Das 20S Proteasom bildet den Protein degradierenden Teil des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und ist damit an wichtigen zellulären Prozessen wie Genexpressionskontrolle, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Peptidgenerierung zur MHC Klasse I Präsentation und Degradation fehlgefalteter Proteine beteiligt. Die einzelnen Schritte der Biogenese des 20S Proteasoms in Eukaryoten sind bisher nur in Ansätzen verstanden. In dieser Arbeit wird die Untereinheitenzusammensetzung von Biogeneseintermediaten und ihre subzelluläre Lokalisation und Organisation in humanen Zelllinien untersucht. Durch die Etablierung eines in vitro Systems konnten distinkte Assemblierungsintermediate humaner Proteasomen generiert werden und ein (-Ring als früheres Intermediat im in vitro System nachgewiesen werden. Aufschluss über den weiteren Vorgang der Assemblierung wurden durch in vivo Experimente mit radioaktiv markierten HeLa Zellextrakten gewonnen. So konnten vor allem neu synthetisierte und zuletzt eingebaute Untereinheiten identifiziert werden. Hierzu gehören die Untereinheiten ?1 und (7, die aufgrund ihrer in trans agierenden C-terminalen Verlängerungen einen Dimerisierungsprozess zweier Halbproteasom-Vorläuferkomplexe forcieren. Darüber hinaus kann die Untereinheit (1 aufgrund der gewonnen Erkenntnisse als die wahrscheinlich den (-Ring schließende Untereinheit im Vorläuferkomplex postuliert werden. Proteasomale Assemblierungsintermediate konnten außerdem durch immuncytochemische und biochemische Methoden am ER von humanen Zelllinien lokalisiert werden. Dabei scheint dem Assemblierungsfaktor POMP eine Schlüsselrolle zuzukommen, da dieser eine Assoziation der Vorläuferkomplexe mit dem ER erst ermöglicht. In dieser Arbeit sind weitere Schritte des komplexen Biogenese-Vorgangs konstitutiver 20S Proteasomen in humanen Zelllinien aufgeklärt worden und es konnte erstmals die subzelluläre Lokalisation für Assemblierungsintermediate in humanen Zellen beschrieben werden. / The 20S Proteasom represents the protein degrading part of the Ubiquitin- Proteasom- System and is therefore a participant in important cellular processes like gene expression, cell cycle control, apoptosis, peptide generation for MHC class I presentation and degradation of misfolded proteins. Only the beginnings of the individual steps of the 20S proteasome biogenesis in eucaryotes are so far understood. Tis work examines the subunit composition of assembly intermediates and their subcellular localisation and organisation in eucaryotic cells. Distinct assembly intermediates of human proteasomes have been generated by establishing an in vitro system. As an earlier intermediate in the in vitro system an (-ring could be identified. In vivo experiments using radioactive marked total lysates of HeLa cells shed light on the following sequence of assembly. Thus new synthesised and finally incorporated subunits could be indentified. Two of this subunits are (1 and (7 which could force the dimerisation process of two half-proteasome-precursor by their trans acting c-terminal extensions. Furthermore the (1 subunit has been identified as the (-ring completing subunit in the precursor complex. In addition it was possible to detect proteasomal assembly intermediates through immuncytochemical and biochemical methods on the ER of human cell lines. Thereby the assembly factor POMP plays a key role as it allows in the first place the precursor association with the ER. This work clarifies further steps of complex procedure of biogenesis of constitutive 20S proteasomes in human cell lines and allows the characterisation of the subcellular localisation of assembly intermediates in human cells for the first time.

Der Verlust der chiralen Integrität am aktivierten Carboxylrest im Verlauf der Peptidsegmentkondensation mit Uroniumsalzen wird durch die Bildung von Oxazolon in Gegenwart des zur Aktivierung der Carboxylgruppe notwendigen tertiären Amins verursacht. Während der Aktivierung geschützter Peptidsegmente in Gegenwart von 2 Äq. des tertiären Amins ändert sich die Lage des Aktivester/Oxazolon - Gleichgewichtes in Abhängigkeit von der Natur der Abgangsgruppe im Uroniumsalz mit steigendem Oxazolongehalt in der Reihenfolge HONB<<HOBt<HOAt. Bei Segmentkupplungen mittels Uroniumsalzen wurde ein Ausmaß der Stereomutation direkt entgegengesetzt zur Menge an Oxazolon gefunden. Für diese unerwartete Reihenfolge sind der sinkende Anteil an freier N-Hydroxyverbindung zur Neutralisation der benötigten Base und unterschiedliche Geschwindigkeiten der Bildung und Aminolyse des intermediären Aktivesters verantwortlich. Hinsichtlich der Verringerung der Stereomutation werden alternative Aktivierungsmethoden diskutiert, wie die Herstellung von Aktivestern über Mischanhydride durch Verwendung von Chlorameisensäurealkyles tern und Zusatz von HONB oder die Verwendung des neuen Reagenzes Chlorocarbonyloxybenzotriazol. Eine neue effiziente Kupplungsmethode besteht in der Verwendung von Peptidsäurefluoriden, hergestellt durch Zusatz von Pyridin- poly(hydrogenfluorid) zum zuvor gebildeten Peptidoxazolon oder in dem Zusatz dieses HF-Additivs bei der Uroniumsalzkup plung zur Unterdrückung der basenkatalysierten Stereomutati on. Außerdem wurde hier erstmalig die bisher als erster Schr itt der Aktivierung mit Uroniumsalzen angenommene O-Acyluroniumverbindung am Modell der Aktivierung der sterisch gehinderten Mesitylencarbonsäure mit dem 7-Aza-benzotriazolyl-Reagenz HAPyU mittels 13C-NMR-Tieftem peratur-Untersuchungen direkt nachgewiesen. / Loss of chiral integrity at the activated carboxyl residue during peptide segment condensation by means of uronium salts is caused by the formation of oxazolone in the presence of the tertiary amine which is necessary for activation of carboxylic group. During activation of a protected peptide in the presence of 2 equivalents of tertiary amine the position of the active ester/oxazolone equilibrium is dependent on the nature of the leaving group of the uronium salt with an increasing oxazolone content in the order HONB<<HOBt<HOAt. Segment coupling by means of uronium salts result in an extent of stereomutation which is directly opposite to the extent of oxazolone formation. This unexpected order is caused by the presence of decreasing amounts of the free N-hydroxy component neutralizing the base, and differing rates of formation and aminolysis of intermediate active esters. Alternative activation procedur es are discussed with regard to reduction of stereomutation: the preparation of active esters through mixed anhydrides by use of alkyl chloroformates followed by addition of HONB or by use of the new reagent chlorocarbonyloxybenzotriazole. A new efficient coupling method resulted from the use of peptide acid fluorides prepared by addition of pyridin-poly (hydrogenfluoride) to pre-formed peptide oxazolone, or the addition of this HF-pyridine complex to couplings via uronium salts, suppressing the base-catalyzed stereomutation. For the first time, direct evidence of the O-acyluronium salt assumed to be the first step during activation via uronium salts was found by means of low temperature 13CNMR measurements of the activation of the sterical hindered mesitoic acid with the 7-aza-oxybenzotriazolyl derivative HAPyU.

Die Nachahmung natürlichen Kollagens stellt aufgrund dessen einzigartiger Struktur erhöhte Anforderungen an die chemische und biochemische Synthese artifizieller kollagenartiger Peptide. In dieser Arbeit wurden Cystein-Knoten und Organo-Template als Konzepte zur Vororganisation vorgestellt, um Peptideinzelstränge in die Anordnung kollagenartiger Dreifachhelices (CTH) zu dirigieren. Zusätzlich wurden diese mit einem schaltbaren DEPSI Struktursegment zur Steuerung der Helixstruktur kombiniert. Die templatbasierte Strategie beruht auf einem dreiarmigen Gerüstmolekül, an welches drei Peptideinzelstränge mittels nativer chemischer Ligation geknüpft werden. Für das Cystein-Knoten-Konzept wurden kollagen-mimetische Peptide entwickelt. Diese bestehen aus einer Cystein-reichen Domäne (wc2-Domäne) und einem Abschnitt, der eine kollagenartige Sequenz von [Gly-Pro-Pro]x aufweist. Die Vororganisation, als auch der Schalterdefekt zeigten maßgebliche Auswirkungen bezüglich der Adaption der Peptide in kollagenartige Dreifachhelices. Abhängig von der Position modulieren die Schalterdefekte die wc2-Organisation, die Nukleierung und den CTH-Faltungsprozess. Die Cystein-Organisationsdomäne wies den Vorteil auf, dass derartige Sequenzen ohne chemische Modifikation direkt im biotechnologischen Prozess in Unimere eingebracht werden konnten. Eine E. coli-basierte Produktionsstrategie ermöglichte den Zugang zu [GPP]50-Konstrukten, die ebenfalls die wc2-Domäne trugen. Weitere Untersuchungen wiesen zudem eine redox-reaktive Schaltbarkeit der Peptide nach. Um die Verwendbarkeit der synthetischen Kollagene als Biomaterial zu testen, wurde die Kompatibilität in zweidimensionalen Adhäsions- und Zytotoxizitätstests überprüft. / Due to its unique structure, the imitation of natural collagen increased the demands on the chemical and biochemical synthesis of artificial collagen mimetic peptides (CMPs). In this thesis, concepts of cysteine knots and organo-templates were presented for the reorganization of peptide single strands into the arrangement of collagenous triple helices (CTHs). These techniques were additionally combined with a switchable DEPSI structure segment to further control the helix structure. The template-based strategy relies on a three-armed scaffold to which three peptide strands are attached by native chemical ligation. For the cysteine-knot concept, collagen mimetic peptides consisting of a cysteine-rich domain (wc2-domain) and a domain with a collagen-like sequence of [Gly-Pro-Pro]x were developed. The preorganization, as well as the switch defect, showed significant effects on the adaptation of the peptides in collagenous triple helices. Depending on the position, the switch defects modulate wc2-organization, nucleation and the CTH folding process. This cysteine organization domain had the advantage that such sequences could be introduced into unimers directly in the biotechnological process without chemical modification. An E. coli-based production strategy allowed access to [GPP]50 constructs, which also carried the wc2-domain. Further investigations also showed a redox-reactive switchability of the peptides. To examine the utility of the synthetic collagen as a biomaterial, compatibility was tested in two-dimensional adhesion and cytotoxicity tests.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Analytik eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch auf Cisplatin-behandelte DNA reagiert und bereits routinemäßig zu diagnostischen Zwecken bei der Krebstherapie mit ebendiesem Zytostatikum eingesetzt wird. Zu diesem Zweck wurden vor allem massenspektrometrische Methoden eingesetzt, um einerseits den genauen Aufbau sowie die Zusammensetzung des Antikörpers zu untersuchen und andererseits die Antigenspezifität einer genaueren Betrachtung zu unterziehen. Mit Hilfe von nano-ESI-MS konnte der Antikörper unter Erhalt der nativen Struktur in der Gasphase analysiert werden. Tandem-MS-Experimente lieferten nicht nur einen Einblick in typische Fragmentierungs-muster, sondern generierten z. T. auch Informationen über die Primärsequenz einiger Bereiche des Antikörpers. Die im Fc-Teil gebundenen Glycanstrukturen, die sowohl für die Struktur als auch die Funktionalität des Antikörpers eine entscheidende Rolle spielen, wurden nach enzymatischer Abspaltung separat mit Hilfe von MALDI-MS analysiert. Die vollständige Antikörpersequenz wurde durch proteolytische Spaltung des Antikörpers, Analytik mittels hochaufgelöster Tandem-MS und anschließendem Vergleich mit Daten aus der Sequenzierung auf DNA-Ebene bzw. bekannten Antikörpersequenzen aus Proteindatenbanken aufgeklärt. Im selben Zug konnten auf Peptidebene eine Vielzahl verschiedener posttranslationaler Modifikationen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Antikörper unter Erhalt seiner Struktur und der antigenbindenden Eigenschaften an den Zuckerstrukturen mit einem eigens synthetisierten Metallkomplex markiert werden kann. Die für die Spezifitätsstudie des Antikörpers notwendigen Antigene wurden durch Inkubation synthetischer einzel- und doppelsträngiger DNA-Oligomere mit Cisplatin erzeugt und analysiert. Anschließend wurden die verschiedenen Antikörper-Antigen-Komplexe unter nativen Bedingungen hergestellt und massenspektrometrisch charakterisiert. Um einen Eindruck von der Komplexstabilität zu erhalten wurden zusätzlich MS/MS-Untersuchungen des Komplexes mit der platinierten doppelsträngigen DNA durchgeführt. Wie bei der Analytik des freien Antikörpers konnten auch hier spezifische Fragmente detektiert werden. / The focus of the thesis was the characterization of a monoclonal antibody, which binds specifically to cisplatin-treated DNA and is already used for diagnostic purposes in cancer therapy. The structure and composition of the antibody, as well, as the antigen specificity were investigated by mass spectrometry. Using nano-ESI-MS it was possible to analyse the antibody in its native state. Tandem-MS experiments revealed not only specific antibody fragments but also gave information on the primary structure of the antibody. The Fc-bound glycans that are responsible for antibody structure and functionality, were cleaved enzymatically and studied with MALDI-MS. For a detailed determination of the primary structure, the antibody was proteolysed with different enzymes and analyzed via high resolution Tandem-MS. The data was evaluated by comparism with results from sequence analysis on DNA level and known antibody sequences from protein databases. Simultaneously many different posttranslational modifications were identified. Furthermore, the antibody was successfully labelled with a metal complex at its sugar structures without loss of its structure and function. For investigation of the antibody specificity antigens were generated by incubation of well-defined single and double stranded DNA oligomers with cisplatin. Antibody-antigen-complexes were synthesized and analyzed by mass spectrometry under native conditions. The stability of the complex with double stranded DNA was also investigated by MS/MS-experiments. Thus, it was also possible to determine the specific fragmentation behavior for the complex just as for the free antibody.

Die oxidative Transformation der Thiol-Gruppe des Cysteins in verschiedene andere funktionelle Gruppen wird als sehr wichtige posttranslationale Modifikation (PTM) angesehen. Cysteinsulfensäure (SA) ist eine Zwischenstufe der Thiol-Oxidation: Sie kann entweder mit freien Thiolen reagieren, um Disulfide zu bilden oder durch reaktive Sauerstoffspezies (reactiveoxygenspecies, ROS) weiter oxidiert werden. Jede Störung des zellulären Redox-Haushalts wird mit altersbedingten Erkrankungen , daher stellt die Überwachung des SA-Spiegels einen vielversprechenden Wegdar, den Status dieses Redox-Haushalts festzustellen. Da bereits kleinste Änderungen der Proteinmengen und PTMs tiefe Einblicke in den Zustand des biologischen Systems liefern können, ist eine quantitative Bestimmung von großer Bedeutung.Technologische Fortschritte im Bereich der Trennungsmethoden und Massenspektrometrie (MS) erlaubten die Entwicklung umfassender Möglichkeiten in der Protein-Analytik. In dieser Arbeit wurde eine neue, hochsensitive und selektive Methode zur Detektion von SA entwickelt. Dafür wurde ein Alkin-β-Ketoester (KE) an einen Lanthanid-haltigen (Ln) Chelatkomplex. Zum Nachweis des Funktionsprinzips wurden, mittels H2O2, Sulfensäuren in verschiedenen Peptidsequenzen erzeugt, um die in biologischen Systemen durch ROS hervorgerufenen Oxidationen nachzustellen. Diese Sulfensäuren wurden anschließend durch den Ln-DOTA-KE-Komplex gebunden. Die Bildung dieser SA-Ln-DOTA-KE-Einheit wurde mittels (Elektronenspray-Ionisation/ ESI-MS) und (induktiv gekoppeltem Plasma/ICP-MS) nachverfolgt. Die entwickelte Methode wurde weiterhin auf die Bestimmung von SA-Bildung in humanem Serum angewandt, humanes Serumalbumin wurde angereichert via Affinitätschromatographie. ICP-MS diente der Bestimmung der SA-Ln-DOTA-KE-Einheit, durch Kombination mit einer Isotopenverdünnungsanalyse (IDA) wurde eine absolute Quantifizierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen oxidative Schäden bis zu 40 % des vorhandenen Albumins. / Oxidative transformation of cysteine thiol group into different functional groups is considered a significant posttranslational modification (PTM) of great importance. Cysteine sulfenic acid (SA) is the transient state for thiol group oxidation; it can react with free thiols to form disulfide bonds or can be further oxidized with reactive oxygen species (ROS) to form sulfinic and sulfonic acids. As any disturbance in the cellular reduction-oxidation (redox) balance is correlated to age-related diseases, the detection of SA transient state formed a sensor for such redox-mediated events. Whereas only any small change in the quantity of proteins, as well as the formed PTMs, can provide deeper insights into the status of the biological system, quantitative analysis should be carried out to reveal the status of the system. On the other hand, the technological advances, in particular the separation techniques and mass spectrometry (MS), allowed the development of several approaches for the comprehensive assessment of proteome analysis. Herein, we provide a new strategy for the highly sensitive and specific detection of SA using alkyne β-ketoester (KE) previously linked to a lanthanide (Ln)-containing chelator (Ln-DOTA. SA was generated by hydrogen peroxide (H2O2) in different peptide sequences by ROS and was detected by the prepared compound Ln-DOTA-KE. Molecular mass spectrometry (electrospray/ ESI-MS) and (Inductively coupled plasma mass spectrometry /ICP-MS) have been used to monitor the formation of SA linked to Ln-DOTA-KE. The developed strategy has been further applied to the determination of SA-induced formation in human serum by using affinity chromatography for purification of albumin followed by ICP-MS to monitor the formed SA linked to Ln-DOTA-KE in combination with isotope dilution analysis (IDA) for the absolute quantification. Quantitative results showed levels of oxidative damage regarding SA formation in human serum up to 40% of the albumin present.

Um die Funktion von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen, ist es unerlässlich ihre Lokalisation und Bewegung im lebenden System durch z.B Fluoreszenz-markierung sichtbar zu machen. Eine ideale Markierungsmethode zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Zielprotein (protein of interest, POI) selektiv und in kurzer Zeit mit einer maßgeschneiderten Reportergruppe ausstattet, ohne die Proteinfunktion und -lokalisation zu beeinflussen. Dabei ist die Größe der Erkennungssequenz von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Markierungsstrategie beschrieben, bei der die Ausbildung eines parallelen Coiled-Coil-Motivs den Transfer einer Reportergruppe auslöst. Untersucht wurde dabei die Übertragung eines Sulfonat-gebundenen Fluorophors auf ein Cystein in der Erkennungssequenz durch nukleophile Substitution. Ebenfalls untersucht wurde der Transfer verschiedener Thioester-verknüpfter Reporter auf ein N-terminales Cystein der Erkennungssequenz durch eine Acyltransferreaktion. Beide Strategien zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und einen geringen Massenzuwachs am Zielprotein aus. Der Acyltransfer mit Arylthioestern zeigte zudem eine bemerkenswerte Reaktivität und erlaubte eine Markierung innerhalb weniger Minuten Reaktionszeit. Die Vielfältigkeit dieser Methode wurde anhand der Fluoreszenzmarkierung von sieben verschiedenen G-Protein gekoppelten Membranrezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen demonstriert. Die markierten Rezeptoren blieben dabei funktional und konnten ihren entsprechenden Liganden mit hoher Affinität binden. / In order to understand the function of proteins in their native environment, it is crucial to visualize their localization and trafficking in living cells by means of e.g. fluorescence labeling. An ideal labeling method adds a custom reporter group to the protein of interest (POI) in a selective and fast manner without disturbing the POIs function and localization. Hence the size of the recognition sequence is of major concern. This work describes the development of a labeling strategy in which the formation of a parallel coiled coil motif triggers the transfer of a reporter group. The transfer of a sulfonate-linked fluorescence dye onto the cysteine-modified recognition sequence via a nucleophilic substitution reaction was tested. Also the transfer of various thioester-linked reporters onto the N-terminal cysteine of the recognition sequence via an acyl transfer reaction was investigated. Both strategies are characterized by a high selectivity and low mass increase at the target protein. The acyl transfer with aryl thioesters also showed a remarkable reactivity and allowed labeling reactions to proceed within minutes. The versatility of this method was demonstrated by applying it to the labeling of seven different G-protein coupled membrane receptors on the surface of living cells. The labeled receptors remained functional and were able to bind their respective ligand with high affinity.

Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte. / Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

In der vorliegenden Arbeit diente das Kapsid der Bakteriophage Qbeta als multivalentes Gerüst und ermöglichte die Bildung eines monodispersen multivalenten Systems, welches mit Homopropargylglycin als unnatürliche Aminosäure modifiziert wurde. Das so eingeführte Alkin ermöglichte kupferkatalysierte Alkin-Azid-Cycloaddition zur Anbindung von Sialinsäuregrupen. Die entsprechende Synthese der hierzu kompatiblen Azid-modifizierten Sialinsäurederivate war eine der Hauptaufgaben dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurde das einfach zugängliche 5-N-Acetyladamantanylthiosialosid als Glykosylierungsdonor in der alpha-selektiven Synthese von Sialosiden evaluiert. Eine effiziente Aktivierung dieses Donors wurde unter optimierten Bedingungen bei -78°C mit N-Iodsuccinimid und Trifluormethansulfonsäure erreicht, was zu hohen alpha-Selektivitäten und Gesamtausbeuten der gewünschten Sialoside führte. Insbesondere Azidoethylenglykol-verknüpfte Sialinsäuren wurden synthetisiert, die für nachfolgende Biokonjugationsreaktionen an das Qbeta-Kapsid verwendet wurden. Die so dargestellten Sialinsäure-modifizierten Qbeta-Kapsidpartikel wurden dann eingehend mit Hilfe mehrerer biophysikalischer und biologischer Tests hinsichtlich ihrer Fähigkeit an Hämagglutinin zu binden und eine Influenza-Infektion zu inhibieren charakterisiert. Niedrige nanomolare Affinitäten wurden in diesen Assays gemessen. Eine sehr effiziente Infektionshemmung in vergleichbaren Konzentrationsbereichen konnte in einem in vitro Zell-, sowie einem in vivo Maus- als auch einem menschlichen ex vivo Modellsystem beobachtet werden. Verschiedene pathologisch relevante Influenzastämme konnten über die hier vorgestellte Strategie ebenfalls gebunden werden. Die monodisperse und definierte Struktur des Qbeta-Gerüsts erlaubte es außerdem ein theoretisches Modell der zugrundeliegenden Bindungsmodi zu erstellen. / In this thesis, the bacteriophage Qbeta capsid served as a multivalent scaffold and facilitated the generation of a monodisperse multivalent system which was modified with homopropargylglycine as an unnatural amino acid. The introduced alkyne enabled copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition to attach sialic acid groups. The corresponding synthesis of the compatible azide-modified sialic acid derivatives was one of the main tasks of this work. For this purpose, the straightforwardly accessible 5-N-acetyladamantanyl thiosialoside was evaluated as a glycosylation donor in the alpha-selective synthesis of sialosides. Efficient activation of this donor was achieved under optimized conditions at -78°C with N-iodosuccinimide and trifluoromethanesulfonic acid which led to high alpha selectivities and overall yields of the desired sialosides. Particularly azidoethylene glycol-linked sialic acids were synthesized which were used for subsequent bioconjugation reactions to the Qbeta capsid. These synthesized sialic acid-modified Qbeta capsid particles were then thoroughly characterized by multiple biophysical and biological assays regarding their ability to bind to hemagglutinin and to inhibit influenza infection. Low nanomolar affinities were measured in these assays. A very efficient infection inhibition in a comparable concentration range was observed in in vitro cellular, in vivo mouse and ex vivo human model systems. Several pathologically relevant influenza strains could also be bound with the strategy presented here. The monodisperse and defined structure of the Qbeta scaffold additionally allowed for the establishment of a theoretical model describing the underlying binding modes.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Thermodynamik und Kinetik der Proteinadsorption auf neutralen sowie geladenen, kolloidalen Kern-Schale-Mikrogelen untersucht. Die weiche polymere Schicht der Schale reagiert mit großen Volumenänderungen auf Änderungen der Umgebungstemperatur, des pH-Wertes oder der Salzkonzentration. Untersuchungen mit Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigten, dass generell die native Sekundärstruktur der verwendeten Proteine, die auf den Mikrogelen adsorbiert wurden, erhalten blieb. Im Gegensatz zur Proteinadsorption auf festen Oberflächen wurde zudem eine hohe katalytische Aktivität der Enzyme nach der Immobilisierung verzeichnet, die gegenüber derjenigen der freien Enzyme in manchen Fällen sogar erhöht war. Mithilfe der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) und FT-IR Spektroskopie wurden als treibende Kräfte des Adsorptionsprozesses elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen identifiziert. Weitere Untersuchungen zeigten, dass im Falle von geladenen Mikrogelen das elektrostatische Potential wie auch der abgesenkte lokale pH-Wert innerhalb des Netzwerks eine Änderung des Ladungszustands der adsorbierenden Proteine zur Folge hat. Zusätzlich konnte mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie und der Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine die kinetische Aufnahme in die Mikrogele als auch die Reversibilität der Reaktion analysiert werden. Es wurde dabei ein dynamischer Austausch zwischen gebundenen und freien Proteinmolekülen nachgewiesen, welcher die Verwendung von Gleichgewichtsmodellen für die Beschreibung der Proteinadsorption rechtfertigt. Außerdem erfolgt der Vorgang in zwei Schritten: i) ein schneller diffusionslimitierter Schritt, in dem der Hauptteil der gesamten Proteinmenge bindet und ii) ein anschließender wesentlich langsamerer Bindungsvorgang. Die Adsorptionsexperimente wurden anschließend auf Untersuchungen in binären Proteinmischungen ausgedehnt, um die kompetitive Proteinadsorption zu studieren. / In the present work the thermodynamics and the kinetic mechanism of protein adsorption to charged and uncharged core-shell microgels of colloidal dimension were explored. The soft polymeric layer of the shell is sensitive towards changes of the temperature, pH value, and salt concentration of the solution which results in a drastic volume change upon change of one of these triggers. Studies with Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy showed, that the secondary structure of the proteins used was significantly retained after immobilisation regardless of the charge state of the microgels employed. Moreover, unlike protein adsorption onto solid surfaces immobilisation into the networks did not compromise the catalytic activity of the proteins. Actually, an enhanced activity was found for some cases. The thermodynamic analysis performed by isothermal titration calorimetry (ITC) and structural investigations by FT-IR spectroscopy experiments led to the identification of the electrostatic and hydrophobic interactions as the main driving forces of protein adsorption. Further studies showed that proteins bound to negatively charged gel networks regulate their charge according to the electrostatic potential and to the lowered local pH value around the hydrogels. Fluorescence spectroscopy experiments with fluorescent-tagged proteins were suitable to analyse the kinetic uptake of the proteins into the gel networks as well as the reversibility of binding. It was demonstrated that bound proteins are dynamically exchanged by proteins in solution which justifies the application of equilibrium binding models to quantify the adsorption data. Moreover, the adsorption of proteins proceeds in two steps: i) a fast, diffusion-limited binding regime in which the majority of proteins is bound and ii) a second slow binding regime. The adsorption experiments were extended to binary protein mixtures in order to study competitive protein adsorption.

In dieser Dissertation wurden Verfahren für die konvergente Synthese von Peptide entwickelt. Für die erweiterte native chemische Ligation kamen bisher raumbeanspruchende Auxiliare zum Einsatz, die anspruchsvolle Ligationen behinderten. Zudem waren die drastischen säure-basierten Abspaltbedinungen mit vielen post-translationalen Modifikationen nicht vereinbar. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Auxiliargerüst mit geringerem Raumanspruch untersucht, dass eine erheblich mildere Abspaltung unter basischen Bedingungen ermöglichte. Dazu wurde ein kleiner Elektronenakzeptorsubsituent eingeführt, durch den nach der Ligation eine das Zielpeptid freisetzende Eliminierungsreaktion induziert werden konnte. Weiterhin konnte die Verwendung des kommerziell verfügbaren Penicillamins als Vorläufer in der Ligations-Entschwefelungs-Strategie demonstriert werden. Abschließend wurde die Ligation mit sequenz-internem Cystein untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Peptide mit Cystein in einer bestimmten Position bevorzugt in thioester-basierten Kondensationen reagierten. / In this thesis approaches for convergent synthesis of peptides have been developed. In the extended native chemical ligation so far space demanding auxiliaries encumbered challenging condensations. Furthermore the required drastic acidolytic cleavage conditions were furthermore incompatible with many post-translational modifications. In the thesis a nouvelle less space demanding scaffold was scrutinized which allowed a milder basic cleavage. Therefore a small electron-accepting substituent was introduced that enabled the induction of an elimination reaction liberating the target peptide after the peptide ligation had taken place. Furthermore the applicability of the commercially available penicillamine as precursor of valine in the ligation-desulfurization strategy could be demonstrated. Finally the ligation with sequence internal cysteines was scrutinized. Herein it could be shown that certain peptides with cysteine in a distinctive position of the sequence preferable reacted in thioester-based condensation reactions.