Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es valide chemische Verfahren für die Optimierung der Gesamtleistung von Glykan-Microarrays bereitzustellen. Dafür erfolgte eine gründliche Untersuchung jedes einzelnen Prozessschritts innerhalb der Arrayproduktion durch Anwendung komplementärer Methoden der chemischen Oberflächenanalytik. Mit Hilfe von fortgeschrittenen Verfahren der Elektronen-Spektroskopie für die chemische Anlayse (ESCA/XPS) wurden valide quantitative Daten bei der chemischen Charakterisierung der Oberflächen erhalten die mit den häufig eingesetzten qualitativen bzw. indirekten Verfahren (z.B. Kontaktwinkel Goniometrie und Fluoreszenz-Spektroskopie) so nicht erhalten werden können. Die robuste Anbindung von Glykanen auf der Substratoberfläche ist Voraussetzung für eine reproduzierbare Anwendung in der Diagnostik aber auch für die Entwicklung valider quantitativer Charakterisierungsmethoden zur Bewertung der Effizienz der Immobilisierungsreaktionen. Ein Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung und Optimierung der Glykananbindung an amin-reaktive Oberflächen. Hierzu wurden z.B. spezielle Glykane mit Fluorlabel auf epoxid-funktionalisierten Siliziumoberflächen immobilisiert. Eine Quantifizierung der angebundenen Glykane ist zum Beispiel über die Bestimmung der CF3-Gruppe im hochaufgelösten C1s XPS Spektrum möglich. Die Interaktionen Sonde-Analyt wurden modellhaft mit immobilisierten Glykanen und dem Lektin Concanavalin A mit Verfahren der chemischen Oberflächenanalytik untersucht. Neben der chemischen Charakterisierung frisch präparierter Glykansonden wurde auch das Alterungsverhalten der Glykan-Microarrays untersucht. / The objective of this research is to sidestep many of the initial and current problems of glycan microarray based devices by using new analytical approaches to control molecular engineering. For this purpose, a thorough investigation of each individual step in the array production is carried out by applying complementary methods of surface chemical analysis. New fluorophore-free protocols based on methods of surface analysis as XPS will be developed and validated to enable glycan microarray performance optimization. The advantage of these methods is the direct quantitative access to chemical bonds at high lateral resolution. In contrast to the frequently used qualitative or indirect methods (e.g. contact angle goniometry and fluorescence spectroscopy), valid quantitative data are obtained. The robust binding of glycans on the substrate surface, is a prerequisite for a reproducible application in the diagnostics but also for the development of valid quantitative characterization methods for the evaluation of the efficiency of the immobilization reactions. One focus of the work was the characterization and optimization of the glycan binding to popular amine-reactive surfaces. For this purpose, specific glycans with fluorine-label were immobilized on epoxide-functionalized silicon surfaces. A quantification of the attached glycan molecules is possible, for example, by determining the amount of CF3 groups using the high-resolution C1s XPS spectrum. The interactions between model probe (glycan molecules) and model analyte (lectin concanavalin A) were investigated using powerful methods surface chemical analysis. In addition to the chemical characterization of freshly prepared glycan probes, the aging behavior of the glycan microarrays was also investigated.

Die Wechselwirkung zwischen Kohlenhydraten und Lektinen ist relativ schwach. Dennoch ist sie in einer Fülle biologischer Prozesse von essentieller Bedeutung. Eine Verstärkung der Bindungsaffinität wird häufig durch Multivalenz, d. h. die Ausbildung mehrerer Bindungen zwischen zwei Bindungspartnern, realisiert. Neben der reinen Anzahl der präsentierten Liganden spielt jedoch auch deren Positionierung im Raum eine große Rolle. In dieser Arbeit wurde ein molekulares Lineal entwickelt, das einen modular aufgebauten PNA/DNA-Duplex als Gerüst nutzt und die Präsentation von Liganden im Raum mit atomarer Auflösung ermöglicht. Die Anzahl der präsentierten Liganden, der Abstand zwischen diesen und die Flexibilität des Gerüsts, das diese verbindet, können einerseits fein moduliert werden und sind andererseits sehr gut vorhersagbar. Mittels diverser Bindungsassays wurde zunächst gezeigt, dass das Werkzeug für die räumliche Rasterung von Kohlenhydrat-Lektin-Wechselwirkungen geeignet ist. Die ermittelten räumlichen Anordnungen der Bindungstaschen von Erythrina cristagalli Lektin (ECL) und Ricinus communis Agglutinin (RCA120) waren in Übereinstimmung mit den Kristallstrukturanalysen. Im Fall von RCA120 wurde neben den primären Bindungstaschen zudem eine potentielle sekundäre Bindungstasche identifiziert. Anschließend wurde das Werkzeug für die räumliche Rasterung eines weniger gut charakterisierten Systems verwendet. Im Detail handelte es sich um die Wechselwirkung zwischen Selektinen und seinen Liganden wie sie während der Leukozytenadhäsionskaskade infolge einer Entzündung auftritt. Als Liganden wurden das natürliche Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X und ein artifizielles DNA-Aptamer präsentiert. Dabei zeigte sich, dass der Abstand zwischen zwei bivalent präsentierten Liganden nur einen geringen Einfluss auf die Bindungsaffinität hatte. Die Selektin-Moleküle besaßen demnach eine hohe Flexibilität und/oder waren nicht absolut starr in der Membran verankert. / The interaction between carbohydrates and lectins is relatively weak. Still, it is of great importance in a plethora of biological processes. An enhancement of the binding affinity is often achieved via multivalency, i.e., the formation of several bonds between two binding partners. Besides the number of presented ligands, their spatial alignment is crucial as well. In this study, a molecular ruler was developed that utilizes a modularly assembled PNA/DNA duplex as scaffold and allows the presentation of ligands in space with atomic resolution. The number of presented ligands, the distance between them, and the flexibility of the scaffold that connects them can be nicely modulated and, at the same time, are very well predictable. By using various binding assays it was first shown that this tool is suitable for the spatial screening of carbohydrate-lectin interactions. The determined spatial alignments of the binding sites of Erythrina cristagalli lectin (ECL) und Ricinus communis agglutinin (RCA120) were in agreement with the crystal structure analyses. In addition to the primary binding sites, a potential secondary binding site was identified in the case of RCA120. Afterwards, the tool was used for the spatial screening of a system that is less well characterized. In detail, this was the interaction between selectin and its ligands as it occurs during the leukocyte adhesion cascade as a result of an inflammation. The natural tetrasaccharide sialyl-Lewis-X as well as an artificial DNA aptamer were presented as ligands. It was found that the distance between two bivalently presented ligands had only a minor effect on the binding affinity. Accordingly, the selectin molecules had a high flexibility and/or were not absolutely rigid anchored in the membrane.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden drei neue Zugangswege zu kettenverlängerten Kohlenhydraten aus ungeschützten Aldosen entwickelt. Dabei ermöglichen diese Protokolle die Synthese verschiedener Klassen von kettenverlängerten Strukturen. Neben der selektiven Darstellung von 2-Ketoaldonsäurederivaten konnten effiziente Zugangsstrategien zu hoch funktionalisierten bizyklischen C-Glycosiden und polyhydroxylierten Pseudopeptiden präsentiert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein breites Spektrum dieser verschiedenen Arten kettenverlängerter Kohlenhydrate aus ungeschützten natürlichen Hexose- und Pentose-Substraten zugänglich ist. Durch den Einbezug der natürlich vorhandenen Hydroxylgruppen der Aldosen ermöglichen die präsentierten Kaskadenreaktionen einen sehr effektiven Zugang zu hoch funktionalisierten Produkten, welche in Sequenzen unter Verwendung von Schützungsstrategien nur in aufwendigen, mehrstufigen Reaktionen zugänglich wären. Zudem konnte gezeigt werden, dass die natürlich vorkommende Chiralität in den verwendeten Substraten für ein stereoselektives Dirigieren der neu installierten Stereozentren nutzbar ist. Damit konnte eine bedeutende Erweiterung des bestehenden Repertoires von Methoden für die Verlängerung ungeschützter Kohlenhydrate erreicht werden.. Die entwickelten Transformationen bestechen durch ihre hohe Atomökonomie, wie auch durch ihre sehr gute ökologische und ökonomische Bilanz und erfüllen damit die Anforderungen an nachhaltige Synthesemethoden. / The scope of the presented work was the investigation of new organocatalysed synthesis strategies of carbon chain elongated carbohydrates. Here three new accesses to three different structure motifs of these biologically highly important and manifold compounds from unprotected carbohydrates were developed. Using naturally occurring, unprotected pentoses and hexoses, a wide variety of keto aldonic acids, bicyclic C-glycosides and glycosylated pseudopeptides are accessible in three different cascade reactions. All of the presented strategies enable the C-chain elongation by employment of the naturally occurring aldehyde motive without tedious protection ad deprotection protocols or synthetic modifications of the substrates. By utilisation of the chiral hydroxyl moieties of the carbohydrate chain, diastereoselective control of the installation of the stereocenters formed in the cascade reactions is achieved. The high regio- and diastereoselectivities, high yields as well as the convenient synthesis conditions of the presented protocols make the presented cascade reactions valuable tools among the already described accesses to the biological important compounds of chain elongated carbohydrates. The presented cascades enable the diastereoselective synthesis of a high variety of these motifs in only one synthetic step from readily available unprotected carbohydrates without additional modification steps. These advantages give rise to a very high atom economy of the transformations, which therefore fulfil the requirements to green chemistry and sustainable synthesis methods.

Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte. / Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

Sialinsäuren sind Teil der äußersten Komponente der Glykokalyx aller Wirbeltiere. Als solche sind sie grundlegende Marker in physiologischen und pathologischen Prozessen. Der „Hauptregulator“ der Sialinsäure-Biosynthese ist die bifunktionelle UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin-Kinase (GNE/MNK). Das Hauptziel dieser Dissertation war die Identifizierung neuer Inhibitoren der GNE-Subdomäne, die zur Hemmung der Sialinsäurebiosynthese in Zellen und zur Verringerung der Sialylierung der Zelloberfläche eingesetzt werden könnten. Zu diesem Zweck wurde GNE rekombinant exprimiert und eine Screening-Kampagne mit fast 70 000 Verbindungen gegen seine Aktivität durchgeführt. Die primären Treffer aus der Screening-Kampagne wurden anschließend in vitro und in cellulo charakterisiert. Die Inhibitoren haben nicht auf Zellen funktioniert, dafür haben sie in einem neu entwickelten NMR basierten Assay GNE Aktivität im Rattenleberzytosolextrakt inhibiert. / Sialic acids are part of the outermost component of the glycocalyx of all vertebrates. As such, they are fundamental markers in physiological and pathological processes. The "main regulator" of sialic acid biosynthesis is the bifunctional UDP-N-Acetylglucosamine-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin Kinase (GNE/MNK). The main objective of this dissertation was the identification of new inhibitors of the GNE subdomain, which could be used to inhibit sialic acid biosynthesis in cells and reduce the sialylation of the cell surface. For this purpose, GNE was recombinantly expressed and a screening campaign against its activity was conducted with nearly 70,000 compounds. The primary hits from the screening campaign were subsequently characterized in vitro and in cellulo. The inhibitors did not work on cells, but they inhibited GNE activity in a rat liver cytosol extract in a newly developed NMR-based assay.

Das Prinzip der Multivalenz ist in der Natur allgegenwärtig, welches auch von Influenza-Viren genutzt wird, um über ihre Oberflächenproteine an epitheliale Wirtszellen zu binden. Diese Interaktion bietet einen interessanten Ansatzpunkt für multivalente Inhibitoren, wenn es gelingt, die Bedingungen für eine effiziente Wechselwirkung mit dem Virus zu entschlüsseln. Hierzu wurde in dieser Arbeit eine Charakterisierung des Hämagglutinin-Trimers (HA) auf viralen Partikeln mittels Kohlenhydrat-Nukleinsäuregerüsten und Kohlenhydrat-Polyethylenglykol (PEG)-Gerüsten vorgenommen. Distanz-Affinitäts-Beziehungen für die Interaktion des trimeren HA mit den bivalenten Präsentationen des Sialyl-LacNAc zeigten, dass bivalente PEG-Konjugate nicht in der Lage sind, eine bivalente Verstärkung der Wechselwirkungen mit der löslichen HA-Ektodomäne oder mit HA auf der viralen Oberfläche herbeizuführen, wobei die räumliche Rasterung mit PNA∙DNA-Gerüsten eine bimodale Distanz-Affinitäts-Beziehung ergab. Ein Affinitätsmaximum in einem Abstand von 52 - 59 Å wurde einer simultanen Bindung an zwei kanonische Bindungsstellen eines HA-Trimers zugeordnet, wobei ein zweites Affinitätsmaximum bei 26 Å auf die Existenz einer sekundären Bindungsstelle hindeutet. In dieser Arbeit wurde erstmals die multivalente Präsentation von Glykoliganden auf langen repetitiven DNA-Templaten demonstriert. Es wurden Nukleinsäure-Komplexe erhalten die eine vollständige Inhibierung der Virus-induzierten Hämagglutination bei einer Konzentration von 10^(-9) M des Templats erzielten, was einer 10^7-fachen Verstärkung bezogen auf den monovalenten Zucker entspricht. Neben einer hochpotenten Inhibition offenbarten distanzoptimierte bivalente und multivalente Binder auf Nukleinsäuregerüsten auch subtypspezifische Inhibition. / The principle of multivalency is omnipresent in nature, which is also used by influenza viruses to bind to epithelial host cells via their surface proteins. This interaction offers an interesting starting point for multivalent inhibitors if the conditions for an efficient interaction with the virus can be deciphered. For this purpose, the hemagglutinin trimer (HA) on viral particles was characterized using carbohydrate-nucleic acid scaffolds and carbohydrate-polyethylene glycol (PEG) scaffolds. Distance-affinity relationships for the interaction of the trimeric HA with the bivalent presentations of the sialyl-LacNAc showed that bivalent PEG conjugates are not capable of a bivalent enhancement of the interactions with the soluble HA ectodomain or with HA on the viral surface, whereby the spatial screening with PNA∙DNA scaffolds resulted in a bimodal distance-affinity relationship. An affinity maximum at a distance of 52 - 59 Å was assigned to simultaneous binding to two canonical binding sites of an HA trimer, with a second affinity maximum at 26 Å indicating the existence of a secondary binding site. In this work the multivalent presentation of carbohydrate ligands on long repetitive DNA templates was demonstrated for the first time. Nucleic acid complexes were obtained which achieved a full inhibition of the virus-induced hemagglutination at a concentration of 10^(-9) M of the template, which corresponds to a 10^7-fold increase in relation to the monovalent sugar. In addition to a highly potent inhibition, distance-optimized bivalent and multivalent binders on nucleic acid structures also revealed subtype-specific inhibition.