Eine wichtige Eigenschaft der Plasmamembran eukaryotischer Zellen ist die stabile transversale Asymmetrie der Phospholipide. Sie wird energieabhängig durch die Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase aufrechterhalten und gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis der Zellen. Die Plasmamembran einiger Säugerzellen weist zudem laterale Lipiddomänen auf, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Während der Genese durchlaufen die Membranen der Säugerspermien intensive Veränderungen. Um die Bedeutung der Phospholipidasymmetrie für die Funktion der Spermien zu untersuchen, wurde die Lokalisation und Dynamik von Phosphatidylserin in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien im Verlauf von Kapazitation und Akrosomreaktion betrachtet. Unter Ausnutzung der selektiven, kalziumabhängigen Bindung von AnnexinV an endogenes Phosphatidylserin konnte dessen Lokalisation an morphologisch differenzierten Zellen verfolgt werden. Eine Markierung der Zellen mit NBD-markierten Phospholipidanaloga lieferte zudem Informationen zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran. Die Differenzierung der Zellen erfolgte entweder am Durchflusszytometer oder fluoreszenz- bzw. elektronenmikroskopisch. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen sowohl auf eine transversale als auch laterale Ungleichverteilung der Lipide in der Zell- und Akrosommembran während der Genese der Spermien hin. Neben der stabilen transversalen Phospholipidasymmetrie der Plasmamembran konnte erstmals eine zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden. Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran Phosphatidylserin. Kapazitationsbedingt kommt es zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran. Die Ausbildung lateraler Membrandomänen, in denen Phosphatidylserin zytoplasmatisch akkumuliert, wird als Voraussetzung für diese enge Assoziation diskutiert. Weitere Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung lateraler Membrandomänen lieferten die Arbeiten zur Isolation Triton-unlöslicher Lipiddomänen aus der Plasmamembran von Forellenspermien. / One of the essential qualities of cell membranes in Eucaryotae is a stable transverse phospholipid asymmetry. It is regulated and maintained by ATP-dependent action of an aminophospholipid translocase and is a major prerequisite for cell homeostasis. The plasma membranes of several mammalian cells show moreover lateral lipid domains, which are imputed to play a significant role in signal transduction. The membranes of mammalian spermatozoa undergo significant changes during genesis. The localisation and dynamics of phosphatidylserine in the cell as well as acrosome membranes of boar sperm cells was studied during capacitation and acrosome reaction to assess the relevance of lipid asymmetry for sperm function. The localisation of endogenous phosphatidylserine in morphologically differentiated cells was followed using the selective calcium depending binding of annexinV. Information on the transverse dynamics of phospholipids in the plasma membrane was obtained by labelling the cells with a NBD-phospholipid analogues. The morphological status of the cells was assessed by flow cytometry, fluorescence and electron microscopy. The results of this study indicate both a transversal and lateral inhomogenous distribution of lipids in the cell membrane as well as in the outer acrosome membrane during sperm genesis. The plasma membrane of boar sperm shows a stable transversal lipid asymmetry characterised by an accumulation of phosphatidylserine in the cytoplasmic monolayer. Moreover a cytoplasmic localisation of phosphatidylserine on the outer acrosome membrane could be detected for the first time. Therefore the two facing cytoplasmic leaflets of the outer acrosome and cell membrane contain phosphatidylserine. Applying microscopy substantiated the hypothesis that there are close interactions between the cell membrane and the outer layer of the acrosome membrane because of capacitation. The cytoplasmic accumulation of phosphatidylserine in lateral lipid domains is probably essential for the strong association of plasma and outer acrosome membrane finally leading to local fusions of both membranes. An indication for the functional meaning of lateral membrane domains in sperm cells was futher deduced from the isolation of Triton-insoluble lipid domains from membranes of trout sperm cells.

In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Ansatz vorgestellt, um Lipiddomänen, die Bindungsorte peripherer und integraler Membranproteine darstellen können, zu charakterisieren. Insbesondere wurde die Analyse der Fluoreszenzlebenszeiten von NBD-markierten Lipidanaloga benutzt, um Lipiddomänen in Giant unilamellar vesicles (GUV) und darauf aufbauend, in der Plasmamembran von Säugerzellen zu untersuchen. Das typische Zeitfenster von Fluoreszenzlebenszeiten im Bereich von Nanosekunden ermöglicht es, auch sehr kurzlebige Lipiddomänen nachzuweisen. Mit Hilfe des Fluorescence lifetime imaging (FLIM) wurden für die liquid disordered (ld) und liquid ordered (lo) Domänen in GUV jeweils spezifische Werte für das Abklingen der Fluoreszenz gemessen. Sogar die Existenz von submikroskopischen Domänen in GUV konnte nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzlebenszeit des Lipidanalogs C6-NBD-PC zeigte in der Plasmamembran von Säugerzellen eine breite Verteilung. Dies legt in Übereinstimmung mit FLIM-Experimenten an aus der Plasmamembran von HeLa-Zellen gewonnenen Giant vesicles nahe, dass in der Plasmamembran von Zellen eine Vielzahl verschiedener submikroskopischer Lipiddomänen existiert. Darauf aufbauend wurde die Fluoreszenzmikroskopie an GUV angewendet, um die Bindung von fluoreszenzmarkiertem alpha-Synuclein an mittels FLIM charakterisierte Lipiddomänen zu untersuchen. Die Experimente zeigten, dass das Protein mit hoher Affinität an negativ geladene Phospholipide unter der Vorraussetzung bindet, dass diese sich in ld Domänen befinden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung wenn diese Lipide in lo Domänen lokalisiert sind. Im Vergleich zum wildtypischen alpha-Synuclein zeigte die Variante A30P eine geringere Affinität zur Membran, während die E46K-Variante eine stärkere Bindung zeigte. Dies deutet darauf hin, dass bei den erblichen Formen des Morbus Parkinson eine veränderte Assoziation des alpha-Synucleins mit der Membran eine Rolle spielen kann. / In the present study a novel approach to characterize lipid domains, which may provide binding sites for peripheral or integral membrane proteins, is demonstrated. In particular, analysis of fluorescence lifetimes of NBD-labeled lipid analogues was used to study lipid domains in Giant unilamellar vesicles (GUV) and – based on the GUV results – in the plasma membrane of mammalian cells. As fluorescence decays in a few nanoseconds it is possible to to detect also very short-lived lipid domains. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) revealed that the fluorescence decay of NBD-lipid analogues showed domain dependent decay times in the liquid disordered (ld) and the liquid ordered (lo) phase of GUV. Even the existence of submicroscopic domains in lipid membranes could be detected by FLIM. A broad distribution of the fluorescence lifetime was found for C6-NBD-PC inserted in the plasma membrane of mammalian cells. In agreement with FLIM studies on lipid domain forming Giant vesicles derived from the plasma membrane of HeLa-cells this may suggest that a variety of submicroscopic lipid domains exists in the plasma membrane of intact mammalian cells. Based on that, fluorescence microscopy was used on GUV to study the binding of fluorescently labeled alpha-synuclein at lipid domains previously characterized by FLIM. The experiments suggested that alpha-synuclein binds with high affinity to negatively charged phospholipids, when they are embedded in a ld as opposed to a lo environment. When compared with wildtype alpha-synuclein, the disease-causing alpha-synuclein variant A30P bound less efficiently to anionic phospholipids, while the variant E46K showed enhanced binding. This suggests that an altered association of alpha-synuclein with membranes may play a role in the inherited forms of Parkinson’s disease.

Die Lungen werden von einem oberflächenaktiven Gemisch, dem Surfactant ausgekleidet, das für die Regulation der Oberflächenspannung der Alveolen und die Immunabwehr der Lunge von Bedeutung ist. Bestandteile des Surfactants sind zu 90% Lipide und zu 10% vier durchalphabetisierte Surfactantproteine A bis D, von denen SP-A das mengenmäßig häufigste darstellt. Die Funktionen dieses Proteins liegen vermutlich in der Surfactanthomöostase und dabei im Phospholipid-Turnover der Hauptkomponente des Surfactants Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und als Collektin in der Immunabwehr. In vitro ist die SP-A induzierte, calciumabhängige Liposomenaggregation eine charakteristische Eigenschaft des Proteins. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wechselwirkung von SP-A mit Phospholipidliposomen mit der Resonant Mirror Spektroskopie und der Nah-Infrarot-Lichtstreuung untersucht. Durch den vergleichenden Einsatz der kinetischen Methoden ist es möglich, die Bindung von SP-A an Liposomen von der Aggregationsreaktion zu unterscheiden. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß beide Reaktionen von mikromolaren Calciumkonzentrationen abhängig sind, die halbmaximale Reaktion erfolgt bei freien Calciumkonzentrationen < 20 µM. Die Ca2+-induzierte Interaktion zwischen SP-A und Liposomen zeigt eine hohe Kooperativität und ist durch Zugabe von Calciumchelatoren reversibel. Die Dissoziation der Liposomenbindung erfolgt schneller als der Zerfall der Aggregate (0,3 s vs. 30 s). Es sind zwei Konformationen des SP-A zu unterscheiden, eine lipidbindende Form in Gegenwart von Calcium und eine nichtbindende Form. Neben Calcium können auch mikromolare Strontium- und Bariumkonzentrationen die Konformationsänderung induzieren, Magnesium hingegen nicht. Die Liposomenbindung und nachfolgende Aggregation erfolgt bei SP-A von Rind, Ratte und Schaf in gleicher Weise in Abhängigkeit von mikromolaren Calciumkonzentrationen. Die Bindungseigenschaften des SP-A zeigen eine Abhängigkeit von der Art des verwendeten Phospholipids. Dabei zeigt sich eine "Affinität", im Sinne einer verstärkten Wechselwirkung mit DPPC, aber die postulierte Spezifität wurde in der kinetischen Analyse nicht bestätigt. SP-A interagiert bevorzugt mit Phospholipiden, die langkettige, gesättigte Fettsäureseitenketten besitzen (DPPC, Distearoylphosphatidylcholin), sowie mit Phosphatidylcholin und ähnlichen Kopfgruppen (Sphingomyelin, Phosphatidylinositol). Da neben den Kopfgruppen auch die Seitenketten bei der Erkennung durch das Protein bedeutsam sind, liegt nahe, daß die Packungsdichte der Lipidmoleküle in den Liposomen für die Interaktion wichtig ist. Die Ergebnisse werden als reversible, sequentielle Reaktionsfolge interpretiert: Diese ist ein Modell für die mögliche Wirkung von SP-A bei der Surfactanthomöostase, indem das Protein als Lipidtransporter zwischen alveolärer Hypophase und Typ-II-Pneumozyten funktioniert und erklärt, wie SP-A und Liposomen gemeinsam in die Zelle aufgenommen und auf unterschiedlichen Wegen wieder ausgeschleust werden könnten. / Surfactant protein A (SP-A) is crucial for lung function, including tubular myelin formation and lipid uptake by type II pneumocytes. Known properties of SP-A in vitro are ist Ca2+ dependent interaction with phospholipids and ist role in the aggregation of liposomes. To dissect and to analyze these processes, the SP-A was immobilized and liposome binding was measured by resonant mirror technique. Liposome aggregation was followed seperately by kinetic light scattering in suspensions. It was found that SP-A mediated binding and aggregation of liposomes depend on micromolar calcium concentrations in the range of < 20 µM, independent of the species (sheep, rat or cow) and of the phospholipid composition tested. The interaction between SP-A and liposomes shows cooperativity and reversibility. Liposomes dissociate from SP-A in < 0.3 s whereas disaggregation takes approx. 30 s. The interpretation of the results leads to a rapid and reversible reaction of three reactions: a cooperative Ca2+ dependent conformational change in SP-A, binding of Ca2+-bound SP-A to liposomes, and aggregation of the Ca2+/SP-A - bound liposomes. With palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), the complex formation proceeds two fold slower compared to DPPC, leading to a lower final equilibrium level of SP-A/lipid interaction. Regarding the phospholipid headgroups, phosphatidylinositol (PI) and sphingomyelin (SM) interact comparable to PC, whole less interaction is seen with phosphatidylethanolamine (PE) or phosphatidylserine (PS) or with phosphatidylglycerol (PG). Thus, both headgroup and fatty acid composition determine SP-A/phospholipid interaction. However, the protein has no high specificity, neither for the polar nor for the apolar moiety of phospholipids.

Das Peptid Amyloid-beta wird seit vielen Jahren mit der Alzheimer''schen Demenz in Verbindung gebracht, aber die Verbindung zwischen dem Peptid und der Herkunft der Symptome bleibt unklar. Eine neue Hypothese besagt, dass Wechselwirkungen von Mono- oder Oligomeren des Amyloid-beta mit neuronalen Zellmembranen zu Veränderungen der Membran-Doppelschichtsruktur führen und Störungen dynamischer Prozesse in den Membranen verursachen können. Mit Methoden der Röntgen- und Neutronenstreuung wurden die Struktur und Dynamik von Modellmembranen und Änderungen durch den Einfluss des Peptids Amyloid-beta auf die Modellmembranen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Monomere des Peptidfragments Amyloid-beta 22-40 in anionische Lipidmembranen eingebaut werden. Mittels quasielastischer-inkohärenter Neutronenstreuung wurde die Dynamik von Lipidmembran untersucht. Ein Anteil von 1,5 mol % Amyloid-beta 22-40 in einer Lipidmembran bei 30°C verursacht eine Verringerung der Diffusionskoeffizienten sowohl der Schwerpunktbewegung der Lipide im ns-Bereich als auch der Dynamik der Fettsäurereste im ps-Bereich. Andererseits wird in der Gelphase der Lipidmembran bei 15°C ein Anstieg der Diffusionskoeffizienten beider Prozesse beobachtet. Eine Serie von Lipidproben mit unterschiedlichem Cholesteringehalt und eingelagerten Peptiden Amyloid-beta 1-42 und Amyloid-beta 22-40 wurde Mittels Röntgendiffraktion charakterisiert. Für das Peptid Amyloid-beta 22-40 wurden zwei Positionen gefunden, eine auf der Oberfläche der Membran, eine zweite in der Membran eingelagert. Das Peptid Amyloid-beta 1-42 ist teilweise in die Membran eingelagert und ist in einer 40 mol % Cholesteringehaltige Membrane durch eine einzelne Position modelliert. Zusätzlich wird der Entwurf und die Inbetriebnahme der BerILL Feuchtekammer beschrieben. / The peptide amyloid-beta has long been associated with Alzheimer’s disease; however the link between the peptide and the origin of symptoms is poorly understood. An emerging hypothesis is that monomeric and oligomeric forms of the peptide interact with neuronal membranes, resulting in perturbations in the bilayer structure and in the dynamic processes which take place in the bilayer. Using X-ray and neutron scattering techniques, the structure and dynamics of model lipid membranes and the changes which arise in the presence of amyloid-beta peptide fragments have been studied. Monomers of the peptide fragment amyloid-beta 22-40 were found to intercalate into an anionic lipid bilayer. Through quasi-elastic neutron scattering, dynamics of bilayer lipids were observed. The presence of 1.5 mol % of the peptide results in a decrease in the diffusion coefficients for lipid centre of mass motion on the nanosecond time-scale, as well as for the lipid tail dynamics on the picosecond scale at 30°C. On the other hand, in the gel-phase of the lipid, at 15°C, an increase in the diffusion coefficients for both of these processes was observed. A series of samples with various cholesterol content and either the amyloid-beta 22-40 peptide fragment or the amyloid-beta 1-42 full length peptide was characterized using X-ray diffraction. The amyloid-beta 22-40 peptide was found to populate two positions, on the surface and embedded in the bilayer. The amyloid-beta 1-42 peptide embeds itself into the membrane, and is modelled by a single population for high cholesterol levels (40 mol % cholesterol). In addition, the design and commissioning of the BerILL humidity chamber, a sample environment with precise temperature and humidity control compatible with neutron scattering experiments is presented.

In Bakterien werden Phospholipide auf der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran synthetisiert. Damit ein gleichmäßiges Wachstum und somit die Stabilität biogener Membranen, d.h. Membranen, an bzw. in denen Lipidsynthese stattfindet, gewährleistet ist, muss zumindestens die Hälfte neu synthetisierter Lipide auf die entgegengesetzte Membranhälfte gelangen. Aus früheren Untersuchungen ist bereits bekannt, dass dieser transversale Phospholipidaustausch, auch als Flip-Flop bezeichnet, sehr schnell, kopfgruppenunabhängig und möglicherweise proteinabhängig ist. Dennoch sind die genauen Mechanismen dieser Prozesse noch weitgehend unverstanden. Um die oben erwähnten grundlegenden Phospholipidtransportprozesse zwischen beiden Membranhälften genauer untersuchen zu können, wandten wir einen neuartigen, sogenannten stopped-flow BSA back-extraction Assay an. Mit Hilfe dieses Assays, waren wir in der Lage, die transversale Bewegung und die Verteilung von kurzkettigen, fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga über beide Membranhälften in ex vivo-Membranen zu charakterisieren. Der stopped-flow BSA back-extraction Assay basiert auf der Technik der stopped-flow-Spektroskopie und der Tatsache, dass BSA in der Lage ist, kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Lipidanaloga aus der äußeren Leaflet von (biologischen) Membranen zu extrahieren. Wir entschieden uns für invertierte Membranvesikel der Plasmamembran (IIMV) vom E.coli Wildtypstamm MG1655 als Untersuchungsobjekt, einerseits, weil diese Vesikel nur eine Membran besitzen und zum Anderen, weil IIMV sich sehr gut als Modell für den Flip-Flop von Phospholipiden nutzen lassen. Wir beobachteten, dass kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga der beiden am häufigsten in E.coli vorkommenden Phospholipide, Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerol (PG), sehr schnell, d.h. mit Halbwertzeiten von weniger als drei Minuten, über die Membran von IIMV verteilten. Weiterhin verhielten sich kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga von den E.coli-fremden Phospholipiden, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylserin (PS), ähnlich wie die Analoga von PE und PG. Überraschenderweise, fanden wir heraus, dass alle oben genannten Phospholipidanaloga im Gleichgewichtszustand nicht gleichmässig über beide Membranhälften verteilt waren. Inwiefern Proteine an dieser transversalen Bewegung der Phospholipidanaloga beteiligt sind, sollten Messungen des Flip-Flop von Analoga an unbehandelten und mit Proteinase K inkubierten Vesikeln zeigen, die aus einem Detergenzextrakt von IIMV rekonstituiert wurden. Zunächst konnten wir zeigen, dass die schnelle Bewegung der Phospholipidanaloga über die Membran von rekonstituierten, nicht mit Proteinase K behandelten Vesikeln (Proteoliposomen) erhalten blieb. Nach Inkubation mit Proteinase K wurde jedoch der Flip-Flop von PE- und PG-Analoga vollständig inhibiert. Untersuchungen an rekonstituierten Serien von Proteoliposomen mit ansteigendem bakteriellen Proteingehalt zeigten, dass in Proteoliposomen ohne bakterielle Proteine kein Flip-Flop stattfand und somit nur 50% der fluoreszenten Analoga extrahiert wurden. In Proteoliposomen, die bakterielle Proteine enthielten, stieg das Ausmass der Extrahierbarkeit der untersuchten Analoga mit steigendem Proteingehalt. Diese Daten zeigten sehr deutlich, dass die transversale Bewegung von Phospholipiden über die innere Membran von E.coli durch Proteine vermittelt wird. Schlussfolgernd aus unseren Analysen konnten wir zeigen, dass die transversale Bewegung von Phospholipidanaloga über die Membran von IIMV sehr schnell, proteinabhängig, bidirektional und kopfgruppenunbhängig ist. Zur Identifizierung der molekularen Grundlagen der proteinvermittelten, schnellen Transversalbewegung von Phospholipiden über IIMV-Membranen, nutzen wir Ionenaustauschchromatografie. Zur unserer Überraschung mussten wir feststellen, dass in keiner der rekonstituierten Fraktionen eine nennenswerte Anreicherung der Flippaseaktivität auftrat. Möglicherweise sind mehrere Proteine, mit unterschiedlichen Nettoladungen, oder aber auch Untereinheiten, die sich nicht durch Anionenaustauscher trennen liessen, am Flip-Flop von Phospholipiden beteiligt. Weitergehende Analysen mit anderen Proteinfraktionierungsmethoden sind notwendig, um den oder die Flippasekomplex(e) zu identifizieren. / In the plasma membrane of bacteria, phospholipids are synthesized on the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane. To ensure balanced growth and thus, stability of biogenic membranes, half of the newly synthesized lipids must move to the opposing leaflet. It is known that this phospholipid transmembrane movement (flip-flop) is rapid, head-group independent and possibly protein mediated. However, the exact mechanism of this process remains elusive. To investigate these fundamental transbilayer phospholipid transport processes in biogenic membranes, a novel stopped-flow BSA back-exchange assay was utilized to characterize the transmembrane movement and transbilayer distribution of fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues in ex vivo membranes. This approach is based on stopped-flow fluorescence spectroscopy, and the fact that BSA is able to extract fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues from the outer leaflet of (bio)membranes. We chose isolated inverted inner membrane vesicles (IIMV) derived from E.coli wild type MG1655, both for their simple membrane organization and for their suitability as a simple model organism for phospholipid flip-flop. We observed that fluorescent-labeled, short-chain analogues of the major phospholipids in E.coli, phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), rapidly redistributed across the IIMV bilayer with half-times of less than three minutes. Furthermore, fluorescent, short-chain phospholipid analogues of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS), which are not naturally occurring phospholipids in E.coli membranes, behaved similar to the PE and PG analogues. To analyze the relevance of proteins for the transmembrane movement of fluorescent analogues, we measured flip-flop of phospholipid analogues in reconstituted and/or untreated and proteinase K treated vesicles generated from protein detergent extracts of IIMV. The amount of extractable fluorescent phospholipids analogues correlated with the amount of protein reconstituted into the proteoliposomes, strongly indicating, that protein concentrations below 100 µg/ml were not sufficient to equip every vesicle with proteins that facilitate the transmembrane movement of the fluorescent analogues. We found that the rapid transbilayer movement of phospholipid analogues across the membrane was maintained in untreated reconstituted vesicles. However, the flip-flop of fluorescent PG and PE analogues was eliminated in proteinase K treated vesicles. In conclusion, our analysis showed that the transmembrane movement of the phospholipid analogues across the membrane of IIMV was protein-mediated, very rapid, bi-directional and head-group independent. To identify the molecular basis of the protein-mediated, rapid transmembrane movement of phospholipids across IIMV membranes, we used ion exchange chromatography (IEC) to separate the IIMV proteins. To our surprise, we did not observe an enhanced flip-flop activity in any of the fractions, indicating that at least two proteins with possibly opposite net charges or several subunits, which were not separable by AEC, are involved. Further analysis using different protein separation techniques will be necessary to identify the putative flippase complex.

Scs2p ist ein integrales Membranprotein des Endoplasmatischen Retikulums (ER), dessen Deletion zu einer geringeren Expression der Inositol-1-P Synthase INO1 in Inositol-freiem Medium führt und dessen Überexpression die Inositol-Auxotrophie eines Stammes mit einer defekten "unfolded protein response" supprimiert. scs2 Mutanten weisen zudem eine erhöhte Sensitivität gegen Tunicamycin auf, eine Substanz, welche die N-Glykosylierung von Proteinen im ER inhibiert. Für die mutmaßlichen Orthologen von Scs2p in höheren Eukaryoten wurde eine Funktion dieser Proteine im vesikulären Transport postuliert. In dieser Arbeit wurde Scs2p als mit Cue1p, einer Komponente der ER-assoziierten Proteindegradation, quervernetzbares Protein identifiziert, und daraufhin begonnen, die Funktion von Scs2p näher zu charakterisieren. Eine Deletion von SCS2 hatte keinen Einfluß auf die bekannten Cue1p-abhängigen Degradationswege. Auch die Induktion der "unfolded protein response" (UPR) infolge einer Akkumulation von falsch gefalteten Proteinen wurde durch eine Deletion von SCS2 nicht beeinträchtigt. Eine Beeinträchtigung des Transportes durch den sekretorischen Weg konnte in scs2 Hefen ebenfalls nicht nachgewiesen werden. scs2 Mutanten zeigten eine generell verminderte Expression von Genen der Glycerolipid Biosynthese, deren Transkription über Ino2p/Ino4p reguliert wird. Dabei beeinträchtigte eine Deletion von SCS2 nicht die Induktion der UPR in Inositol-armem Medium und die darüber vermittelte Induktion der INO1 Expression. Ein analoger Phänotyp wurde auch in Mutanten beobachtet, in denen die Gene von Ubc7p, einer Komponente der ER-Degradation oder Lcb3p, einer Sphingosin-P Phosphatase, deletiert waren. Dabei bestand in bezug auf die Ino2p/Ino4p-abhängige Expressionsregulation keine epistatische Beziehung zwischen den drei Gendeletionen. Untersuchungen des Einflusses verschiedener Mutanten und Inhibitoren des Sphingolipid Stoffwechsels zeigten, daß Änderungen der Synthese von komplexen Sphingolipiden die Regulation der Inositol Synthese nur indirekt beeinflußten und gaben Hinweise auf eine Regulation des Glycerolipid Stoffwechsels durch Sphingosin. scs2 Mutanten erwiesen sich als sensitiv gegen Inhibitoren der Sphingolipid Biosynthese. Untersuchungen von Stämmen, in denen verschiedene Gene der Sphingolipid Synthese deletiert wurden, sowie Analysen der Lipidzusammensetzung zeigten, daß in scs2 Zellen eine Regulation beeinträchtigt ist, welche die IPC Synthase Aktivität bei einem verringerten Sphingolipid Gehalt der Zelle erhöht. Die geringere Expression von Genen der Glycerolipid Synthese und die niedrigere Kapazität zur Synthese von komplexen Sphingolipiden erwiesen sich als voneinander unabhängige Auswirkungen eines komplexen Phänotyps von scs2 Deletionsmutanten, wobei die primäre Funktion von Scs2p vermutlich nicht im Lipidstoffwechsel liegt. / Scs2p is an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum (ER), whose deletion leads to a reduced expression of INO1 encoding inositol-1-phosphate synthase and whose over-expression suppresses the inositol auxotrophy of a strain with a defect unfolded protein response (UPR). scs2 mutants display an enhanced sensitivity to Tunicamycin, an inhibitor of protein N-glycosylation in the ER. It has been proposed that the putative orthologs of Scs2p in higher eukaryotes function in vesicular transport. In this work Scs2p, which was identified as a protein that can be crosslinked to Cue1p, a protein involved in ER-associated protein degradation, was further characterised. A deletion of SCS2 did not affect the known Cue1p-dependend degradation pathways. Cells lacking Scs2p normally induced the UPR upon an accumulation of misfolded proteins. An impairment of protein transport through the secretory pathway could also not be detected in scs2 cells. scs2 mutants displayed a generally reduced expression of genes involved in glycerolipid synthesis, whose transcription is regulated by Ino2p/Ino4p. The induction of the UPR in inositol-free medium and the subsequent upregulation of INO1 expression were not impaired in these cells. A similar effect was observed in strains lacking Ubc7p, a component of the ER -associated protein degradation system and in cells lacking the sphingoid base-1-phosphate phosphatase Lcb3p. Regarding the Ino2p/Ino4p-dependend gene expression no epistatic relationship was observed between Scs2p, Ubc7p and Lcb3p. An examination of the influence of various mutants and inhibitors of the sphingolipid pathway indicated that alterations of the synthesis of complex sphingolipids have only an indirect influence on the regulation of inositol synthesis and pointed towards a control of glycerolipid synthesis by sphingoid bases. scs2 cells were found to be sensitive to inhibitors of sphingolipid biosynthesis. The examination of strains lacking various enzymes involved in sphingolipid synthesis and direct analysis of lipid composition showed that a deletion of SCS2 impairs an upregulation of IPC synthase activity under conditions where the sphingolipid content of the cell is diminished. The reduced expression of genes involved in glycerolipid synthesis and the lower capacity for the synthesis of complex sphingolipids turned out to be mutually independent consequences of the complex phenotype of cells lacking Scs2p, whose primary function may not be in the lipid metabolism.

Cytochrom P450 (CYP) Enzyme tragen zur Bioaktivierung von langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei. Die gebildeten Monoepoxy- und Monohydroxy-Metaboliten werden zusammenfassend als CYP-Eicosanoide bezeichnet und fungieren als Mediatoren bei der Regulation des Gefäßtonus, der Herz- und Nierenfunktion, sowie einer Vielzahl weiterer physiologischer Prozesse, wobei die biologische Aktivität oftmals abhängig von der Positions- und Stereoisomerie der Eicosanoide ist. Prominente Vertreter der CYP-Eicosanoid-Familie sind die aus der Arachidonsäure gebildeten Epoxyeicosatriensäuren (EETs) und 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE). EETs und 20-HETE haben zum Teil gegensätzliche biologische Aktivitäten, die zur Aktivierung bzw. Inhibition antiinflammatorischer und weiterer Zell- und Organ-protektiver Signalwege beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Analyse endogener Metabolitenprofile zum besseren Verständnis der Rolle von CYP-Eicosanoiden bei der Entstehung von Ischämie/Reperfusions (I/R)-bedingten Organschäden beizutragen. Als Hauptergebnisse ergaben sich (i) die Entdeckung und Charakterisierung einer protektiven Rolle von EETs in Tiermodellen der Initiationsphase des akuten Nierenversagens, sowie des therapeutischen Potentials stabiler EET-Analoga; (ii) die Identifizierung von 8,9-EET und 20-HETE als mögliche prädiktive Biomarker für das post-operative Auftreten von akutem Nierenversagen nach offener Herzoperation; und (iii) die Entwicklung und Validierung eines analytischen Verfahrens der chiralen Lipidomik (chiral-LC-ESI-MS/MS), das eine Analyse endogener Enantiomere sowohl von Monoepoxy- als auch Monohydroxy-Eicosanoiden in komplexen biologischen Proben erstmalig ermöglichte und dafür genutzt werden konnte, die stereospezifische Regulation der EETs durch Epoxid-Hydrolasen in vitro wie auch in vivo zu beschreiben. / Cytochrome P450 (CYP) enzymes contribute to the bioactivation of long-chain polyunsaturated fatty acids. The monoepoxy- and monohydroxy-metabolites generated by CYP enzymes are collectively termed CYP-eicosanoids. CYP-eicosanoids act as mediators in the regulation of vascular tone, heart- and kidney function and several further physiological processes, mostly in a regio- and stereospecific manner. Arachidonic acid-derived epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) are prominent members of the CYP-eicosanoid family. EETs and 20-HETE show partially opposing biological activities that contribute to the activation or inhibition of anti-inflammatory and other cell- and organ-protective mechanisms. The aim of the present work was to study the role of CYP-eicosanoids in ischemia/reperfusion (I/R) related organ damage by analyses of endogenous metabolite profiles. The main results were (i) discovery and characterization of the EETs protective role in animal models of the initiation phase of acute kidney injury (AKI) and the therapeutic potential of stable EET-analogs, (ii) identification of 8,9-EET and 20-HETE as potential predictive biomarkers for AKI in patients who underwent open heart surgery, (iii) the development and validation of a novel analytical method for chiral lipidomics (chiral LC-ESI-MS/MS) that allows to study endogenous enantiomers of monohydroxy- and monoepoxy-eicosanoids in complex matrices of biological and clinical samples. Furthermore, the approach was applied to describe the stereospecific regulation of EETs by epoxide hydrolases in vitro and in vivo.

Sialinsäuren sind Teil der äußersten Komponente der Glykokalyx aller Wirbeltiere. Als solche sind sie grundlegende Marker in physiologischen und pathologischen Prozessen. Der „Hauptregulator“ der Sialinsäure-Biosynthese ist die bifunktionelle UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin-Kinase (GNE/MNK). Das Hauptziel dieser Dissertation war die Identifizierung neuer Inhibitoren der GNE-Subdomäne, die zur Hemmung der Sialinsäurebiosynthese in Zellen und zur Verringerung der Sialylierung der Zelloberfläche eingesetzt werden könnten. Zu diesem Zweck wurde GNE rekombinant exprimiert und eine Screening-Kampagne mit fast 70 000 Verbindungen gegen seine Aktivität durchgeführt. Die primären Treffer aus der Screening-Kampagne wurden anschließend in vitro und in cellulo charakterisiert. Die Inhibitoren haben nicht auf Zellen funktioniert, dafür haben sie in einem neu entwickelten NMR basierten Assay GNE Aktivität im Rattenleberzytosolextrakt inhibiert. / Sialic acids are part of the outermost component of the glycocalyx of all vertebrates. As such, they are fundamental markers in physiological and pathological processes. The "main regulator" of sialic acid biosynthesis is the bifunctional UDP-N-Acetylglucosamine-2-Epimerase/N-Acetylmannosamin Kinase (GNE/MNK). The main objective of this dissertation was the identification of new inhibitors of the GNE subdomain, which could be used to inhibit sialic acid biosynthesis in cells and reduce the sialylation of the cell surface. For this purpose, GNE was recombinantly expressed and a screening campaign against its activity was conducted with nearly 70,000 compounds. The primary hits from the screening campaign were subsequently characterized in vitro and in cellulo. The inhibitors did not work on cells, but they inhibited GNE activity in a rat liver cytosol extract in a newly developed NMR-based assay.

Mehrfach ungesättigte omega-3 Fettsäuren (n-3 PUFAs), wie Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), schützen vor kardiovaskulären Erkrankungen, wie tödlichen Arrhythmien. In vitro Untersuchungen belegen, dass rekombinante Cytochrom P450 (CYP) Enzyme nicht nur die n-6 PUFA Arachidonsäure (AA), sondern auch die n-3 PUFAs EPA und DHA als alternative Substrate verwenden. Dabei entstehen bioaktive regio- und stereoisomere Epoxy- und Hydroxymetaboliten, CYP-Eicosanoide, die als sekundäre Botenstoffe bei der Regulation von Gefäß-, Nieren- und Herzfunktionen fungieren. Die genauen molekularen Mechanismen dieser Metabolite sind noch weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der ernährungsbedingte Einfluss auf das endogene CYP-Eicosanoidprofil im Menschen untersucht. Die Ergebnisse der klinischen Studie zeigten, dass n-3 PUFAs auch in vivo alternative Substrate von CYP-Enzymen darstellen und wenn verfügbar sogar effektiver zu ihren Metaboliten umgesetzt wurden als AA. Als ein wichtiger Metabolit entsteht nach EPA/DHA-Supplementation 17,18-EEQ, welcher womöglich der eigentliche Vermittler der kardioprotektiven Effekte von n-3 PUFAs ist. Unter Verwendung eines etablierten Zellmodells mit spontan schlagenden neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRKMs) wurde der anti-arrhythmische Effekte von 17,18-EEQ genauer untersucht. Der negativ chronotrope Effekt von EPA auf NRKMs wurde tatsächlich durch 17,18-EEQ vermittelt, insbesondere dem R,S-Enantiomer. Mittels Strukturfunktionsanalyse wurden synthetische Analoga mit gleicher Wirksamkeit wie dem 7,18-EEQ gefunden, wobei strikte strukturelle Merkmale für die biologische Funktion identifiziert wurden. Die Suche nach einem molekularen Ziel für CYP-Epoxyeicosanoide führte zu einem möglichen Rezeptorkandidaten, der hinsichtlich seiner Ligandenspezifität untersucht wurde. Dieser oder zukünftige andere Rezeptorkandidaten stellen ein mögliches neues zelluläres Ziel zur Behandlung kardialer Arrhythmien dar. / The n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), protect from cardiovascular disease, especially from fetal arrhythmia. Moreover, in vitro studies proved that recombinant cytochrome P450 (CYP) enzymes not only accept the physiologically most important n-6 PUFA arachidonic acid (AA), but also EPA and DHA as alternative substrates, thereby generating regio- and stereospecific biologically active epoxy- and hydroxymetabolites, CYP-eicosanoids. These metabolites serve as second messengers regulating vascular, renal and cardiac function. The precise underlying molecular mechanisms are only partially understood and need further investigation. The first aim of the thesis was to show that the endogenous CYP-eicosanoid profile depends on the availability of the precursor fatty acids. The results of a clinical trial with 20 volunteers, show that n-3 PUFAs serve also in vivo as alternative CYP-dependent substrates and are even preferentially metabolized compared to AA. After EPA/DHA-supplementation 17,18 EEQ was generated as a major metabolite, potentially an important mediator of cardiovascular effects originally attributed to n-3 PUFAs. To test the anti-arrhythmic effect of EPA and 17,18-EEQ, an established cell model with neonatal rat cardiomyocytes (NRKMs) was used. The negative chronotropic effect of EPA was mimicked by 17,18-EEQ, attributed only to the R,S-enantiomer. A structure activity relationship study revealed synthetic analogs, exerting the same biological effect as 17,18-EEQ. Strict structural requirements were found for agonistic function, hinting at a specific interaction with cellular targets, like GPCRs. The search of a molecular target of CYP-eicosanoids led to a putative receptor, which was tested for ligand binding specificity. If the preliminary results on the ligand binding are confirmed in future experiments this receptor might be a novel target for the treatment of cardiac arrhythmia.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.