Der Verlust der chiralen Integrität am aktivierten Carboxylrest im Verlauf der Peptidsegmentkondensation mit Uroniumsalzen wird durch die Bildung von Oxazolon in Gegenwart des zur Aktivierung der Carboxylgruppe notwendigen tertiären Amins verursacht. Während der Aktivierung geschützter Peptidsegmente in Gegenwart von 2 Äq. des tertiären Amins ändert sich die Lage des Aktivester/Oxazolon - Gleichgewichtes in Abhängigkeit von der Natur der Abgangsgruppe im Uroniumsalz mit steigendem Oxazolongehalt in der Reihenfolge HONB<<HOBt<HOAt. Bei Segmentkupplungen mittels Uroniumsalzen wurde ein Ausmaß der Stereomutation direkt entgegengesetzt zur Menge an Oxazolon gefunden. Für diese unerwartete Reihenfolge sind der sinkende Anteil an freier N-Hydroxyverbindung zur Neutralisation der benötigten Base und unterschiedliche Geschwindigkeiten der Bildung und Aminolyse des intermediären Aktivesters verantwortlich. Hinsichtlich der Verringerung der Stereomutation werden alternative Aktivierungsmethoden diskutiert, wie die Herstellung von Aktivestern über Mischanhydride durch Verwendung von Chlorameisensäurealkyles tern und Zusatz von HONB oder die Verwendung des neuen Reagenzes Chlorocarbonyloxybenzotriazol. Eine neue effiziente Kupplungsmethode besteht in der Verwendung von Peptidsäurefluoriden, hergestellt durch Zusatz von Pyridin- poly(hydrogenfluorid) zum zuvor gebildeten Peptidoxazolon oder in dem Zusatz dieses HF-Additivs bei der Uroniumsalzkup plung zur Unterdrückung der basenkatalysierten Stereomutati on. Außerdem wurde hier erstmalig die bisher als erster Schr itt der Aktivierung mit Uroniumsalzen angenommene O-Acyluroniumverbindung am Modell der Aktivierung der sterisch gehinderten Mesitylencarbonsäure mit dem 7-Aza-benzotriazolyl-Reagenz HAPyU mittels 13C-NMR-Tieftem peratur-Untersuchungen direkt nachgewiesen. / Loss of chiral integrity at the activated carboxyl residue during peptide segment condensation by means of uronium salts is caused by the formation of oxazolone in the presence of the tertiary amine which is necessary for activation of carboxylic group. During activation of a protected peptide in the presence of 2 equivalents of tertiary amine the position of the active ester/oxazolone equilibrium is dependent on the nature of the leaving group of the uronium salt with an increasing oxazolone content in the order HONB<<HOBt<HOAt. Segment coupling by means of uronium salts result in an extent of stereomutation which is directly opposite to the extent of oxazolone formation. This unexpected order is caused by the presence of decreasing amounts of the free N-hydroxy component neutralizing the base, and differing rates of formation and aminolysis of intermediate active esters. Alternative activation procedur es are discussed with regard to reduction of stereomutation: the preparation of active esters through mixed anhydrides by use of alkyl chloroformates followed by addition of HONB or by use of the new reagent chlorocarbonyloxybenzotriazole. A new efficient coupling method resulted from the use of peptide acid fluorides prepared by addition of pyridin-poly (hydrogenfluoride) to pre-formed peptide oxazolone, or the addition of this HF-pyridine complex to couplings via uronium salts, suppressing the base-catalyzed stereomutation. For the first time, direct evidence of the O-acyluronium salt assumed to be the first step during activation via uronium salts was found by means of low temperature 13CNMR measurements of the activation of the sterical hindered mesitoic acid with the 7-aza-oxybenzotriazolyl derivative HAPyU.

Das 20S Proteasom bildet den Protein degradierenden Teil des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und ist damit an wichtigen zellulären Prozessen wie Genexpressionskontrolle, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Peptidgenerierung zur MHC Klasse I Präsentation und Degradation fehlgefalteter Proteine beteiligt. Die einzelnen Schritte der Biogenese des 20S Proteasoms in Eukaryoten sind bisher nur in Ansätzen verstanden. In dieser Arbeit wird die Untereinheitenzusammensetzung von Biogeneseintermediaten und ihre subzelluläre Lokalisation und Organisation in humanen Zelllinien untersucht. Durch die Etablierung eines in vitro Systems konnten distinkte Assemblierungsintermediate humaner Proteasomen generiert werden und ein (-Ring als früheres Intermediat im in vitro System nachgewiesen werden. Aufschluss über den weiteren Vorgang der Assemblierung wurden durch in vivo Experimente mit radioaktiv markierten HeLa Zellextrakten gewonnen. So konnten vor allem neu synthetisierte und zuletzt eingebaute Untereinheiten identifiziert werden. Hierzu gehören die Untereinheiten ?1 und (7, die aufgrund ihrer in trans agierenden C-terminalen Verlängerungen einen Dimerisierungsprozess zweier Halbproteasom-Vorläuferkomplexe forcieren. Darüber hinaus kann die Untereinheit (1 aufgrund der gewonnen Erkenntnisse als die wahrscheinlich den (-Ring schließende Untereinheit im Vorläuferkomplex postuliert werden. Proteasomale Assemblierungsintermediate konnten außerdem durch immuncytochemische und biochemische Methoden am ER von humanen Zelllinien lokalisiert werden. Dabei scheint dem Assemblierungsfaktor POMP eine Schlüsselrolle zuzukommen, da dieser eine Assoziation der Vorläuferkomplexe mit dem ER erst ermöglicht. In dieser Arbeit sind weitere Schritte des komplexen Biogenese-Vorgangs konstitutiver 20S Proteasomen in humanen Zelllinien aufgeklärt worden und es konnte erstmals die subzelluläre Lokalisation für Assemblierungsintermediate in humanen Zellen beschrieben werden. / The 20S Proteasom represents the protein degrading part of the Ubiquitin- Proteasom- System and is therefore a participant in important cellular processes like gene expression, cell cycle control, apoptosis, peptide generation for MHC class I presentation and degradation of misfolded proteins. Only the beginnings of the individual steps of the 20S proteasome biogenesis in eucaryotes are so far understood. Tis work examines the subunit composition of assembly intermediates and their subcellular localisation and organisation in eucaryotic cells. Distinct assembly intermediates of human proteasomes have been generated by establishing an in vitro system. As an earlier intermediate in the in vitro system an (-ring could be identified. In vivo experiments using radioactive marked total lysates of HeLa cells shed light on the following sequence of assembly. Thus new synthesised and finally incorporated subunits could be indentified. Two of this subunits are (1 and (7 which could force the dimerisation process of two half-proteasome-precursor by their trans acting c-terminal extensions. Furthermore the (1 subunit has been identified as the (-ring completing subunit in the precursor complex. In addition it was possible to detect proteasomal assembly intermediates through immuncytochemical and biochemical methods on the ER of human cell lines. Thereby the assembly factor POMP plays a key role as it allows in the first place the precursor association with the ER. This work clarifies further steps of complex procedure of biogenesis of constitutive 20S proteasomes in human cell lines and allows the characterisation of the subcellular localisation of assembly intermediates in human cells for the first time.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Analytik eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch auf Cisplatin-behandelte DNA reagiert und bereits routinemäßig zu diagnostischen Zwecken bei der Krebstherapie mit ebendiesem Zytostatikum eingesetzt wird. Zu diesem Zweck wurden vor allem massenspektrometrische Methoden eingesetzt, um einerseits den genauen Aufbau sowie die Zusammensetzung des Antikörpers zu untersuchen und andererseits die Antigenspezifität einer genaueren Betrachtung zu unterziehen. Mit Hilfe von nano-ESI-MS konnte der Antikörper unter Erhalt der nativen Struktur in der Gasphase analysiert werden. Tandem-MS-Experimente lieferten nicht nur einen Einblick in typische Fragmentierungs-muster, sondern generierten z. T. auch Informationen über die Primärsequenz einiger Bereiche des Antikörpers. Die im Fc-Teil gebundenen Glycanstrukturen, die sowohl für die Struktur als auch die Funktionalität des Antikörpers eine entscheidende Rolle spielen, wurden nach enzymatischer Abspaltung separat mit Hilfe von MALDI-MS analysiert. Die vollständige Antikörpersequenz wurde durch proteolytische Spaltung des Antikörpers, Analytik mittels hochaufgelöster Tandem-MS und anschließendem Vergleich mit Daten aus der Sequenzierung auf DNA-Ebene bzw. bekannten Antikörpersequenzen aus Proteindatenbanken aufgeklärt. Im selben Zug konnten auf Peptidebene eine Vielzahl verschiedener posttranslationaler Modifikationen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Antikörper unter Erhalt seiner Struktur und der antigenbindenden Eigenschaften an den Zuckerstrukturen mit einem eigens synthetisierten Metallkomplex markiert werden kann. Die für die Spezifitätsstudie des Antikörpers notwendigen Antigene wurden durch Inkubation synthetischer einzel- und doppelsträngiger DNA-Oligomere mit Cisplatin erzeugt und analysiert. Anschließend wurden die verschiedenen Antikörper-Antigen-Komplexe unter nativen Bedingungen hergestellt und massenspektrometrisch charakterisiert. Um einen Eindruck von der Komplexstabilität zu erhalten wurden zusätzlich MS/MS-Untersuchungen des Komplexes mit der platinierten doppelsträngigen DNA durchgeführt. Wie bei der Analytik des freien Antikörpers konnten auch hier spezifische Fragmente detektiert werden. / The focus of the thesis was the characterization of a monoclonal antibody, which binds specifically to cisplatin-treated DNA and is already used for diagnostic purposes in cancer therapy. The structure and composition of the antibody, as well, as the antigen specificity were investigated by mass spectrometry. Using nano-ESI-MS it was possible to analyse the antibody in its native state. Tandem-MS experiments revealed not only specific antibody fragments but also gave information on the primary structure of the antibody. The Fc-bound glycans that are responsible for antibody structure and functionality, were cleaved enzymatically and studied with MALDI-MS. For a detailed determination of the primary structure, the antibody was proteolysed with different enzymes and analyzed via high resolution Tandem-MS. The data was evaluated by comparism with results from sequence analysis on DNA level and known antibody sequences from protein databases. Simultaneously many different posttranslational modifications were identified. Furthermore, the antibody was successfully labelled with a metal complex at its sugar structures without loss of its structure and function. For investigation of the antibody specificity antigens were generated by incubation of well-defined single and double stranded DNA oligomers with cisplatin. Antibody-antigen-complexes were synthesized and analyzed by mass spectrometry under native conditions. The stability of the complex with double stranded DNA was also investigated by MS/MS-experiments. Thus, it was also possible to determine the specific fragmentation behavior for the complex just as for the free antibody.

Die Nachahmung natürlichen Kollagens stellt aufgrund dessen einzigartiger Struktur erhöhte Anforderungen an die chemische und biochemische Synthese artifizieller kollagenartiger Peptide. In dieser Arbeit wurden Cystein-Knoten und Organo-Template als Konzepte zur Vororganisation vorgestellt, um Peptideinzelstränge in die Anordnung kollagenartiger Dreifachhelices (CTH) zu dirigieren. Zusätzlich wurden diese mit einem schaltbaren DEPSI Struktursegment zur Steuerung der Helixstruktur kombiniert. Die templatbasierte Strategie beruht auf einem dreiarmigen Gerüstmolekül, an welches drei Peptideinzelstränge mittels nativer chemischer Ligation geknüpft werden. Für das Cystein-Knoten-Konzept wurden kollagen-mimetische Peptide entwickelt. Diese bestehen aus einer Cystein-reichen Domäne (wc2-Domäne) und einem Abschnitt, der eine kollagenartige Sequenz von [Gly-Pro-Pro]x aufweist. Die Vororganisation, als auch der Schalterdefekt zeigten maßgebliche Auswirkungen bezüglich der Adaption der Peptide in kollagenartige Dreifachhelices. Abhängig von der Position modulieren die Schalterdefekte die wc2-Organisation, die Nukleierung und den CTH-Faltungsprozess. Die Cystein-Organisationsdomäne wies den Vorteil auf, dass derartige Sequenzen ohne chemische Modifikation direkt im biotechnologischen Prozess in Unimere eingebracht werden konnten. Eine E. coli-basierte Produktionsstrategie ermöglichte den Zugang zu [GPP]50-Konstrukten, die ebenfalls die wc2-Domäne trugen. Weitere Untersuchungen wiesen zudem eine redox-reaktive Schaltbarkeit der Peptide nach. Um die Verwendbarkeit der synthetischen Kollagene als Biomaterial zu testen, wurde die Kompatibilität in zweidimensionalen Adhäsions- und Zytotoxizitätstests überprüft. / Due to its unique structure, the imitation of natural collagen increased the demands on the chemical and biochemical synthesis of artificial collagen mimetic peptides (CMPs). In this thesis, concepts of cysteine knots and organo-templates were presented for the reorganization of peptide single strands into the arrangement of collagenous triple helices (CTHs). These techniques were additionally combined with a switchable DEPSI structure segment to further control the helix structure. The template-based strategy relies on a three-armed scaffold to which three peptide strands are attached by native chemical ligation. For the cysteine-knot concept, collagen mimetic peptides consisting of a cysteine-rich domain (wc2-domain) and a domain with a collagen-like sequence of [Gly-Pro-Pro]x were developed. The preorganization, as well as the switch defect, showed significant effects on the adaptation of the peptides in collagenous triple helices. Depending on the position, the switch defects modulate wc2-organization, nucleation and the CTH folding process. This cysteine organization domain had the advantage that such sequences could be introduced into unimers directly in the biotechnological process without chemical modification. An E. coli-based production strategy allowed access to [GPP]50 constructs, which also carried the wc2-domain. Further investigations also showed a redox-reactive switchability of the peptides. To examine the utility of the synthetic collagen as a biomaterial, compatibility was tested in two-dimensional adhesion and cytotoxicity tests.

Nukleinsäuren und Peptide erlauben es, Kontrolle über molekulare Prozesse auszuüben. In dieser Arbeit werden strukturgebende Elemente wie Coiled-Coil-Peptide oder PNA∙DNA-Strukturen genutzt, um Rezeptoren auf lebenden Zellen zu markieren und in ihrem Verhalten zu modulieren, oder cytosolische Proteine in ihrem Bindungsverhalten zu steuern. Im ersten Konzept wird die Interaktion des Coiled-Coil-Paars K3/E3 genutzt, um eine Transferreaktion, in welcher eine PNA-Sequenz vom K3-Donor auf den E3-Akzeptor übertragen wird, zu induzieren. Durch die Fusion des Akzeptorpeptids mit einem Rezeptor werden kovalente PNA-Rezeptorkonjugate auf der Oberfläche lebender Zellen geschaffen. Die Reaktion zwischen Thiol und Thioester erlaubt dabei einen schnellen Transfer. So wurden Rezeptoren aus der Familie der GPCR sowie der EGFR mit einem PNA-Strang versehen und durch fluoreszente PNA oder DNA selektiv markiert. Zusätzlich wurden verzweigte DNA-Architekturen mit mehreren Fluorophoren genutzt, um die Helligkeit der Markierung quantitativ zu erhöhen. Die PNA-EGFR-Konjugate wurden durch eine zwei Rezeptoren verbrückende Cy3-DNA adressiert und so zeitgleich markiert und dimerisiert. Dadurch wurde die Rezeptoraktivität gesteigert, was über Western Blot-, Immunofluoreszenz- und Fluoreszenzmikroskopieanalyse belegt wurde. In weiteren Ansätzen wurden Coiled-Coil-Systeme genutzt, um i) parallel zwei verschiedene Akzeptorpeptide mit verschiedenen Fluorophoren zu markieren und ii) Coiled-Coil-Peptide schaltbar zu machen. Durch die asymmetrische Verlängerung von K3/E3-Paaren mit Coiled-Coil-Sequenzen kann die Interaktion der Peptide an und aus geschaltet werden. Dies wurde sowohl in einem Fluoreszenzassay als auch in einer direkten Anwendung an der Syk-Kinase demonstriert. Die Liganden der Kinase wurden an den schaltbaren Peptiden angebracht und so die Affinität zur Syk-Kinase kontrolliert. / Nucleic acids and peptides can be used to obtain control over molecular processes within living cells. In this work, structural elements as coiled-coil peptides or PNA∙DNA-structures were used to label and modulate receptor behavior on living cells and to control ligand binding of cytosolic proteins. For the first concept the K3/E3-coiled-coil peptide pair was used to establish a proximity-guided, covalent transfer of a PNA strand from a K3-donor peptide onto the complementary E3-acceptor peptide. By fusion of the acceptor peptide to a receptor, PNA-receptor-conjugates were generated selectively on living cells. The native chemical ligation type of reaction allowed a fast PNA-transfer within minutes. Receptors from the family of GPCRs and the EGFR were tagged with a PNA-sequence and subsequently labeled by the addition of a fluorescent DNA or PNA. By recruiting branched DNA architectures which were decorated with several fluorophores, the total brightness of the labeling was increased quantitatively. A twice complementary Cy3-DNA was used to simultaneously label and dimerize the EGFR. Thereby, an artificially induced increase in receptor activity could be achieved, which was shown in Western Blot and immunofluorescence analysis as well as in fluorescence microscopy. In two other approaches coiled-coil peptides were used to i) label two different acceptor peptides simultaneously with two different dyes and ii) introduce coiled-coil peptides as part of a dynamic switchable system. Using an asymmetric coiled-coil elongation on the K3/E3 pair the interaction of both can be turned on and off. This was demonstrated in a fluorescence assay and applied to the Syk kinase, were Syk ligands were attached to the switchable peptides. Those ligands were changed from a bi- to a monovalent presentation status and thus the affinity of the Syk kinase towards its ligands can be controlled.

Um die Funktion von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen, ist es unerlässlich ihre Lokalisation und Bewegung im lebenden System durch z.B Fluoreszenz-markierung sichtbar zu machen. Eine ideale Markierungsmethode zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Zielprotein (protein of interest, POI) selektiv und in kurzer Zeit mit einer maßgeschneiderten Reportergruppe ausstattet, ohne die Proteinfunktion und -lokalisation zu beeinflussen. Dabei ist die Größe der Erkennungssequenz von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Markierungsstrategie beschrieben, bei der die Ausbildung eines parallelen Coiled-Coil-Motivs den Transfer einer Reportergruppe auslöst. Untersucht wurde dabei die Übertragung eines Sulfonat-gebundenen Fluorophors auf ein Cystein in der Erkennungssequenz durch nukleophile Substitution. Ebenfalls untersucht wurde der Transfer verschiedener Thioester-verknüpfter Reporter auf ein N-terminales Cystein der Erkennungssequenz durch eine Acyltransferreaktion. Beide Strategien zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und einen geringen Massenzuwachs am Zielprotein aus. Der Acyltransfer mit Arylthioestern zeigte zudem eine bemerkenswerte Reaktivität und erlaubte eine Markierung innerhalb weniger Minuten Reaktionszeit. Die Vielfältigkeit dieser Methode wurde anhand der Fluoreszenzmarkierung von sieben verschiedenen G-Protein gekoppelten Membranrezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen demonstriert. Die markierten Rezeptoren blieben dabei funktional und konnten ihren entsprechenden Liganden mit hoher Affinität binden. / In order to understand the function of proteins in their native environment, it is crucial to visualize their localization and trafficking in living cells by means of e.g. fluorescence labeling. An ideal labeling method adds a custom reporter group to the protein of interest (POI) in a selective and fast manner without disturbing the POIs function and localization. Hence the size of the recognition sequence is of major concern. This work describes the development of a labeling strategy in which the formation of a parallel coiled coil motif triggers the transfer of a reporter group. The transfer of a sulfonate-linked fluorescence dye onto the cysteine-modified recognition sequence via a nucleophilic substitution reaction was tested. Also the transfer of various thioester-linked reporters onto the N-terminal cysteine of the recognition sequence via an acyl transfer reaction was investigated. Both strategies are characterized by a high selectivity and low mass increase at the target protein. The acyl transfer with aryl thioesters also showed a remarkable reactivity and allowed labeling reactions to proceed within minutes. The versatility of this method was demonstrated by applying it to the labeling of seven different G-protein coupled membrane receptors on the surface of living cells. The labeled receptors remained functional and were able to bind their respective ligand with high affinity.

Die oxidative Transformation der Thiol-Gruppe des Cysteins in verschiedene andere funktionelle Gruppen wird als sehr wichtige posttranslationale Modifikation (PTM) angesehen. Cysteinsulfensäure (SA) ist eine Zwischenstufe der Thiol-Oxidation: Sie kann entweder mit freien Thiolen reagieren, um Disulfide zu bilden oder durch reaktive Sauerstoffspezies (reactiveoxygenspecies, ROS) weiter oxidiert werden. Jede Störung des zellulären Redox-Haushalts wird mit altersbedingten Erkrankungen , daher stellt die Überwachung des SA-Spiegels einen vielversprechenden Wegdar, den Status dieses Redox-Haushalts festzustellen. Da bereits kleinste Änderungen der Proteinmengen und PTMs tiefe Einblicke in den Zustand des biologischen Systems liefern können, ist eine quantitative Bestimmung von großer Bedeutung.Technologische Fortschritte im Bereich der Trennungsmethoden und Massenspektrometrie (MS) erlaubten die Entwicklung umfassender Möglichkeiten in der Protein-Analytik. In dieser Arbeit wurde eine neue, hochsensitive und selektive Methode zur Detektion von SA entwickelt. Dafür wurde ein Alkin-β-Ketoester (KE) an einen Lanthanid-haltigen (Ln) Chelatkomplex. Zum Nachweis des Funktionsprinzips wurden, mittels H2O2, Sulfensäuren in verschiedenen Peptidsequenzen erzeugt, um die in biologischen Systemen durch ROS hervorgerufenen Oxidationen nachzustellen. Diese Sulfensäuren wurden anschließend durch den Ln-DOTA-KE-Komplex gebunden. Die Bildung dieser SA-Ln-DOTA-KE-Einheit wurde mittels (Elektronenspray-Ionisation/ ESI-MS) und (induktiv gekoppeltem Plasma/ICP-MS) nachverfolgt. Die entwickelte Methode wurde weiterhin auf die Bestimmung von SA-Bildung in humanem Serum angewandt, humanes Serumalbumin wurde angereichert via Affinitätschromatographie. ICP-MS diente der Bestimmung der SA-Ln-DOTA-KE-Einheit, durch Kombination mit einer Isotopenverdünnungsanalyse (IDA) wurde eine absolute Quantifizierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen oxidative Schäden bis zu 40 % des vorhandenen Albumins. / Oxidative transformation of cysteine thiol group into different functional groups is considered a significant posttranslational modification (PTM) of great importance. Cysteine sulfenic acid (SA) is the transient state for thiol group oxidation; it can react with free thiols to form disulfide bonds or can be further oxidized with reactive oxygen species (ROS) to form sulfinic and sulfonic acids. As any disturbance in the cellular reduction-oxidation (redox) balance is correlated to age-related diseases, the detection of SA transient state formed a sensor for such redox-mediated events. Whereas only any small change in the quantity of proteins, as well as the formed PTMs, can provide deeper insights into the status of the biological system, quantitative analysis should be carried out to reveal the status of the system. On the other hand, the technological advances, in particular the separation techniques and mass spectrometry (MS), allowed the development of several approaches for the comprehensive assessment of proteome analysis. Herein, we provide a new strategy for the highly sensitive and specific detection of SA using alkyne β-ketoester (KE) previously linked to a lanthanide (Ln)-containing chelator (Ln-DOTA. SA was generated by hydrogen peroxide (H2O2) in different peptide sequences by ROS and was detected by the prepared compound Ln-DOTA-KE. Molecular mass spectrometry (electrospray/ ESI-MS) and (Inductively coupled plasma mass spectrometry /ICP-MS) have been used to monitor the formation of SA linked to Ln-DOTA-KE. The developed strategy has been further applied to the determination of SA-induced formation in human serum by using affinity chromatography for purification of albumin followed by ICP-MS to monitor the formed SA linked to Ln-DOTA-KE in combination with isotope dilution analysis (IDA) for the absolute quantification. Quantitative results showed levels of oxidative damage regarding SA formation in human serum up to 40% of the albumin present.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Thermodynamik und Kinetik der Proteinadsorption auf neutralen sowie geladenen, kolloidalen Kern-Schale-Mikrogelen untersucht. Die weiche polymere Schicht der Schale reagiert mit großen Volumenänderungen auf Änderungen der Umgebungstemperatur, des pH-Wertes oder der Salzkonzentration. Untersuchungen mit Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigten, dass generell die native Sekundärstruktur der verwendeten Proteine, die auf den Mikrogelen adsorbiert wurden, erhalten blieb. Im Gegensatz zur Proteinadsorption auf festen Oberflächen wurde zudem eine hohe katalytische Aktivität der Enzyme nach der Immobilisierung verzeichnet, die gegenüber derjenigen der freien Enzyme in manchen Fällen sogar erhöht war. Mithilfe der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) und FT-IR Spektroskopie wurden als treibende Kräfte des Adsorptionsprozesses elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen identifiziert. Weitere Untersuchungen zeigten, dass im Falle von geladenen Mikrogelen das elektrostatische Potential wie auch der abgesenkte lokale pH-Wert innerhalb des Netzwerks eine Änderung des Ladungszustands der adsorbierenden Proteine zur Folge hat. Zusätzlich konnte mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie und der Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine die kinetische Aufnahme in die Mikrogele als auch die Reversibilität der Reaktion analysiert werden. Es wurde dabei ein dynamischer Austausch zwischen gebundenen und freien Proteinmolekülen nachgewiesen, welcher die Verwendung von Gleichgewichtsmodellen für die Beschreibung der Proteinadsorption rechtfertigt. Außerdem erfolgt der Vorgang in zwei Schritten: i) ein schneller diffusionslimitierter Schritt, in dem der Hauptteil der gesamten Proteinmenge bindet und ii) ein anschließender wesentlich langsamerer Bindungsvorgang. Die Adsorptionsexperimente wurden anschließend auf Untersuchungen in binären Proteinmischungen ausgedehnt, um die kompetitive Proteinadsorption zu studieren. / In the present work the thermodynamics and the kinetic mechanism of protein adsorption to charged and uncharged core-shell microgels of colloidal dimension were explored. The soft polymeric layer of the shell is sensitive towards changes of the temperature, pH value, and salt concentration of the solution which results in a drastic volume change upon change of one of these triggers. Studies with Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy showed, that the secondary structure of the proteins used was significantly retained after immobilisation regardless of the charge state of the microgels employed. Moreover, unlike protein adsorption onto solid surfaces immobilisation into the networks did not compromise the catalytic activity of the proteins. Actually, an enhanced activity was found for some cases. The thermodynamic analysis performed by isothermal titration calorimetry (ITC) and structural investigations by FT-IR spectroscopy experiments led to the identification of the electrostatic and hydrophobic interactions as the main driving forces of protein adsorption. Further studies showed that proteins bound to negatively charged gel networks regulate their charge according to the electrostatic potential and to the lowered local pH value around the hydrogels. Fluorescence spectroscopy experiments with fluorescent-tagged proteins were suitable to analyse the kinetic uptake of the proteins into the gel networks as well as the reversibility of binding. It was demonstrated that bound proteins are dynamically exchanged by proteins in solution which justifies the application of equilibrium binding models to quantify the adsorption data. Moreover, the adsorption of proteins proceeds in two steps: i) a fast, diffusion-limited binding regime in which the majority of proteins is bound and ii) a second slow binding regime. The adsorption experiments were extended to binary protein mixtures in order to study competitive protein adsorption.

In dieser Dissertation wurden Verfahren für die konvergente Synthese von Peptide entwickelt. Für die erweiterte native chemische Ligation kamen bisher raumbeanspruchende Auxiliare zum Einsatz, die anspruchsvolle Ligationen behinderten. Zudem waren die drastischen säure-basierten Abspaltbedinungen mit vielen post-translationalen Modifikationen nicht vereinbar. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Auxiliargerüst mit geringerem Raumanspruch untersucht, dass eine erheblich mildere Abspaltung unter basischen Bedingungen ermöglichte. Dazu wurde ein kleiner Elektronenakzeptorsubsituent eingeführt, durch den nach der Ligation eine das Zielpeptid freisetzende Eliminierungsreaktion induziert werden konnte. Weiterhin konnte die Verwendung des kommerziell verfügbaren Penicillamins als Vorläufer in der Ligations-Entschwefelungs-Strategie demonstriert werden. Abschließend wurde die Ligation mit sequenz-internem Cystein untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Peptide mit Cystein in einer bestimmten Position bevorzugt in thioester-basierten Kondensationen reagierten. / In this thesis approaches for convergent synthesis of peptides have been developed. In the extended native chemical ligation so far space demanding auxiliaries encumbered challenging condensations. Furthermore the required drastic acidolytic cleavage conditions were furthermore incompatible with many post-translational modifications. In the thesis a nouvelle less space demanding scaffold was scrutinized which allowed a milder basic cleavage. Therefore a small electron-accepting substituent was introduced that enabled the induction of an elimination reaction liberating the target peptide after the peptide ligation had taken place. Furthermore the applicability of the commercially available penicillamine as precursor of valine in the ligation-desulfurization strategy could be demonstrated. Finally the ligation with sequence internal cysteines was scrutinized. Herein it could be shown that certain peptides with cysteine in a distinctive position of the sequence preferable reacted in thioester-based condensation reactions.

Die vorliegende Arbeit untersucht mit bioinformatischen Methoden die biologische Bedeutung von Ähnlichkeiten in Kleinstrukturen und peptidischen Sequenzmotiven sowie lokaler und globaler Sequenzähnlichkeit. Der erste Teil der Arbeit behandelt chemische Ähnlichkeiten. Ausgehend von bekannten Inhibitoren der Fehlfaltung des Prionproteins wurde eine Datenbank pharmakologischer Wirkstoffe nach chemisch und strukturell ähnlichen Substanzen durchsucht und 16 Substanzen als neue potentielle Inhibitoren der Fehlfaltung vorgeschlagen. Der nächste Teil untersucht Ähnlichkeiten in Sequenzmotiven, die eine Interaktion mit Pex19, dem Importrezeptor für peroxisomale Membranproteine, vermitteln. In Zusammenarbeit mit einer experimentellen Arbeitsgruppe konnte die Bindestelle charakterisiert und Präferenzen für bestimmte Aminosäuren herausgearbeitet werden. Das Bindemotiv ist eine vermutlich helikale Region mit verzweigtkettigen aliphatischen und basischen Aminosäuren. Aus experimentellen Daten konnte eine positionsabhängige Vorhersagematrix erstellt und validiert werden. Die Beziehung zwischen lokalen Sequenzähnlichkeiten und der Konformation von Prolylbindungen in Proteinen ist Thema des dritten Teils. Die Aminosäurepräferenzen in der Nachbarschaft von cis- und trans-Prolylresten unterscheiden sich, und beide zeigen unterschiedliche Austauschpräferenzen bei Mutationen. Im Gegensatz zu lokaler Sequenzähnlichkeit ist eine globale Sequenzähnlichkeit von nur 20% ein wesentlich besserer Indikator für das Auftreten von cis-Prolylbindungen. Der letzte Teil befaßt sich mit inverser Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen, die wesentlich öfter auftritt als erwartet. Proteine aus einem nichtredundanten Datensatz wurden gleich- und gegenläufig aligniert und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen den aufgefundenen Proteinpaaren untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß bis auf kurze Sekundärstruktur-Einheiten eine inverse Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen keine strukturelle Ähnlichkeit impliziert. / This work is dealing with the biological impact of similarities between chemical structures, protein sequence motifs and local sequence surrounding as well as global sequence similarity. All four aspects are analyzed by computational methods. The first part is dealing with chemical similarities. Based on a recently published set of prion protein misfolding inhibitors, a data base of approved drugs has been screened for compounds with chemical and structural similarities to these substances. 16 drugs are proposed as new potential inhibitors of prion protein aggregation. The next part addresses similarities of sequence motifs which mediate the interaction with the peroxisomal membrane protein import receptor Pex19. In cooperation with an experimental group, the binding site could be characterized, and amino acid preferences of the different positions of the motif have been determined. The binding motif is a probably helical region of target proteins bearing branched aliphatic and basic residues. A position specific scoring matrix for the prediction of Pex19 binding sites could be generated and validated. The relation between local sequence similarity and prolyl bond conformation is examined in the third part. Amino acid preferences of neighboring residues differ between cis and trans prolyl residues, and both species show different amino acid exchange patterns upon mutation. In contrast to local sequence similarity, overall sequence similarity between proteins as low as 20% is a much better indicator for the occurrence of cis prolyl bonds. The last part focuses on inverse sequence similarity between proteins which occurs far more often than expected by chance. Proteins from a nonredundant data set have been aligned in parallel and antiparallel, and structural similarities between the detected protein pairs have been examined. It could be shown that, with the exception of short secondary structural elements, inverse sequence similarity does not imply structural similarity.