Das Endoplasmatische Reticulum (ER) bildet ein ausgedehntes Netzwerk aus Membran-tubuli und abgeflachten Zisternen in der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines Extraktes der Eier von Xenopus laevis ein in vitro System zur Bildung der polygonalen Membrannetzwerke des ER entwickelt. In diesem System wurde zum ersten Mal eine Mikrotubuliunabhängige Bildung der Membrannetzwerke des ER demonstriert und damit die Existenz Mikrotubuli-unabhängiger Mechanismen für ihre Bildung. Die Membrantubuli entstehen durch die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander. Diese Fusion allein, die unabhängig von Cytosol ist, ist jedoch nicht ausreichend, da durch die Fusion in Abwesenheit von Cytosol lediglich große, kugelförmige Membranvesikel entstehen. Vielmehr ist eine unbekannte cytosolische Aktivität notwendig, damit die Fusion zur Bildung von Membrantubuli und Netzwerken führt. Mit dem in vitro System wurde die Voraussetzung für die Identifizierung dieser Mikrotubuli-unabhängigen, cytosolischen Aktivität geschaffen. Das Verhalten des ER in vitro ähnelt dem des ER in Zellen. Werden Zellen mit Calcium-Ionophoren behandelt, so deassembliert das ER, während in vitro die Bildung des ER durch hohe Konzentrationen von Ca2+ verhindert wird. In der Mitose deassembliert das ER in Abhängigkeit vom Zelltyp zu einem unterschiedlichen Ausmaß. Analog wird das ER in vitro zu einem unterschiedlichem Ausmaß gebildet, abhängig von der Art, in der die zugegebenen mitotischen Cytosole hergestellt wurden. Die Kernhülle hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Zisternen des ER und des Golgi-Apparates. In dieser Arbeit wurde die Bildung des Zellkerns in einem zellfreien System etabliert, das den für die ER-Bildung eingesetzten Extrakt verwendet. Einzelne Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden in einem vereinfachten Kernbildungssystem untersucht. Dabei wurde ein neuer Schritt in diesem Prozeß entdeckt: Das Abflachen von Chromatin-gebundenen Membranvesikeln auf der Oberfläche des Chromatins. Die hierfür verantwortliche Aktivität befindet sich in der cytosolischen Fraktion. Ohne Cytosol binden die Kernmembranvesikel an das Chromatin und fusionieren miteinander, die resultierenden großen Membranvesikel bleiben jedoch kugelförmig, flachen nicht ab und können keine Kernhülle bilden. Die Identifizierung der cytosolischen Faktoren, die an dem Abflachen der Membranen bei der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrantubuli des ER beteiligt sind, sollte Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismen geben und zeigen, ob verwandte Mechanismen an der Bildung ähnlicher Membranstrukturen in der eukaryontischen Zelle beteiligt sind.

Ein wirksames Immunsystem erfordert das Zusammenspiel von zellulären und humoralen Komponenten, die sich in den frühen Lebensphasen der Organismen entwickeln. Die meisten Zellen, die in die Immunantwort involviert sind, leiten sich aus Stammzellen des Knochenmarks ab. Deshalb wurde bei Organismen ohne Endoskelett - den Invertebraten - keinerlei Fähigkeiten zu Immunreaktionen angenommen. Der Evolutionserfolg der Invertebraten zeigt jedoch, daß sie in der Lage sind, sich pathogenen Keimen und Parasiten erfolgreich zu widersetzen. Markant für viele immunologische Prozesse in Invertebraten ist die äußerst starke Erstreaktion (Humphreys und Reinherz, 1994). Die vorgelegten Untersuchung wurde an einer nicht induzierbaren, sondern natürlichen vorkommenden Erstreaktion (lytischen Aktivität) durchgeführt. Die Analyse des lytischen Prozesses schloß neben der Isolierung und Charakterisierung eines Hämolysins (Eiseniapore) aus Eisenia fetida fetida und eines Eiseniapore-regulierenden Faktors (ERF) - einem hier erstmals nachgewiesenen Hämolysin- Regulator bei Invertebraten - die Aufklärung der Eiseniapore -Membran- Wechselwirkung an Lipidmembranen ein. Hierbei bildeten Leakage-messungen an Liposomen mit unterschiedliche r Lipidzusammensetzung einen experimentellen Schwerpunkt. Diese Messungen ermöglichten zum einen die Identifizierung des Lipidrezeptors Sphingomyelin, der die Bindung Eiseniapores an der Targetmembran vermittelt, und zum anderen geben sie einen Hinweis auf eine spezielle Wechselwirkung von Sphingomyelin mit Cholesterol. Die Einteilung tierischer Toxine erfolgt nach Bernheimer (1996) in einer ersten Grobansprache in Sphingomyelin-inhibierbare und in Thiol-aktivierbare Proteine. Eiseniapore ist das erste beschriebene Toxin, daß sich in diese dichotome Ordnung nicht einteilen läßt, da es durch Thiolgruppen aktiv iert werden kann und außerdem durch Sphingomyelin inhibierbar ist. Trotz der Fähigkeit der unmittelbaren Erkennung ohne vorherigen Kontakt gelten die Immunantworten der meisten Invertebraten als sogenannte 'langsame Immunreaktionen' (Humphreys und Reinherz, 1994). Mit den in dieser Arbeit vorgestellten Leakagemessungen werden zum ersten Mal sehr schnelle Reaktionen bei Anneliden beschrieben. Die Kinetik des Leakagevorgangs folgt einer Reaktion 2. Ordnung, woraus geschlossen werden kann, daß Eis eniapore an einem Punkt des Leakageprozesses als Dime agier t. Die Sekundärstruktur Eiseniapores erfährt während der Membranbindung keine signifikante Änderung: 37% b-sheet, 28% a-helix, 17% b-turn und 18% Zufallsknäuel. Somit gehört Eiseniapore zu den wenigen membranaktiven Toxinen mit einem hohen Anteil an b-sheet Strukturen, einer Gruppe von Proteinen, über die im Gegensatz zu den a-helikalen Proteinen nur sehr wenig Informationen vorliegen (van der Goot et al., 1997). Durch Elektronenmikroskopie und Elektrophorese wurde die eigentliche lytische Struktur an der Targetmembran identifiziert. Es ist eine Proteinpore, bestehend aus sechs Eiseniapore-Monomeren, die einen Tunnel in der Membran bilden, der anderen Porenformern (Komplement) gleicht. Da lytische Proteine für viele Organismen beschrieb en werden konnten, wurde für die Klassifikation der gewonnen en Details untersucht, ob die membrandestabilisieren den Vorgänge jeweils analog oder homolog zu denen anderer lytischer Proteine sind. Für die lytische Aktivität in E. fetida ssp. wurde bisher eine Analogie (funktionsgleiche Struktur) zu lytischen Proteinen des Komplementsystems verneint (Roch et al., 1995). Die vorgelegten Ergebnisse zeigen jedoch, daß es für die Annahme einer Analogie von Eiseniapore mit dem lytischen Komplex des Komplements zahlreiche Anhaltspunkte gibt. Ein Indiz für die immunologis che Verwandtschaft von Eiseniapore mit der Komplementkomponente C9 und des ERF mit dem Komplementregulator Vitronectin ist neben der gezeigten Kreuzreaktionen der Nachweis, daß der ERF neben der Eiseniapore- auch die Komplement-vermittelte Hämolyse inhibiert, wie auch Vitronectin die Eiseniapore- und die Komplement-induzierte Hämolyse unterdrückt. Dies demonstriert erstmals die Funktionsähnlichkeit lytischer Proteine aus den Stämmen Oligochaeta und Mammalia.

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit den Problemen der Taxonomie und Phylogenie sowie der Identifizierung der Familie Arhrodermataceae (Dematophyten). Da die konventionelle Identifizierungsmethode der Dermatophyten bis heute ein Problem darstellt, wurde hier zur Lösung der Fragestellungen die Geasamt-ITS Region (Internal Transcribed Spacer) und das PCR-Fingerprinting verwendet. Zur Analyse der Taxonomie und Phylogenie wurde die Gesamt-ITS-Region von 72 Arthrodermataceae-Isolaten mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Ausgehend von den Sequenzdaten wurden phylogentische Stammbäume mittels Parsimonie- und Neigbour-Joining-Analysen generiert. In den beiden Analysen bildeten die Dermatophyten eine monomorphe Gruppe mit Arachniotus ruber und Chysosporium keratinophilum als Außengruppen. Dabei war die Gattung Trichophyton polyphyletisch und die Gattung Microsporum paraphyletisch. Die Vertreter der Gattung Epidermophyton wurden in weit entfernten Gruppen gefunden. Die 6 T. mentagrophytes Varianten bildeten in der Analyse 3 Komplexe, die eine enge Verwandtschaft zu anderen Spezies der Familie Arthrodermataceae zeigten. T. rubrum seine Variante granulare, T. fischeri, T. kanei, T. megninii, T. soudanense und T. violaceum sind so eng miteinander verwandt, daß in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagen wurde, sie als Varianten von T. rubrum einzuordnen. Das Gleiche gilt auch für den M. canis-Komplex (M. canis Variante distortum, M. audouinii und seine Varianten, M. equinum, M. ferrugineum und Arthroderma otae). Diese Schlußfolgerungen beruhen auf den Ergebnissen des PCR-Fingerprinting, den Vergleichen der ITS-Sequenzen (Variationsindex) und auf die Ähnlichkeiten der morphologischen bzw. biochemischen Merkmalen der jeweiligen Spezies. Mit PCR-Fingerprinting war es möglich, die Dermatophytenspezies anhand ihrer charakteristischen PCR-Fingerprintingmuster zu identifizieren. Schwierig war die Differenzierung zwischen den Subspezies bzw. zwischen den Anamorphen und ihren Teleomorphen. Diese Methode wurde dann zur Identifizierung von klinischen T. tonsurans in einer Epidemiestudie bei Ringern verwendet. Aus dem variablen Teil der ITS 2-Sequenz wurde eine Sonde (TR20S-Sonde) entwickelt, die für T. rubrum spezifisch war. Die Spezifität der Sonde konnte anhand der Hybridisierung mit der Gesamt-ITS-Region von 50 verschiedenen klinischen T. rubrum-Isolaten, 57 verschiedenen Spezies der Familie Arthrodermataceae und 10 anderen dermatologischen Infektionserregern nachgewiesen werden. / The present work deals with problems of taxonomy and phylogeny as well as with the identification of the family Arhrodermataceae (Dermatophyten). Since conventional methods for the detection of dermatophytes are often difficult, we analysed sequences of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) and data obtained by a PCR fingerprinting method to solve phylogenetic and identification questions. The whole ITS region of 72 Arthrodermataceae isolates was amplified and sequenced. Phylogenetic relationships among these dermatophytes were reconstructed using parsimony and neighbour joining methods which lead both to a highly similar topology for the family Arthrodermataceae. In both phylogenetic pedigrees the species of the family Arthrodermataceae formed a monophyletic group with Arachiotus ruber and Chrysosporum keratinophilum as outgroups. Within the family Arthrodermataceae the genus Trichophyton is polyphyletic and the genus Microsporum paraphyletic. The genus Epidermophyton does not represent a monophyletic group as could be expected from the conventional systematics Based on the comparisons of the ITS sequences(variation index), on the results of PCR fingerprinting, and on similarities of the morphological and biochemical features of the respective species the following conclusions can be drawn: Trichophyton mentagrophytes and its 6 various variants belonged to 3 different complexes. Complex I was closely related to T. tonsurans, complex II to T. schönleinii and complex III to T concentricum and T. verrucosum. rubrum , T. rubrum var. granulare, T. fischeri, T. kanei, T. megninii, T. soudanense and T. violaceum formed a monophyletic group. According to our results these species should be considered as variants of T. rubrum. It has been also suggested that the members of the M. canis complex, M. canis variant distortum, M. audouinii and its variants, M. equinum, M. ferrugineumand Arthroderma otae seem to be rather variants of M. canis than different species. Various dermatophyte species could be identified based on their PCR fingerprinting profiles. In an epidemic study among wrestlers this technique has been successfully employed to identify clinical isolates of T. tonsurans. However, the differentiation between subspecies and between anamorphs and its teleomorphs was not always possible. From the variable part of the ITS2 sequence a probe specific for T. rubrum (TR20S) was developed. The specificity of the probe was proved by the hybridization of this probe to the amplified ITS region of 50 different clinical T. rubrum isolates, 57 strains of different species of the family Arthrodermataceae and 10 other dermatological agents.

Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen weiteren Schritt zur Aufklärung der visuellen Kaskade beizutragen. Erstmals konnten die Enthalpieänderungen für den G-Protein-Zyklus und dessen Teilreaktionen im Titrationskalorimeter am rekonstituierten System bestimmt werden. Der G-Protein-Zyklus Der Photorezeptor Rhodopsin katalysiert in seinem lichtaktivierten Zustand (R*) die Aktivierung des G-Proteins Transducin (Gt) durch Austausch von GDP gegen GTP in der Nukleotidbindungstasche von Transducin. Durch die intrinsische GTPase des G-Proteins, wird GTP hydrolysiert und Gt kehrt in den inaktiven Zustand zurück. Die Titration von GTP zum Komplex aus lichtaktiviertem Rhodopsin und Transducin (R*G-Komplex) ergab für den gesamten G-Protein-Zyklus eine Reaktionsenthalpie von - 4.6 ± 0.8 kcal pro Mol GTP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den in der Literatur aufgeführten Werten für die Reaktionsenthalpie der Hydrolyse von ATP zu ADP (- 4.9 kcal/Mol; Gajewski et al., 1986 [22 ]). Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus waren nicht direkt durch Titrationsexperimente zugänglich. Durch Variation der Konzentrationen der einzelnen Reaktionspartner konnten jedoch die unterschiedlichen Phasen des Wärmesignals zu Teilschritten des Zyklus zugeordnet und deren Reaktionsenthalpien bestimmt werden. Die R*G-Komplexbildung Der Bindung von R* an GGDP sind mehrere Reaktionen untrennbar überlagert. Die gemessene Enthalpieänderung von + 2.0 kcal/Mol ist die Summe der Wärmeänderungen durch Abgabe des an G[alpha] gebundenen GDP, Bindung von R* an Transducin und die Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen den Rhodopsin Intermediaten MI- und MII-Rhodopsin bei dieser Bindung.Die Komplexdissoziation Unter Verwendung von GTP[gamma]S wurde für die Komplexdissoziation eine Enthalpieänderung von - 4.4 kcal/Mol ermittelt. Es ist zu beachten, daß dieser Teilschritt sich aus mehreren Reaktionen zusammensetzt. Dies sind die Bindung des zugegebenen GTPgS an den R*G-Komplex, die Dissoziation von R* und Transducin, die Trennung der Untereinheiten des G-Proteins und die Einstellung des MI-MII-Gleichgewichtes nach Freiwerden des Rhodopsins. Da die Wärmeänderung der genannten Reaktionen nicht separat bestimmt werden konnte, entspricht die im Kalorimeter gemessene Wärme der Summe der Enthalpieänderungen dieser Reaktionen.Die Hydrolysereaktion von GGTP zu GGDP Die Enthalpieänderung durch Hydrolyse des an Transducin gebundenen GTP zu GDP wurde aus der Gesamtwärme des Zyklus zu - 2.2 kcal/Mol errechnet. Die Reaktionsenthalpie des gesamten Zyklus wird nur von der Energieabgabe des GTP bestimmt, dabei wird die Energie des GTP jedoch nicht vollständig bei der Hydrolyse des Transducin-gebundenen GTP zu GDP frei. Die Differenz zwischen der Gesamtenthalpieänderung und der Wärme, die bei Hydrolyse von Gt-gebundenem GTP frei wird, liegt in einer höheren inneren Energie von Transducin in der GTP-bindenden Konformation als im GDP-bindenden Zustand.

Der Transfer von Chromosom 17 in die menschliche Mammakarzinomzellinie CAL 51 hatte zu einer Reversion des malignen Phänotyps geführt. Aufbauend auf diese Versuche wurde die Genexpression von CAL 51 Zellen versus CAL 17/5 Revertantenzellen mit der "differential display" Methode ana lysiert. Mit dem "differential display" Verfahren konnten 177 differentielle RT-PCR Produkte identifiziert, ausgeschnitten, eluiert und reamplifiziert werden. Ein Vergleich der Sequenzen mit den internationalen Datenbanken ergab: 46% der untersuchten PCR Produkte wiesen keine Homologie zu bekannten Genen auf, 16% zeigten eine hohe Homologie zu EST Sequenzen und cDNA Klonen (unbekannter Gene), 19% eine hohe Homologie zu mitochondrialer DNA und 19% wiesen eine hohe Homologie zu bekannten Genen auf. Die Northern Analyse von 40 ausgewählten Reamplifikaten bestätigte die differentielle Expression in etwa 1/3 der Fälle. Die homologen Gene sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert. Für einige konnte aufgrund ihrer bekannten biologischen Funktionen eine Assoziation mit der Reversion von CAL 51 Zellen vermutet werden. Dazu gehörten u.a. Apolipoprotein J, Sp17 und Profilin. Das Profilingen zeigte eine deutlich erhöhte mRNA- und Proteinexpression in den Revertantenzellen und ist auf Chromosom 17 in der transfizierten Region p13.3 lokalisiert. Profilin ist ein ubiquitäres Protein, das Bindungsstellen für G-Aktin, PIP2 und poly L-Proline besitzt. Die Transfektion von CAL 51 Zellen mit klonierter Profilin cDNA führte bei drei ausgewählten Transfektanten zu einer Suppression des neoplastischen Phänotyps. Die Profilin cDNA Transfektanten zeigten gegenüber den parentalen CAL 51 Zellen und einer Vektortransfektante (ohne Profilin cDNA Insert) ein verlangsamtes Wachstum, eine geringere Koloniebildung in Weichagar, eine differenzierte Strukturbil dung in Matrigel und eine reduzierte Tumorigenität in "nude" Mäusen. Die beobachteten Veränderungen korrelierten zumeist mit der Profilinexpression in den Transfektanten. Eine SSCP- und Sequenzanalyse des Profilingens in CAL 51 Zellen ergab drei Sequenzunterschiede gegenüber der "wildtyp" DNA: Ein homozygoter Basenaustausch in der Promoterregion (A-773G), ein homozygoter Basenaustausch in Exon 3 (C334T) (ohne Aminosäureaustausch) sowie eine heterozygote Deletion in der untranslatierten 3' Region (645delT). Die Bedeutung dieser Sequenzunterschiede ist noch unklar. Mit ersten Northern Analysen von Tumor- und Normalgeweben sowie mehreren Brustkrebszellinien wurde begonnen. Die kleine Anzahl der untersuchten Proben erlaubt noch keine Interpretation der Ergebnisse.

Das 20S Proteasom bildet den Protein degradierenden Teil des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und ist damit an wichtigen zellulären Prozessen wie Genexpressionskontrolle, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Peptidgenerierung zur MHC Klasse I Präsentation und Degradation fehlgefalteter Proteine beteiligt. Die einzelnen Schritte der Biogenese des 20S Proteasoms in Eukaryoten sind bisher nur in Ansätzen verstanden. In dieser Arbeit wird die Untereinheitenzusammensetzung von Biogeneseintermediaten und ihre subzelluläre Lokalisation und Organisation in humanen Zelllinien untersucht. Durch die Etablierung eines in vitro Systems konnten distinkte Assemblierungsintermediate humaner Proteasomen generiert werden und ein (-Ring als früheres Intermediat im in vitro System nachgewiesen werden. Aufschluss über den weiteren Vorgang der Assemblierung wurden durch in vivo Experimente mit radioaktiv markierten HeLa Zellextrakten gewonnen. So konnten vor allem neu synthetisierte und zuletzt eingebaute Untereinheiten identifiziert werden. Hierzu gehören die Untereinheiten ?1 und (7, die aufgrund ihrer in trans agierenden C-terminalen Verlängerungen einen Dimerisierungsprozess zweier Halbproteasom-Vorläuferkomplexe forcieren. Darüber hinaus kann die Untereinheit (1 aufgrund der gewonnen Erkenntnisse als die wahrscheinlich den (-Ring schließende Untereinheit im Vorläuferkomplex postuliert werden. Proteasomale Assemblierungsintermediate konnten außerdem durch immuncytochemische und biochemische Methoden am ER von humanen Zelllinien lokalisiert werden. Dabei scheint dem Assemblierungsfaktor POMP eine Schlüsselrolle zuzukommen, da dieser eine Assoziation der Vorläuferkomplexe mit dem ER erst ermöglicht. In dieser Arbeit sind weitere Schritte des komplexen Biogenese-Vorgangs konstitutiver 20S Proteasomen in humanen Zelllinien aufgeklärt worden und es konnte erstmals die subzelluläre Lokalisation für Assemblierungsintermediate in humanen Zellen beschrieben werden. / The 20S Proteasom represents the protein degrading part of the Ubiquitin- Proteasom- System and is therefore a participant in important cellular processes like gene expression, cell cycle control, apoptosis, peptide generation for MHC class I presentation and degradation of misfolded proteins. Only the beginnings of the individual steps of the 20S proteasome biogenesis in eucaryotes are so far understood. Tis work examines the subunit composition of assembly intermediates and their subcellular localisation and organisation in eucaryotic cells. Distinct assembly intermediates of human proteasomes have been generated by establishing an in vitro system. As an earlier intermediate in the in vitro system an (-ring could be identified. In vivo experiments using radioactive marked total lysates of HeLa cells shed light on the following sequence of assembly. Thus new synthesised and finally incorporated subunits could be indentified. Two of this subunits are (1 and (7 which could force the dimerisation process of two half-proteasome-precursor by their trans acting c-terminal extensions. Furthermore the (1 subunit has been identified as the (-ring completing subunit in the precursor complex. In addition it was possible to detect proteasomal assembly intermediates through immuncytochemical and biochemical methods on the ER of human cell lines. Thereby the assembly factor POMP plays a key role as it allows in the first place the precursor association with the ER. This work clarifies further steps of complex procedure of biogenesis of constitutive 20S proteasomes in human cell lines and allows the characterisation of the subcellular localisation of assembly intermediates in human cells for the first time.

TAD-Grenzen sind genomische Regionen mit Isolatorpotenzial, die zwischen benachbarten Chromatindomänen liegen und deren Unterbrechung zu einer pathologischen Genexpression führen kann. Die meisten TAD-Grenzen werden durch das CTCF gebunden, ein Architekturprotein, das Chromatinschleifen bevorzugt zwischen distalen Paaren von CTCF-Bindungsstellen (CBS) mit einer konvergenten Motivausrichtung bildet. An TAD-Grenzen sind die CBS häufig geclustert, wobei die Motive eine divergente Ausrichtung aufweisen und Chromatinschleifen in Richtung der stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Regionen projizieren. Wie die CTCF-Besetzung die Isolierung an TAD-Grenzen moduliert, ist immer noch nicht ganz klar. Hier habe ich die regulatorische Logik von CTCF-geclusterten TAD-Grenzen untersucht, indem ich genomweite Analysen und in vivo-Mausexperimente an der Epha4-Pax3-TAD-Grenze kombiniert habe. Analysen einzelner Deletionen zeigten einen deutlichen hierarchischen Beitrag von CBS zur Grenzfunktion. Im Gegensatz dazu zeigten kombinierte CBS-Deletionen ein gewisses Maß an funktioneller Redundanz und Kooperativität zwischen den Stellen. Diese Analysen zeigten auch, dass die abweichende Konfiguration der CBS, die immer wieder an TAD-Grenzen zu finden ist, für eine robuste Isolierung nicht unbedingt erforderlich ist. Genomweite Analysen haben gezeigt, dass es eine Untergruppe von CBS gibt, die unabhängig von der konvergenten Ausrichtung Chromatinschleifen bilden, wofür ich einen Mechanismus der "Schleifeninterferenz" vorschlage. Weitere Vergleiche ergaben, dass das Niveau der Genexpression von den Abständen zwischen Enhancer und Promoter im linearen Genom abhängen könnte. Durch die Quantifizierung der Isolierung der Grenzen, der Pax3-Fehlexpression und der Schwere der Gliedmaßenfehlbildungen konnte ich schließlich zeigen, dass die TAD-Grenzen die Genexpression und den Phänotyp quantitativ beeinflussen. / TAD boundaries are genomic regions with insulator potential located between adjacent chromatin domains, which disruption can cause pathological gene expression. Most TAD boundaries are bound by the CTCF, an architectural protein that forms chromatin loops preferentially between distal pairs of CTCF binding sites (CBSs) with a convergent motif orientation. At TAD boundaries, CBSs are frequently clustered, with motifs displaying a divergent orientation and projecting chromatin loops towards up and downstream regions. How CTCF occupancy modulates insulation at TAD boundaries still remains elusive. Here, I dissected the regulatory logic of CTCF-clustered TAD boundaries by combining genome-wide analysis and in vivo mouse experiments at the Epha4-Pax3 TAD boundary. Analyses of individual deletions revealed a distinct hierarchical contribution of CBS to boundary function. In contrast, combined CBSs deletions revealed a certain degree of functional redundancy and cooperativity between sites. These analyses also demonstrated that the divergent configuration of CBSs, recurrently found at TAD boundaries, is not strictly required for robust insulation. Genome-wide analysis highlighted the existence of a subset of CBSs that establish chromatin loops independently of the convergent orientation bias, for which I propose a mechanism of “loop interference”. This mechanism suggests that CBS forming a robust convergent loop can simultaneously form a non-convergent loop, by stalling Cohesin complexes extruded from both sides. Further comparisons revealed that gene expression levels might depend on enhancer-promoter distances in the linear genome. Finally, by quantifying boundary insulation, Pax3 misexpression and the severity of limb malformation, I demonstrate that TAD boundaries are quantitative modulators of gene expression and phenotypes. Overall, I highlight that TAD boundary composition and strength constitute a fundamental regulatory layer in developmental processes and disease.

In dieser Doktorarbeit behandle ich verschiedene Persönlichkeitsaspekte von jugendlichen Zitronenhaien (Negaprion brevirostris). Ich habe wiederholt Individuen in einem neuartigen Testfeld untersucht. Diese Experimente zeigten, dass jugendliche Zitronenhaie sich konstant verschieden verhalten. Außerdem konnte ich durch eine wiederkehrende Exposition in dem neuartigen Testfeld ein Gewöhnungsverhalten aufzeigen. Gewöhnung war ein Indikator, dass dieser Test es möglich macht, Reaktionen auf Veränderungen zu erforschen. Und endlich zeigte dieses Experiment dass Individuen verschiedene Gewöhnungsraten besitzen. Zweitens testete ich konsistente individuelle Verschiedenheiten in einigen der sozialen Verhaltensweisen über Zeiträume von einigen Tagen bis Perioden von vier Monaten. Während des neuerlichen Tests von Individuen wurde die Zusammensetzung der Gruppen geändert, um sicher zu gehen, dass die Wiederholbarkeit nicht vom gleichen sozialen Umfeld zwischen den wiederholten Versuchen kam. Hier wiederum fand ich, dass jugendliche Zitronenhaie Persönlichkeitsdifferenzen in ihrem sozialen Umfeld besaßen und dies trotz der veränderten Gruppen und einer viermonatigen Periode zwischen den Tests. Drittens testete ich die Präsenz eines Verhaltenssyndroms zwischen der Sozialisierung und der Reaktion auf ein neues Testfeld unter Berücksichtigung einer möglichen Variation dieses Syndroms durch Ontogenese und den Fangplatz. Dazu untersuchte ich noch die Dauerhaftigkeit von individuellen Unterschieden in verschiedenen Altersklassen und von verschiedenen Fangplätzen. Ich fand eine starke negative Korrelation zwischen der Soziabilität und der Reaktion auf Ungewohntes bei den Haien, in einer von zwei getesteten Kinderstuben, aber nur wenn sie älter als ein Jahr waren. Dazu fand ich, dass Haie, die weniger als ein Jahr alt waren, keine langdauernde Verhaltenskonsistenz zum Gegensatz zu älteren Haien zeigten. / In this thesis, I investigated different aspects of personality in juvenile lemon sharks (Negaprion brevirostris). I repeatedly tested individuals in a novel open field test. This experiment showed that juvenile lemon sharks consistently differ in their behavior. In addition, repeated exposures to the novel open field, allowed me to demonstrate the presence of habituation. Habituation was used as an indication that this test can be used to investigate reaction to novelty. Finally, this experiment also revealed that individuals have variable rates of habituation. Second, I tested consistent individual differences in some aspects of their social behavior over a few days up to a four-month period. While retesting individuals, group composition was changed to insure that repeatability was not due to the repetition of the same social environment between tests. Here again, I found that juvenile lemon sharks showed personality differences in their social behavior and this despite group composition changes and a four-month period between tests. Third, I tested the presence of a behavioral syndrome between sociability and reaction to a novel open field while considering potential variation in this syndrome through ontogeny and locations of capture. In addition, I investigated the maintenance of individual differences in different age classes and locations of capture. I found a significant negative correlation between sociability and reaction to novelty in sharks from one of the two nurseries tested but only when they were older than a year. In addition, I found that young of year sharks did not demonstrate long term consistency in their behavior as opposed to older sharks.

Diese Arbeit beschreibt die immunologischen Eigenschaften von Acanthochilonema viteae Tropomyosin, einem Muskel-assoziierten Protein. A. viteae ist ein zu den Filarien gehörender Parasit von Gerbilen, ähnlich dem humanpathogenen Filarie Onchocercha volvulus. Diese Arbeit hatte die funktionelle Charakterisierung von A. viteae Tropomyosin im Kontext der natürlichen Infektion und experimentellen Vakzinierung zum Ziel. Das allergene Potential des Tropomyosins und die Produktion von spezifischen IgE-Antikörpern wurden untersucht. Außerdem wurden Tropomyosin-spezifische monoklonale Antikörpern (mAk) entwicklet. Es konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin als vielversprechender Kandidat zur Vakzinentwicklung gegen Filariosen angesehen werden kann, wobei berücksichtigt werden muss, dass deutliche Effekte nur unter Th1-Bedingungen auftreten. Die Vakzinierung mit Protein oder DNA reduzierte Adultwurmzahlen um 30 bzw. 45%. Während einer Infektion fungiert Tropomyosin als funktionelles Allergen und führt zur Produktion von hohen Mengen spezifischen IgEs. Ein Screening synthetischer Peptid-Bibliotheken zeigte gemeinsame 13 IgG- und 11 IgE-Epitope. Weiters konnte Kreuzreaktivität mit anderen Tropomyosinen und diesen gemeinsamen IgE-Epitopen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von mAk konnte gezeigt werden, dass Tropomyosin auf der Oberfläche der Kutikula der Larvenstadien L3 und microfilariae des Parasiten vorkommt. Durch die Deglykosylierung des nativen Proteins wurde deutlich, dass einige Epitope von posttranslationellen Modifikationen gebildet werden. Weitere Immunisierungen mit Tropomyosin führten zu einem ähnlichen Profil der Zellaktivierung und Antikörperproduktion wie der Adjuvant Aluminiumhydroxid. Jedoch führte die Behandlung zur IL-10 Produktion und zur Zunahme von Gr1+/ CD11b+ Zellpopulationen, welche natürliche Surpressors darstellen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass A. viteae Tropomyosin immunmodulierende Eigenschaften aufweist und als Komponente eines zu entwickelnden Vakzins in Frage kommt. / This study describes the immunological properties of Acanthocheilonema viteae muscle-associated protein tropomyosin. A. viteae is a filarial parasite of jirds that resembles the important human parasite Onchocerca volvulus. Focus of experiments is on unraveling the functional properties of tropomyosin in the context of an infection and experimental vaccination. Additionally, allergenic potential of tropomyosin was investigated and the ability to induce high levels of specific IgE. A part of the study was also aimed at the development of anti-tropomyosin monoclonal antibodies (mAb). This study revealed that tropomyosin is a promising antigen for vaccines against filarial nematodes, however, effective only in a Th1 biased environment. Vaccination with protein or DNA resulted in 30% - 45% protection that was not associated with specific IgG or IgE. During infection tropomyosin is an allergen and leads to the production of high levels of specific IgE. Screening of synthetic peptide libraries showed 13 IgG and 11 IgE co-located epitopes and revealed cross-reactivity with other tropomyosins and sharing of IgE epitopes. mAb were raised against A. viteae tropomyosin and showed that tropomyosin is abundant on the cuticle of L3 and microfilariae of the parasite. Deglycosylation of the native protein showed that some epitopes were formed by the posttranslational modifications. Additionally, immunization shows that tropomyosin induces a similar pattern of cell activation and antibody production as aluminium hydroxide adjuvant, but leads to the induction of IL-10 and the increase of population of GR1+/CD11b+ cells. These cells are regarded as natural suppressors. Taken together, results show that A. viteae tropomyosin has immunomodulating properties and can be considered as a component of an efficient vaccine.

Diese Arbeit erlaubt einen erweiterten Einblick in die Regulation c-di-GMP-abhängiger Prozesse im Rahmen der Makrokolonieentwicklung von E. coli K12 AR3110, darunter die heterogene Expression des Masterregulators der Biofilmbildung CsgD und die räumlich differenzierte Matrixproduktion. Es konnte erstmals die Verteilung des Signalmoleküls c-di-GMP dargestellt werden und auch die damit einhergehe Dynamik der RdcA/B-DgcE-vermittelten Expression von csgD innerhalb einer Makrokolonie aufgeklärt werden. Zusätzlich konnten weitere Mechanismen in der Kontrolle der CsgD-Aktivität und Proteolyse identifiziert werden; darunter seine zelluläre Aggregation in spezifischen Zonen der Makrokolonie und sein proteolytischer Abbau (durch Lon-Proteasen). Diese Ergebnisse lassen eine präzise gesteuerte Koordination beschriebener Prozesse annehmen, die durch die Entstehung vertikaler Nähr- und Sauerstoffgradienten vermittelt wird. In ihrer Gesamtheit führen sie zu einer räumlich geordneten Produktion und Anordnung von Curlifasern und pEtN-Cellulose in der Makrokolonie, die zur Ausbildung der komplexen dreidimensionalen Matrixarchitektur führen. Jedes einzelne Matrixelement weist dabei eine charakteristische Zusammensetzung und Anordnung auf, die mit spezifischen Materialeigenschaften einhergehen. So bilden sie eine biofilminterne Gerüststruktur aus, die als mechanische Grundlage für die Auffaltung angenommen werden kann. Mikroskopische Analysen konnten matrixfreie, lokal proliferierende Zellen als treibende Kraft darstellen. Sie sind für den Aufbau und auch den Ausgleich eines Kompressionsdrucks verantwortlich, der die Auffaltung überhaupt verursacht. In ihrer Gesamtheit zeigt diese Arbeit, dass sowohl matrixfreie als auch matrixproduzierende Zellen eine horizontale Ausbreitung der Kolonie ermöglichen, ohne den Biofilm und darin befindliche Zellen zu beeinträchtigen. Auf diese Weise sind sie essenziell für die Aufrechterhaltung der physischen Integrität und Homöostase der Makrokolonie. / This work allows further insight into the regulation of c-di-GMP-dependent processes within the development of macrocolonies of E. coli K12 AR3110, including the heterogeneous expression of the master regulator CsgD and spatially differentiated matrix production. For the first time, the distribution of second messenger molecule c-di-GMP was visualized along the macrocolony axis. Furthermore, this study was able to elucidate the dynamics of RdcA/B-DgcE-controlled csgD expression and find additional mechanisms in the control of CsgD activity and proteolysis; including its cellular aggregation in specific zones and its proteolytic degradation by Lon-Preoteases. Overall, these results suggest a very precise coordination of cellular processes that depend on the presence of vertical oxygen and nutrient gradients which lead to a spatially defined production and arrangement of curlifibres as well as pEtN-Cellulose within the macrcocolony. This results in the formation of a complex three-dimensional matrix architecture with each individual matrix element exhibiting a characteristic composition and arrangement associated with specific material properties. That way they form a biofilm-internal scaffolding structure that represents the mechanical basis for macrocolony folding. Microscopic analyses were able to identify matrix-free and locally proliferating cells as driving force. They seem to be responsible for both creating as well as releasing pressure on matrix structures that causes buckling up in the first place. Taken together, this work shows that both matrix-free, proliferating cells and matrix-producing cells enable the horizontal spreading of the macrocolony without affecting the biofilm and cells located within. Thus, they are essential for maintaining physical integrity and homeostasis within the macrocolony.