster Adhäsionsfaktor von EcN identifiziert. Darüber hinaus waren auch H1-Flagellen durch Ausbildung interbakterieller Verbindungen maßgeblich an der Adhäsion des Stammes beteiligt. In gleichem Maß wie die Vorinkubation von EcN reduzierte die Koinkubation seines Kulturüberstandes die aEPEC-Infektion, was auf die Abgabe eines inhibierenden Faktors in den Kulturüberstand schließen lässt. Dieser Faktor wurde auch von anderen pathogenen sowie nicht pathogenen E. coli-Stämmen in Schüttelkultur gebildet und scheint deshalb nicht spezifisch für EcN zu sein. Jedoch ermöglichte erst die gute Adhäsionsfähigkeit von EcN auf der Epithelzelloberfläche die Abgabe ausreichender Mengen des Inhibitors und eine Beeinflussung der aEPEC-Infektion. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass durch EcN die initiale Anheftung von aEPEC an die Wirtszelle unterbunden wird. Der inhibierende Effekt von EcN auf die aEPEC-Infektion war zeitabhängig. Im Gegensatz zur Vorinkubation erhöhten Ko- und Nachinkubation von EcN die Adhäsion von aEPEC und hatten einen geringeren inhibierenden Effekt auf die Mikrokoloniebildung. Dieser gegensätzliche Effekt auf die Adhäsion von aEPEC wird möglicherweise von einem zweiten Faktor hervorgerufen. Dieser scheint nur dann wirksam zu sein, wenn der inhibierende Faktor in zu geringer Konzentration oder erst nach Adhäsion von aEPEC vorliegt. / In this study, the effects of the probiotic E. coli strain Nissle 1917 (EcN) on host cell infection with atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) were investigated in an in vitro porcine intestinal epithelial cell model (IPEC-J2). In pre-incubation experiments, EcN drastically reduced the infection efficiencies of aEPEC. Using confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy, it was shown that EcN inhibited the attachment and formation of microcolonies, but not the formation of attaching and effacing lesions by adherent aEPEC. The inhibitory effect was mediated by the adherent properties of EcN to epithelial cells. The F1C fimbriae were identified as the most important adhesion factor of EcN in vitro. Furthermore, the H1 flagellae were also shown to be involved in the adhesion of EcN, serving as bridges between bacterial cells. Co-incubation of culture supernatants of EcN reduced the infection efficiencies of aEPEC to the same extent as in pre-incubation with EcN bacteria, indicating the secretion of an inhibitory factor by EcN. This factor was also secreted by other pathogenic and non-pathogenic E. coli strains in shaking culture and therefore does not appear to be specific for EcN. However, the outstanding ability of EcN to adhere to epithelial cells largely contributes to the secretion of sufficient concentrations of this inhibitory factor und to the influence on the aEPEC infection. The results suggest that EcN interferes with the initial adhesion of aEPEC to host cells. The inhibitory effect of EcN was found to be time-dependent. In contrast to pre-incubation experiments, co- and post-incubation of EcN actually increased the adhesion efficiencies of aEPEC and showed only minor effects on microcolony formation. This second effect of EcN on aEPEC adhesion, possibly due to a second factor, appears only to be effective when the putative inhibitory factor is either present at low concentrations or after aEPEC is already adherent to host cells.