Die Detektion sogenannter Vitalitäts-assoziierte molekularer Muster (vita-PAMPs), signalisiert dem Immunsystem die Präsenz lebender Mikroorganismen und ruft verstärkte Immunantworten hervor. Die vorliegende Studie untersuchte die Erkennung bakterieller Vitalität durch humane Antigen-präsentierenden Zellen (APC), sowie die Effekte auf die adaptive Immunität. Transkriptomanalysen von humanen Monozyten zeigten eine selektive transkriptionelle Antwort auf lebendige im Vergleich zu hitzegetöteten Bakterien. Die inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF wurden nahezu ausschließlich in Reaktion auf lebende Bakterien exprimiert. Die Detektion bakterieller Vitalität ist in Menschen, Schweinen, Mäusen und Fischen konserviert. In Mäusen wurde bakterielle RNA als bakterielles vita-PAMP identifiziert. In menschlichen Monozyten führte die Supplementierung toter Bakterien mit bakterieller RNA oder mit synthetischen Liganden des Toll-like-Rezeptors (TLR) 7 und TLR8, jedoch nicht mit anderen TLR-Liganden, zur Rekonstitution der TNF- und IL-12-Antwort. Umgekehrt hemmte silencing von TLR8- vita-PAMP-induzierte Zytokinproduktion. T-follikuläre Helferzellen (TFH) spielen eine zentrale Rolle in der Initiierung humoraler Immunantworten. Hier wurde die Erkennung lebender Bakterien, bakterieller RNA oder synthetischer TLR8-Liganden durch APC als Stimulus für robuste TFH-Zelldifferenzierung identifiziert. Die TFH-Differenzierung ist abhängig von der Erkennung bakterieller RNA über TLR8 und der Produktion von IL-12. Immunisierung von Schweinen mit einem bakteriellen Lebendimpfstoff löste deutlich robustere TFH-Zell- und Antikörperreaktionen als eine Immunisierung mit der hitzegetöteten Version des gleichen Impfstoffs aus. Zusammenfassend haben wir TLR8 als den ersten bekannten vita-PAMP-Rezeptor identifiziert und seine zentrale Rolle für TLR8-vermittelte “Vitalitätserkennung” für die Induktion von TFH-Zellen und Impfreaktionen demonstriert. / The detection of the so-called vitality-associated molecular patterns (vita-PAMPs) signals to the immune system the presence of living microorganisms and triggers an increased immune response. The present study investigated the detection of bacterial vitality by human antigen-presenting cells (APC), as well as the effects of this recognition events on adaptive immunity. Transcriptome analysis of human monocytes showed a selective transcriptional response to live versus heat-killed bacteria. Among others, the inflammatory cytokines IL-12 and TNF were expressed almost exclusively in response to live bacteria. Moreover, the detection of bacterial vitality is conserved in humans, pigs, mice and fish. In mice, bacterial RNA was identified as a bacterial vita-PAMP. In human monocytes, supplementation of dead bacteria with bacterial RNA or with synthetic ligands of toll-like receptor (TLR) 7 and TLR8, but not with other TLR ligands, resulted in the reconstitution of the TNF and IL-12 responses. Conversely, silencing of TLR8 inhibited vita-PAMP-dependent cytokine production. T-follicular helper cells (TFH) play a central role in the initiation of humoral immune responses. Here, the recognition of living bacteria, bacterial RNA or synthetic TLR8 ligands by APCs was identified as a stimulus for robust TFH cell differentiation. TFH differentiation is dependent on the recognition of bacterial RNA via TLR8 and the production of IL-12. Immunization of pigs with a live bacterial vaccine elicited significantly more robust TFH cell and antibody responses than immunization with the heat-killed version of the same vaccine. In summary, we identified TLR8 as the first known vita-PAMP receptor in human and demonstrated its pivotal role in TLR8-mediated “viability recognition” for the induction of TFH cells and vaccine reactions.

Diese aus drei verschiedenen Studien bestehende Arbeit trägt mittels Verknüpfung von Anatomie (Struktur) und Physiologie oder Verhalten (Funktion) zu einem besseren Verständnis von somatosensorischer Informationsverarbeitung bei. In der ersten Studie untersuchten wir wie das Nervensystem der Ratte sich an das kontinuierliche Nachwachsen und Ausfallen der Tasthaare anpasst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Barrel-Kortex Neurone nach Auslenkung von sowohl jungen oder alten Tasthaaren ähnliche neuronale Antworten aufweisen. Wir konnten auch beobachten, dass junge und alte Tasthaare gemeinsam im Follikel innerviert werden und im Kortex nicht separat topologisch repräsentiert sind. Diese Ergebnisse könnten erklären wie die Stabilität von Wahrnehmung während fortlaufenden körperlich-sensorischen Veränderungen gewährleistet wird. In der zweiten Studie identifizierten wir Details der kortikalen Nasen Repräsentation und konnten zeigen, dass die Organisation von Schicht 4 im Somatosensorischen Kortex in Nagetieren konserviert ist. Wir fanden auch eine Kopplung von Nervenzellaktivität mit der Atmung, was für eine koordinierte Verarbeitung von Tastsinn und Atmung im Nasen-Somatosensorischen Kortex spricht. In der dritten Studie charakterisierten wir die kortikale Repräsentation der Schnauze im Hausschwein und konnten zeigen, dass dessen makroskopische, drei-dimensionale Erscheinung viele Details aufweist, die auch bei der tatsächlichen Schnauze zu finden sind. Ähnlich wie bei unseren histologischen Beobachtungen im Nasen- Somatosensorischen Kortex von Nagern konnten wir im Hausschwein Kortex eine Verjüngung von Schicht 4 der mutmaßlichen Repräsentation des Nasenlochs beobachten. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit i) einen potentiellen Mechanismus für Kontinuität der Wahrnehmung während körperlichen Veränderungen ii) Details der kortikalen Nasen-Repräsentation und dessen Verhältnis zur Atmung und iii) isomorphe Eigenschaften der kortikalen Schnauzen-Repräsentation im Hausschwein. / Topological mapping of body part representations in the brain have long been studied in neuroscience. In this thesis, three separate studies investigate such somatosensory representations by relating anatomy (structure) to physiology or behavior (function). In the first study we investigated whether and how the rat nervous system adapts to whiskers regrowth. We found that barrel cortex neurons displayed similar response properties to young and old whisker deflection and that both whiskers share their peripheral innervation in the same follicle. Our results further suggest that young and old whiskers do not form topologically distinct representations in the cortex. Such findings illuminate how perceptual stability is maintained despite the constant change of bodies and sensory structures. In the second study we identified the rodent nose somatosensory cortex and found that its tangential layer 4 organization is conserved across rodents. We also found significant respiration locked neural activity in the rat nose somatosensory cortex, suggesting coordinated processing of touch and respiration. In the third study we characterized the pig rostrum somatosensory cortex and found that its three-dimensional, gross organization matches the detailed structure of the actual rostrum appearance. We also found that layer 4 appears thinner in the putative nostril, similar to our results in the rodent nose somatosensory cortex. Collectively, our data i) reveal potential mechanisms for perceptual stability during bodily changes ii) identify the rodent nose somatosensory cortex and its relationship to respiration and iii) a striking isomorphism of the pig cortical rostrum representation with the pig snout.

ClC-6 und ClC-7 sind Chlorid/Proton Austauscher des späten endozytischen Wegs und lokalisieren entsprechend auf späten Endosomen und Lysosomen. Während die Relevanz von ClC-6 in der humanen Physiologie lange unerkannt war, hat ClC-7 seit lange eine etablierte Rolle als Gen, das, wenn mutiert, zu Neurodegeneration und verschiedenen Arten von Osteopetrose in Menschen führt, eine Pathologie, die von dicken und fragilen Knochen gekennzeichnet wird. Hier berichten wir über eine neue ClC-6Y553C de novo Mutation, die vor Kurzem in 3 unabhängigen Patienten entdeckt wurde, die unter einer früh-entstehenden neurodegenerativen Pathologie litten, die mit generellen Entwicklungsverzögerung, MRI Gehirn-Anomalien, Hypotonie und mangelhaftem Atem verbunden war. Mit-ClC-6Y553C-transfizierten Zellen zeigten ungewӧhnlich erhöhten Strömungen und Unempfindlichkeit an pH, was eine dramatische “gain-of-function” in dem nativen säuren Umfeld von späten Endosomen, wo ClC-6 exprimiert wird, darstellt. Zusätzlich erforschten wir die Relevanz von ClC-7 in der lysosomalen Funktion, um die molekulare Mechanismen besser zu verstehen, die hinter des lysosomalen Speicher und Osteopetrose steht, die in Menschen beobachtet werden, die von ClC-7 Mutationen betroffen sind. Zusammenfassend liefern wir Einblicke in den Konsequenzen von ClC-6 und ClC-7 Mutationen für Zelluläre Homöostase und unterstützen eine wichtige Rolle von ClC-6 und ClC-7 in endolysosomaler Funktion und, wenn mutiert, in humaner neurodegenerativen Pathologie. / ClC-6 and ClC-7 are chloride/proton exchangers of the late endocytic pathway and reside on late endosomes and lysosomes, respectively. While relevance in human physiology for ClC-6 has been long unknown, ClC-7 has an established role as a gene, that, if mutated, causes neurodegeneration and different types of osteopetrosis in humans, a sickness characterized by thick and fragile bones. Here we report a new ClC-6Y553C de novo mutation, recently reported in 3 unrelated patients, affected by an early-onset neurodegenerative disease leading to general developmental delay, MRI brain abnormalities, hypotonia and respiratory insufficiency. Transfected cells revealed abnormally enlarged currents and insensitivity to pH in the Y553C ClC-6 mutant, representing a dramatic gain of function in the native acidic environment of late endosomes, where ClC-6 is expressed. Additionally, we investigated the importance of ClC-7 in lysosomal function to better understand the molecular mechanisms behind the lysosomal storage and osteopetrosis observed in human patients affected by ClC-7 mutations. Collectively, we provide insight into the consequences of ClC-6 and ClC-7 mutations for cellular homeostasis and support a crucial role for both ClC-6 and ClC-7 in endolysosomal function and, if mutated, in human neurodegenerative disease.

HTT ist ein Protein, das durch seine Verbindung mit mehreren Interaktionspartnern an einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt ist. Darüber hinaus verursacht eine Mutation im HTT-Gen eine Krankheit, die als Huntington-Krankheit (HD) bezeichnet wird. Aufgrund der gerüstbildenden Eigenschaften von HTT wurde eine Vielzahl von Studien durchgeführt, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Die auf dem Resonanzenergietransfer (RET) basierenden Ansätze sind jedoch im Bereich der Huntington-Krankheit noch nicht vollständig genutzt worden. Daher habe ich versucht, solche Ansätze in Interaktionsstudien mit dem HTT-Exon 1 (HTTexon1) und dem Protein in voller Länge zu bewerten. Ich habe eine Benchmarking-Studie mit einem zuvor beschriebenen Huntingtin-interagierenden Protein (HIP) und HTTex1 (Wildtyp und mutiert) unter Verwendung eines BRET-Ansatzes durchgeführt. Meine Studien bestätigten die binäre Interaktion zwischen HTTex1 und sieben Proteinen. Ich habe auch drei Interaktionen mit der mutierten Version von HTTex1 bestätigt. Zusätzlich bewertete ich die Interaktionen durch FRET-Messungen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der zweite Teil dieser Arbeit zielte darauf ab, ein Hochdurchsatz-Screening für den Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) mit HTT in voller Länge (FL) unter Verwendung von Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer zu etablieren. Auf diese Weise konnte ich die Wechselwirkung zwischen FL HTT und einer Bibliothek von 580 Proteinkinasen bewerten. Schließlich analysierte ich die Spezifität der entdeckten Wechselwirkungen, indem ich die unspezifische Bindung durch Donor-Sättigungstests bewertete. Zusammenfassend belegen meine Ergebnisse die potenzielle Verwendung von Resonanzenergietransferansätzen zur Validierung von HTT-Wechselwirkungen. Außerdem wird ein neues Screening-Tool vorgestellt, das dazu beitragen soll, HTT-Interaktoren zu identifizieren und zu verifizieren. / HTT is a protein involved in a plethora of cellular processes through its association with several interaction partners. Furthermore, a mutation in the HTT gene, causes a disease denominated Huntington’s disease (HD). Due to the scaffolding properties of HTT, a large variety of studies have been performed to identify potential therapeutical targets. However, resonance energy transfer-based (RET) approaches have not been fully exploited in the HD field. Therefore, I aimed to evaluate such approaches in interaction studies using the HTT exon 1 (HTTexon1) as well as the full-length protein. I performed a benchmarking study with a previously described huntingtin interacting protein (HIP) and HTTex1 (wild type and mutated) using a BRET approach. My studies confirmed the binary interaction between HTTex1 and seven proteins. I also confirmed three interactions with the mutated version of HTTex1. Additionally, I also evaluated the interactions by measuring FRET using flow cytometry. The second part of this work aimed to stablish a high-throughput screening for the detection of protein-protein interactions (PPIs) with full-length (FL) HTT using bioluminescence resonance energy transfer. With this, I was able to evaluate the interaction between FL HTT and a library composed by 580 protein kinases. Finally, I analysed the specificity of the detected interactions by assessing unspecific binding through donor saturation assays. In summary my results provide evidence of the potential use of resonance energy transfer approaches to validate HTT interactions. Additionally, a new screening tool is presented to contribute to identify and verify HTT interactors.

Populationen kanzeröser Zellen können aus verschiedenen Subpopulationen mit distinkten phänotypischen Profilen bestehen. Diese Dissertation verwendet mathematische Modellierung sowie die Analyse von Einzelzell-Genexpressionsdaten zur Beantwortung von Fragen über die Entstehung, das Wachstum und die Behandlung von Tumoren im Kontext einer solchen intratumoralen Heterogenität. / Tumoural cell populations may consist of different subpopulations with distinct phenotypic profiles. This thesis applies mathematical modelling as well as the analysis of single-cell gene expression data to questions related to the emergence, growth and treatment of tumours in the context of such an intratumoural heterogeneity.

Im Laufe der Evolution haben Bakterienarten äußerst vielfältige und ausgeklügelte extrazelluläre Strukturen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, Substrate in ihre Umgebung abzugeben oder Wirtszellen während einer Invasion anzugreifen. Diese Sekretionssysteme sind an vielen bakteriellen Mechanismen wie Biofilmbildung, Zellmotilität, Virulenz oder Gentransfer und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beteiligt. Das Verständnis des Aufbaus und der Regulierung dieser Strukturen ist angesichts der zunehmenden Entwicklung multiresistenter Bakterien von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus geht der Aufbau solcher Strukturen unweigerlich auf Kosten wertvoller zellulärer Energieressourcen, was einen spannenden Parameter darstellt, um zu untersuchen, wie Bakterien den optimalen Mechanismus zum Ausgleich zwischen zellulären Mechanismen und Energieverbrauch wählen. Diese Arbeit konzentriert sich auf den Aufbau und die Regulierung bakterieller extrazellulärer Filamente, insbesondere des flagellaren Typ-III-Sekretionssystems (T3SS). Im ersten Kapitel werden Defekte in der Zellmorphologie aufgezeigt, die durch die Deletion des FlhE-Proteins während des Zusammenbaus der Flagellen verursacht werden, was die Bedeutung der Regulierung des Membranpotentials verdeutlicht. Das zweite Kapitel zeigt, dass der Assemblierungsmechanismus der Flagellen-Filamente, welcher dem Injektions-Diffusions-Modell entspricht, im Vergleich zu anderen Sekretionssystemen schneller ist und für die Energieerhaltung optimiert ist. Das dritte Kapitel untersucht die Rolle des Pilus beim Plasmid-Transfer, der mit einem Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) assoziiert ist, und liefert zusätzliche Hinweise darauf, dass der Pilus als Kanal für den Plasmid-DNA-Transfer dienen kann. Im letzten Kapitel wird ein neuer Biosensor zur Messung des Gehalts an bis-(3'-5')-zyklischem Diguanosinmonophosphat (c-di-GMP) entwickelt, einem entscheidenden Molekül in bakteriellen Mechanismen, die Zellmotilität und Biofilmbildung miteinander verbinden. Insgesamt bietet diese Arbeit Einblicke in die Regulation des flagellaren T3SS und des T4SS-Pilus, ein neues Werkzeug zur Untersuchung von c-di-GMP und Einblicke, wie Bakterien entscheidende Überlebensparameter und die Optimierung eines energiesparenden Aufbaus abwägen. / Through evolution, bacterial species have developed highly diverse and sophisticated extracellular structures enabling them to secrete substrates in their environment or to target host cells during invasion. Those secretion systems are involved in many bacterial mechanisms such as biofilm formation, cell motility, virulence or gene transfer and antibiotic resistance dissemination. Understanding the assembly and regulation of these structures is crucial due to the increasing development of multi-drug resistant bacteria. Moreover, the assembly of such structures inevitably comes at the cost of valuable cellular energy resources, representing an exciting parameter to study how bacteria selected the optimal mechanism to balance cellular mechanisms and energy consumption. This thesis focuses on the assembly and regulation of bacterial extracellular filaments, notably the flagellar type III secretion system (T3SS) flagellum . The first chapter reveals cell morphology defects caused by the deletion of the FlhE protein during flagellum assembly, highlighting the importance of membrane potential regulation . Chapter two illustrates that the flagellar filament assembly mechanism, following the injection-diffusion model, is faster compared to other secretion systems and optimized for energy conservation. The third chapter investigates the role of the pilus in plasmid transfer, associated with a type IV secretion system (T4SS), and gives additional evidence that the pilus may also act as a channel for plasmid DNA transfer. The final chapter develops a new biosensor for measuring bis-(3’-5’)-cyclic diguanosine monophosphate (c-di-GMP) levels, a crucial molecule in bacterial mechanisms linking cell motility and biofilm formation. Overall, this thesis provides insights into the regulation of the flagellar T3SS and the T4SS pilus, a new tool to study c-di-GMP, and how bacteria balance crucial survival parameters and energy-conserving assembly optimization .

TAD-Grenzen sind genomische Regionen mit Isolatorpotenzial, die zwischen benachbarten Chromatindomänen liegen und deren Unterbrechung zu einer pathologischen Genexpression führen kann. Die meisten TAD-Grenzen werden durch das CTCF gebunden, ein Architekturprotein, das Chromatinschleifen bevorzugt zwischen distalen Paaren von CTCF-Bindungsstellen (CBS) mit einer konvergenten Motivausrichtung bildet. An TAD-Grenzen sind die CBS häufig geclustert, wobei die Motive eine divergente Ausrichtung aufweisen und Chromatinschleifen in Richtung der stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Regionen projizieren. Wie die CTCF-Besetzung die Isolierung an TAD-Grenzen moduliert, ist immer noch nicht ganz klar. Hier habe ich die regulatorische Logik von CTCF-geclusterten TAD-Grenzen untersucht, indem ich genomweite Analysen und in vivo-Mausexperimente an der Epha4-Pax3-TAD-Grenze kombiniert habe. Analysen einzelner Deletionen zeigten einen deutlichen hierarchischen Beitrag von CBS zur Grenzfunktion. Im Gegensatz dazu zeigten kombinierte CBS-Deletionen ein gewisses Maß an funktioneller Redundanz und Kooperativität zwischen den Stellen. Diese Analysen zeigten auch, dass die abweichende Konfiguration der CBS, die immer wieder an TAD-Grenzen zu finden ist, für eine robuste Isolierung nicht unbedingt erforderlich ist. Genomweite Analysen haben gezeigt, dass es eine Untergruppe von CBS gibt, die unabhängig von der konvergenten Ausrichtung Chromatinschleifen bilden, wofür ich einen Mechanismus der "Schleifeninterferenz" vorschlage. Weitere Vergleiche ergaben, dass das Niveau der Genexpression von den Abständen zwischen Enhancer und Promoter im linearen Genom abhängen könnte. Durch die Quantifizierung der Isolierung der Grenzen, der Pax3-Fehlexpression und der Schwere der Gliedmaßenfehlbildungen konnte ich schließlich zeigen, dass die TAD-Grenzen die Genexpression und den Phänotyp quantitativ beeinflussen. / TAD boundaries are genomic regions with insulator potential located between adjacent chromatin domains, which disruption can cause pathological gene expression. Most TAD boundaries are bound by the CTCF, an architectural protein that forms chromatin loops preferentially between distal pairs of CTCF binding sites (CBSs) with a convergent motif orientation. At TAD boundaries, CBSs are frequently clustered, with motifs displaying a divergent orientation and projecting chromatin loops towards up and downstream regions. How CTCF occupancy modulates insulation at TAD boundaries still remains elusive. Here, I dissected the regulatory logic of CTCF-clustered TAD boundaries by combining genome-wide analysis and in vivo mouse experiments at the Epha4-Pax3 TAD boundary. Analyses of individual deletions revealed a distinct hierarchical contribution of CBS to boundary function. In contrast, combined CBSs deletions revealed a certain degree of functional redundancy and cooperativity between sites. These analyses also demonstrated that the divergent configuration of CBSs, recurrently found at TAD boundaries, is not strictly required for robust insulation. Genome-wide analysis highlighted the existence of a subset of CBSs that establish chromatin loops independently of the convergent orientation bias, for which I propose a mechanism of “loop interference”. This mechanism suggests that CBS forming a robust convergent loop can simultaneously form a non-convergent loop, by stalling Cohesin complexes extruded from both sides. Further comparisons revealed that gene expression levels might depend on enhancer-promoter distances in the linear genome. Finally, by quantifying boundary insulation, Pax3 misexpression and the severity of limb malformation, I demonstrate that TAD boundaries are quantitative modulators of gene expression and phenotypes. Overall, I highlight that TAD boundary composition and strength constitute a fundamental regulatory layer in developmental processes and disease.

Diese Arbeit erlaubt einen erweiterten Einblick in die Regulation c-di-GMP-abhängiger Prozesse im Rahmen der Makrokolonieentwicklung von E. coli K12 AR3110, darunter die heterogene Expression des Masterregulators der Biofilmbildung CsgD und die räumlich differenzierte Matrixproduktion. Es konnte erstmals die Verteilung des Signalmoleküls c-di-GMP dargestellt werden und auch die damit einhergehe Dynamik der RdcA/B-DgcE-vermittelten Expression von csgD innerhalb einer Makrokolonie aufgeklärt werden. Zusätzlich konnten weitere Mechanismen in der Kontrolle der CsgD-Aktivität und Proteolyse identifiziert werden; darunter seine zelluläre Aggregation in spezifischen Zonen der Makrokolonie und sein proteolytischer Abbau (durch Lon-Proteasen). Diese Ergebnisse lassen eine präzise gesteuerte Koordination beschriebener Prozesse annehmen, die durch die Entstehung vertikaler Nähr- und Sauerstoffgradienten vermittelt wird. In ihrer Gesamtheit führen sie zu einer räumlich geordneten Produktion und Anordnung von Curlifasern und pEtN-Cellulose in der Makrokolonie, die zur Ausbildung der komplexen dreidimensionalen Matrixarchitektur führen. Jedes einzelne Matrixelement weist dabei eine charakteristische Zusammensetzung und Anordnung auf, die mit spezifischen Materialeigenschaften einhergehen. So bilden sie eine biofilminterne Gerüststruktur aus, die als mechanische Grundlage für die Auffaltung angenommen werden kann. Mikroskopische Analysen konnten matrixfreie, lokal proliferierende Zellen als treibende Kraft darstellen. Sie sind für den Aufbau und auch den Ausgleich eines Kompressionsdrucks verantwortlich, der die Auffaltung überhaupt verursacht. In ihrer Gesamtheit zeigt diese Arbeit, dass sowohl matrixfreie als auch matrixproduzierende Zellen eine horizontale Ausbreitung der Kolonie ermöglichen, ohne den Biofilm und darin befindliche Zellen zu beeinträchtigen. Auf diese Weise sind sie essenziell für die Aufrechterhaltung der physischen Integrität und Homöostase der Makrokolonie. / This work allows further insight into the regulation of c-di-GMP-dependent processes within the development of macrocolonies of E. coli K12 AR3110, including the heterogeneous expression of the master regulator CsgD and spatially differentiated matrix production. For the first time, the distribution of second messenger molecule c-di-GMP was visualized along the macrocolony axis. Furthermore, this study was able to elucidate the dynamics of RdcA/B-DgcE-controlled csgD expression and find additional mechanisms in the control of CsgD activity and proteolysis; including its cellular aggregation in specific zones and its proteolytic degradation by Lon-Preoteases. Overall, these results suggest a very precise coordination of cellular processes that depend on the presence of vertical oxygen and nutrient gradients which lead to a spatially defined production and arrangement of curlifibres as well as pEtN-Cellulose within the macrcocolony. This results in the formation of a complex three-dimensional matrix architecture with each individual matrix element exhibiting a characteristic composition and arrangement associated with specific material properties. That way they form a biofilm-internal scaffolding structure that represents the mechanical basis for macrocolony folding. Microscopic analyses were able to identify matrix-free and locally proliferating cells as driving force. They seem to be responsible for both creating as well as releasing pressure on matrix structures that causes buckling up in the first place. Taken together, this work shows that both matrix-free, proliferating cells and matrix-producing cells enable the horizontal spreading of the macrocolony without affecting the biofilm and cells located within. Thus, they are essential for maintaining physical integrity and homeostasis within the macrocolony.

Die Erweiterung des grundlegenden Verständnisses der molekularen Mechanismen der Entwicklung, Organisation und Funktion des Neokortex ist ein Schlüssel zur Erforschung von Entwicklungsstörungen des Gehirns und zur Erarbeitung neuer Therapieansätze. Hier untersuchten wir die molekularen Mechanismen stromabwärts von Transkriptionsfaktoren der Neurod-Familie in der neokortikalen Entwicklung der Maus. Neurod1, Neurod2 und Neurod6 sind zentrale Regulatoren der neuronalen Differenzierung, Spezifikation und Axonführung. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Neurod-Transkriptionsfaktoren über ein Zwischenmolekül den Tbr2-Transkriptionsfaktor unterdrücken, um eine ordnungsgemäße neuronale Migration und Differenzierung sicherzustellen. Die verlängerte ektopische Tbr2-Expression stört die neuronale Migration, Somagröße und dendritische Verzweigung in embryonalen und postnatalen Perioden. Wir untersuchen den genetischen Crosstalk zwischen Neurod1/2/3- und WWP1/2/miR-140-Wegen zu ihrem gemeinsamen nachgeschalteten Ziel Tbr2 und zeigten, dass diese Wege unabhängig voneinander auf Tbr2 konvergieren. Wir identifizieren neue nachgeschaltete Ziele von Neurod-Transkriptionsfaktoren wie Kcnq3, Bhlhe22 und Prdm8 und demonstrieren ihre entscheidende Rolle bei der richtigen Corpus Callosum-Etablierung. Darüber hinaus wird in dieser Forschung ein In-vitro-System zur Untersuchung der Callosom-Axon-Führung entwickelt und etabliert. Wir stellen fest, dass die Sh3gl2-Expression unter der Kontrolle von Neurod-Transkriptionsfaktoren steht und die Eliminierung von Sh3gl2 zu einer verzögerten Bestimmung des Zellschicksals führt. Wir nehmen an, dass die beeinträchtigte Sh3gl2-Expression in Neurod2/6 dKO- und Neurod1/2/6 tKO-Mutanten die Clathrin-unabhängige Endozytose und die anschließende Internalisierung von Membranrezeptoren stört, was zu einer Störung der Cortex-Zytoarchitektur führt. / Expanding the fundamental understanding of the molecular mechanisms of neocortex development, organization, and function is a key to investigating brain developmental disorders and elaborating new therapeutic approaches. Here, we studied the molecular mechanisms downstream of Neurod family transcription factors in mouse neocortical development. Neurod1, Neurod2, and Neurod6 are pivotal regulators of neuronal differentiation, specification, and axon guidance. In this study, we demonstrated that Neurod transcription factors via an intermediate molecule, repress the Tbr2 transcription factor to ensure proper neuronal migration and differentiation. The prolonged ectopic Tbr2 expression disrupts neuronal migration, soma size and dendritic branching in embryonic and postnatal periods. We investigated the genetic crosstalk between Neurod1/2/3 and WWP1/2/miR-140 pathways to their common downstream target Tbr2 and showed that these pathways converge on Tbr2 independently of each other. We identified new downstream targets of Neurod transcription factors such as Kcnq3, Bhlhe22, and Prdm8, and demonstrated their crucial role in the proper Corpus Callosum establishment. Moreover, an in-vitro system for investigation of the callosal axons guidance was developed and established in this research. We detected that Sh3gl2 expression is under Neurod transcription factors control and the Sh3gl2 elimination results in the delayed cell fate specification. We hypothesize that impaired Sh3gl2 expression in Neurod2/6 dKO and Neurod1/2/6 tKO mutants disrupts the clathrin- independent endocytosis and subsequent membrane receptors internalization, that leads to disturbance of cortex cytoarchitecture.

Das Glioblastom (GBM) repräsentiert den am schwierigsten zu behandelnden primären soliden Tumor des Zentralnervensystems dar, trotz der intensiv wachsenden Zahl von Studien zu seinen molekularen und zellulären Eigenschaften. Obwohl die GBM-Therapie aggressiv ist und chirurgische Resektion, Strahlentherapie und Chemotherapie umfasst, ist ein Wiederauftreten des Tumors unvermeidlich. Die GBM-Behandlungsresistenz ist mit genetischer und zellulärer Heterogenität sowie phänotypischer Plastizität verbunden. Um das Verständnis der Heterogenität des Glioblastoms zu vertiefen, haben wir maßgeschneiderte genetische Tracing-Strategien für subtypspezifische Transkriptionszustände aus Glioblastom-Patientensignaturen entwickelt. In GBM-Zellen ermöglichte uns unsere neuartige Technologie, intrinsische und nicht-zellautonome Bestimmungsfaktoren von Zellzuständen zu identifizieren. In vitro und in vivo konnten wir zeigen, dass sich der mesenchymale GBM-Subtyp als adaptive Identität in Gegenwart von Mikroumgebungssignalen ausbildet und durch Entzündungs- und Differenzierungsprogramme reguliert wird. Wir haben gezeigt, dass die Ausbildung eines mesenchymalen Zellzustand adaptiv und reversibel ist und durch verschiedene Auslöser wie externer Signaltransduktion und ionisierende Strahlung mit teilweise überlappenden transkriptionellen Signaturen eingenommen werden kann. Insbesondere konnten wir mithilfe synthetischer Locus-Kontrollregionen (sLCRs) eine Interaktion zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und Glioma-Zellen aufdecken, wodurch die Tumorzellen in einen mesenchymalen Zustand versetzt wurden, der mit einer erhöhten Resistenz gegen Chemotherapie verbunden ist. Hier bauen wir auf diesem innovativen Ansatz auf, um Übergänge von Zellzuständen in komplexen biologischen Umgebungen zu verfolgen, mit einem Schwerpunkt auf der zellulären Wechselwirkung zwischen gesunden und Tumorzellen im Zusammenhang mit phänotypischer Plastizität und therapeutischer Resistenz. Darüber hinaus bietet diese Methode ein breites translationales Potenzial für die Anwendung auf andere Forschungsgebiete, einschließlich der Entwicklungsbiologie oder der regenerativen Medizin. / Glioblastoma (GBM) remains the most difficult primary solid tumor of the central nervous system despite the intensively growing body of research on its molecular and cellular characteristics. Whereas GBM treatment is aggressive and involves surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, tumor recurrence is unavoidable. GBM treatment resistance is associated with genetic and cellular heterogeneity, as well as phenotypic plasticity. To improve understanding of Glioblastoma heterogeneity, we developed custom genetic tracing strategies for subtype-specific transcriptional states from Glioblastoma patient signatures. In GBM cells, our novel technology enabled us to identify intrinsic and non-cell autonomous determinants of cell fate commitment. In vitro and in vivo, we discovered that the mesenchymal GBM adapts in the presence of microenvironmental signaling and is regulated by inflammatory and differentiation programs. We demonstrated that cell fate commitment towards a mesenchymal state is adaptive and reversible and occurs through partially overlapping transcriptional responses, including external signaling and ionizing radiation. Importantly, using synthetic locus control regions (sLCRs), we were able to uncover crosstalk between innate immune cells and glioma-initiating cells, directing the tumor cells into a mesenchymal state linked to increased resistance to chemotherapy. Here, we build on this innovative approach to trace cell fate transitions in complex biological settings, with a focus on the cellular crosstalk between malignant and non-tumor cells in the context of phenotypic plasticity and therapeutic resistance. Beyond that, this method offers the broad translational potential to be applied to other fields of research, including developmental biology or regenerative medicine.