Tumour-related diseases are the second most common cause of death in the Czech Republic, right after cardiovascular diseases. Nanomedicine - a novel scientific discipline - shows captivating potential in anticancer treatment with help of so called nanotranporters - nanoparticles capable of transporting other molecules. Encapsulation of a cytostatic drug into a nanoparticle improves its pharmacokinetical and pharmacodynamical properties which helps to reduce adverse side effects on non-tumour healthy tissue. In the scope of this diploma thesis apoferritin - apo-form of ferritin - was studied, since this nanotransporter shows promise for clinical use in anticancer treatment. Effect of hepatic microsomes from premedicated and control rats on biotransformation of doxorubicin cytostatic (Dox) in free and apoferritin nanoparticle-bound forms was investigated at pH 7,4. Over the course of biotransformation two types of metabolites - M1 and M2 - were observed. Regardless of the employed inductor all studied microsomes have exhibited similar metabolism of free doxorubicin and its apoferritin encapsulated form (ApoDox). Our results also imply that doxorubicin can be metabolically processed by rat hepatic microsomes in both free and ApoDox form with similar efficiency. We have also studied biotransformation...

Cytochromes P450 form a large family of hemoproteins. Some of them are responsible for the metabolism of endogenous substrates, but their major role is in detoxification of exogenous substrates (xenobiotics), some of them are activated to reactive species forming covalent adducts with DNA and increasing intracellular oxidative stress. Cytochrome P450 are considered by very promiscuous in terms of their substrate specificity, thus one enzyme can typically oxidize many substrates. Cytochrome P450 1A1 prefers a planar aromatic compounds (e.g. polycyclic aromatic hydrocarbons, azo dyes, etc.). Cytochrome P450 1A2 elicits similar substrate specificity, but prefers slightly basic aromatic derivatives, for example caffeine. This work focuses on (i) the preparation of expression vectors containing genes encoding human cytochromes P450 1A1 and 1A2, (ii) their consequent expression in heterologous system followed by (iii) isolation of corresponding proteins. The genes coding both proteins were modified and transferred from older vectors to the more efficient to expression plasmids pET-22b. However, the new constructs did not produce stable native proteins. The modified genes were therefore transferred to the original expression plasmids pCW. The problem with the incorporation of native human form of...

Folate sind als Überträger von C1-Fragmenten verschiedener Oxidationsstufen direkt an der Nukleinsäuresynthese beteiligt und spielen somit eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel. So kann ein suboptimaler Folatstatus zur Ausprägung einer klinischen Symptomatik führen, die sich primär in Zellen mit hoher Teilungsrate manifestiert. Dabei gilt die megaloblastäre Anämie als Leitsymptom für einen akuten Folatmangel. Herausragende Bedeutung besitzen Folate in der Schwangerschaft, wo ihnen bei der Entwicklung des fetalen Nervensystems eine besondere Rolle zukommt. Bei einem zu niedrigen Serumfolatspiegel der Mutter steigt das Risiko für embryonale Missbildungen wie Neuralrohrdefekte stark an. Die weitere medizinische Relevanz der Folate steht momentan im Fokus der Forschung, wie z. B. der protektive Effekt in Bezug auf bestimmte Krebsformen, die Risikoreduktion für verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Zusammenhänge zwischen dem Folatstatus und neurologischen Störungen (Alzheimer, Depressionen). Allerdings kann Folat als essentielles Vitamin von Säugetieren nicht selbst synthetisiert werden, sondern muss aus externen Quellen über den Verdauungstrakt aufgenommen werden. Die Resorption aus dem Darm erfolgt nach aktuellem Kenntnisstand insbesondere über den Reduced Folate Carrier (RFC, SLC19A1) und den Proton-Coupled Folate Transporter (PCFT, SLC46A1). Trotz der Existenz dieser spezifischen Transporter ist der Folatmangel des Menschen der häufigste Vitaminmangel in Mitteleuropa. Er lässt sich durch eine ausschließlich ernährungsphysiologische Problematik nur unzureichend erklären. Interessanterweise besitzen sowohl das PCFT-Gen als auch das RFC-Gen in ihrer Promoterregion verschiedene Regulationselemente, unter anderem auch funktionell aktive DREs (Dioxin Response Element), die als Bindungsstelle für einen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, den nukleären Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR), dienen. DREs wurden bisher hauptsächlich bei fremdstoffmetabolisierenden Enzymen wie z. B. Cytochrom P450-Isoenzymen gefunden und vermitteln bekanntermaßen die toxischen und karzinogenen Effekte von AhR-Liganden. Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang ubiquitär verbreitete Umweltkontaminanten wie die polyzyklischen und die halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK, HAK), da sie in der Umwelt sehr persistent sind und sich dadurch in der Lebensmittelkette anreichern. Infolgedessen wurde im Rahmen dieser Studie der mögliche Einfluss von AhR-Liganden wie TCDD (2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin) und B[a]P (Benzo[a]pyren) auf die carriervermittelte intestinale Folatresorption beim Menschen untersucht sowie die Regulation der Transportproteine RFC und PCFT auf transkriptioneller Ebene experimentell überprüft. Als adäquates in vitro Modell diente dabei die humane Kolonzelllinie LS180, für die zunächst eine Charakterisierung erfolgte. Mittels RT-PCR wurde der Nachweis erbracht, dass alle am Folattransport beteiligten Import-und Exportcarrier auf mRNA-Ebene exprimiert werden. Für die Transportproteine RFC und PCFT erfolgte über den Western Blot auch der Nachweis auf Proteinebene. Die Funktionalität der AhR-Signalkaskade, die über methylcholanthrenartige Induktoren wie TCDD zur Induktion von Cytochrom P450 führt, konnte im Folgenden mittels Ethoxyresorufin-O-deethylase-Assay (EROD) überprüft werden. Es zeigte sich nach Induktion mit TCDD (0,01 - 10 nM) oder B[a]P (0,01 - 1 μM) über 12 – 96 h ein hochsignifikanter, dosis- und zeitabhängiger Effekt auf die Cyp1A1 vermittelte Enzymaktivität der Ethoxyresorufin-O-deethylase in den LS180-Zellen. Dabei konnten ligandenabhängige Unterschiede im Induktionsmuster ermittelt werden. Im Anschluss wurde im intestinalen Zellmodell die initiale konzentrations- und zeitabhängige Folataufnahme bei pH 5.5 über funktionelle Aufnahmeversuche mit Tritium-markierter Folsäure untersucht und charakterisiert. Sie stellte sich als aktiver, sättigbarer Prozess dar, wobei in den unbehandelten LS180-Zellen ca. eine Verdreifachung der intrazellulären Radioaktivität über einen Zeitraum von 2,5 min beobachtet werden konnte. Als kinetische Parameter wurden ein Km-Wert von 27,91 μM sowie ein Vmax-Wert von 281,2 pmol/min berechnet. Nachfolgende Untersuchungen mit den spezifischen Inhibitoren Raltitrexed (RTX) und Pemetrexed (PMX) konnten zeigen, dass sowohl PCFT als auch RFC an der funktionellen Folsäureaufnahme bei einem pH-Wert von 5.5 in dem gewählten Versuchsaufbau beteiligt sind. Der RFC scheint jedoch einen etwas höheren Anteil an der Gesamtaufnahme zu haben als der PCFT. In LS180-Zellen, die vorher mit den Modellsubstanzen TCDD (1 bzw. 10 nM) oder B[a]P (0,1 bzw. 1 μM) über 24 - 120 h inkubiert wurden, konnte eine zeit- und dosisabhängige, statistisch signifikante Reduktion der carriervermittelten Folatresorption beobachtet werden, wobei die maximale Verminderung der Aufnahmerate ca. 75 % betrug. Da sich dieser Effekt durch die AhR-Antagonisten Salicylamid (SAL) und CH-223191 (CH) dosisabhängig umkehren ließ, erfolgt die Regulation vermutlich über den AhR-Signalweg. Um den Mechanismus der Regulation zu klären, wurde mit Hilfe der quantitativen qRT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden die Genexpression von RFC und PCFT nach Vorbehandlung mit 1 - 10 nM TCDD oder 0,1 – 1 μM B[a]P über 12 - 120 h untersucht. Analog zu den Aufnahmeversuchen konnte hier eine zeit- und dosisabhängige Reduktion beider Transporter auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden. Auch führte eine Vorbehandlung mit CH und SAL wiederum zu einer Umkehr des Effektes, wobei CH wahrscheinlich einen ligandenselektiven AhR-Antagonisten darstellt. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit nachgewiesen werden, dass Cytochrom P450-Induktoren über die AhR-Signalkaskade die carriervermittelte Folatresorption in humanen Kolonzellen herabregulieren. Es erscheint anhand der gewonnen Erkenntnisse möglich, dass die Folathomoöstase durch verschiedene Umweltkontaminanten wie z. B. TCDD negativ beeinflusst werden kann und als Folge daraus auch eventuell der Folatmangel der Bevölkerung in Industrienationen zumindest teilweise erklärbar wird. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch andere Fremdstoffe die Folataufnahme beeinflussen, da große planare Strukturen häufig über den AhR-Weg wirken. Weiterführende Studien sind notwendig, um das Verständnis für den Einfluss von Umweltkontaminanten auf die intestinale Folataufnahme zu verbessern.

Folate sind als Überträger von C1-Fragmenten verschiedener Oxidationsstufen direkt an der Nukleinsäuresynthese beteiligt und spielen somit eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel. So kann ein suboptimaler Folatstatus zur Ausprägung einer klinischen Symptomatik führen, die sich primär in Zellen mit hoher Teilungsrate manifestiert. Dabei gilt die megaloblastäre Anämie als Leitsymptom für einen akuten Folatmangel. Herausragende Bedeutung besitzen Folate in der Schwangerschaft, wo ihnen bei der Entwicklung des fetalen Nervensystems eine besondere Rolle zukommt. Bei einem zu niedrigen Serumfolatspiegel der Mutter steigt das Risiko für embryonale Missbildungen wie Neuralrohrdefekte stark an. Die weitere medizinische Relevanz der Folate steht momentan im Fokus der Forschung, wie z. B. der protektive Effekt in Bezug auf bestimmte Krebsformen, die Risikoreduktion für verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Zusammenhänge zwischen dem Folatstatus und neurologischen Störungen (Alzheimer, Depressionen). Allerdings kann Folat als essentielles Vitamin von Säugetieren nicht selbst synthetisiert werden, sondern muss aus externen Quellen über den Verdauungstrakt aufgenommen werden. Die Resorption aus dem Darm erfolgt nach aktuellem Kenntnisstand insbesondere über den Reduced Folate Carrier (RFC, SLC19A1) und den Proton-Coupled Folate Transporter (PCFT, SLC46A1). Trotz der Existenz dieser spezifischen Transporter ist der Folatmangel des Menschen der häufigste Vitaminmangel in Mitteleuropa. Er lässt sich durch eine ausschließlich ernährungsphysiologische Problematik nur unzureichend erklären. Interessanterweise besitzen sowohl das PCFT-Gen als auch das RFC-Gen in ihrer Promoterregion verschiedene Regulationselemente, unter anderem auch funktionell aktive DREs (Dioxin Response Element), die als Bindungsstelle für einen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, den nukleären Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR), dienen. DREs wurden bisher hauptsächlich bei fremdstoffmetabolisierenden Enzymen wie z. B. Cytochrom P450-Isoenzymen gefunden und vermitteln bekanntermaßen die toxischen und karzinogenen Effekte von AhR-Liganden. Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang ubiquitär verbreitete Umweltkontaminanten wie die polyzyklischen und die halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK, HAK), da sie in der Umwelt sehr persistent sind und sich dadurch in der Lebensmittelkette anreichern. Infolgedessen wurde im Rahmen dieser Studie der mögliche Einfluss von AhR-Liganden wie TCDD (2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin) und B[a]P (Benzo[a]pyren) auf die carriervermittelte intestinale Folatresorption beim Menschen untersucht sowie die Regulation der Transportproteine RFC und PCFT auf transkriptioneller Ebene experimentell überprüft. Als adäquates in vitro Modell diente dabei die humane Kolonzelllinie LS180, für die zunächst eine Charakterisierung erfolgte. Mittels RT-PCR wurde der Nachweis erbracht, dass alle am Folattransport beteiligten Import-und Exportcarrier auf mRNA-Ebene exprimiert werden. Für die Transportproteine RFC und PCFT erfolgte über den Western Blot auch der Nachweis auf Proteinebene. Die Funktionalität der AhR-Signalkaskade, die über methylcholanthrenartige Induktoren wie TCDD zur Induktion von Cytochrom P450 führt, konnte im Folgenden mittels Ethoxyresorufin-O-deethylase-Assay (EROD) überprüft werden. Es zeigte sich nach Induktion mit TCDD (0,01 - 10 nM) oder B[a]P (0,01 - 1 μM) über 12 – 96 h ein hochsignifikanter, dosis- und zeitabhängiger Effekt auf die Cyp1A1 vermittelte Enzymaktivität der Ethoxyresorufin-O-deethylase in den LS180-Zellen. Dabei konnten ligandenabhängige Unterschiede im Induktionsmuster ermittelt werden. Im Anschluss wurde im intestinalen Zellmodell die initiale konzentrations- und zeitabhängige Folataufnahme bei pH 5.5 über funktionelle Aufnahmeversuche mit Tritium-markierter Folsäure untersucht und charakterisiert. Sie stellte sich als aktiver, sättigbarer Prozess dar, wobei in den unbehandelten LS180-Zellen ca. eine Verdreifachung der intrazellulären Radioaktivität über einen Zeitraum von 2,5 min beobachtet werden konnte. Als kinetische Parameter wurden ein Km-Wert von 27,91 μM sowie ein Vmax-Wert von 281,2 pmol/min berechnet. Nachfolgende Untersuchungen mit den spezifischen Inhibitoren Raltitrexed (RTX) und Pemetrexed (PMX) konnten zeigen, dass sowohl PCFT als auch RFC an der funktionellen Folsäureaufnahme bei einem pH-Wert von 5.5 in dem gewählten Versuchsaufbau beteiligt sind. Der RFC scheint jedoch einen etwas höheren Anteil an der Gesamtaufnahme zu haben als der PCFT. In LS180-Zellen, die vorher mit den Modellsubstanzen TCDD (1 bzw. 10 nM) oder B[a]P (0,1 bzw. 1 μM) über 24 - 120 h inkubiert wurden, konnte eine zeit- und dosisabhängige, statistisch signifikante Reduktion der carriervermittelten Folatresorption beobachtet werden, wobei die maximale Verminderung der Aufnahmerate ca. 75 % betrug. Da sich dieser Effekt durch die AhR-Antagonisten Salicylamid (SAL) und CH-223191 (CH) dosisabhängig umkehren ließ, erfolgt die Regulation vermutlich über den AhR-Signalweg. Um den Mechanismus der Regulation zu klären, wurde mit Hilfe der quantitativen qRT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden die Genexpression von RFC und PCFT nach Vorbehandlung mit 1 - 10 nM TCDD oder 0,1 – 1 μM B[a]P über 12 - 120 h untersucht. Analog zu den Aufnahmeversuchen konnte hier eine zeit- und dosisabhängige Reduktion beider Transporter auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden. Auch führte eine Vorbehandlung mit CH und SAL wiederum zu einer Umkehr des Effektes, wobei CH wahrscheinlich einen ligandenselektiven AhR-Antagonisten darstellt. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit nachgewiesen werden, dass Cytochrom P450-Induktoren über die AhR-Signalkaskade die carriervermittelte Folatresorption in humanen Kolonzellen herabregulieren. Es erscheint anhand der gewonnen Erkenntnisse möglich, dass die Folathomoöstase durch verschiedene Umweltkontaminanten wie z. B. TCDD negativ beeinflusst werden kann und als Folge daraus auch eventuell der Folatmangel der Bevölkerung in Industrienationen zumindest teilweise erklärbar wird. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch andere Fremdstoffe die Folataufnahme beeinflussen, da große planare Strukturen häufig über den AhR-Weg wirken. Weiterführende Studien sind notwendig, um das Verständnis für den Einfluss von Umweltkontaminanten auf die intestinale Folataufnahme zu verbessern.

Histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) increases cytotoxicity of antineoplastic agent ellipticine to human neuroblastoma cells. Its mechanism of action has not yet been explained. One of the possible mode of action is conformational change in chromatin, which leads to changes in DNA that is more accessible to covalent modification and intercalation. The aim of this work is to study another mode of action, which can explain this phenomenon. The question is, if TSA can increase cytotoxicity of ellipticine to human neuroblastoma cells by modulation of activities and expression of cytochromes P450 and peroxidases. These enzymes are responsible for cytotoxicity of ellipticine to human neuroblastoma cells. TSA has no effect on oxidation of ellipticine mediated by cytochromes P450 leading to metabolites responsible for formation of ellipticine-DNA adducts and detoxication metabolites. TSA increases formation of ellipticine dimer, which is a detoxication metabolite, forming during its oxidation by peroxidases. TSA has no effect on activities of CYP1A1, CYP1A2, CYP3A, which significantly participate in oxidation of ellipticine. TSA modulates expression of enzymes oxidizing ellipticin in human neuroblastoma cells. TSA in the presence of ellipticine increases expression of CYP1A1 a CYP3A4 in...

Ellipticine is a potent antineoplastic agent, whose mode of action is considered to be based mainly on DNA intercalation and inhibition of topoisomerase II. Ellipticine was also found to form covalent DNA adducts mediated by its enzymatic activation with cytochromes P450 (CYP) and peroxidases. The next study demonstrated increasing formation of these ellipticine-DNA adducts by histone deacetylase inhibitor valproate (VPA) in neuroblastoma cells. This phenomenon correlates with increasing cytotoxicity of ellipticine induced by this histone deacetylase inhibitor. This observation can be explained by several mechanisms. One of them can be loosening the structure of chromatine, which leads to accessing DNA for modification. Another one is the effect of VPA on activities and expression of enzymes metabolizing ellipticine. This study was aimed to test the second hypothesis. Since VPA has been shown to be metabolized by similar enzymes as ellipticine is, we have studied the effect of VPA (i) on oxidation of ellipticine by cytochromes P450 and peroxidases, (ii) on activities of the CYP enzymes, which significantly participate in oxidation of ellipticine (CYP1A, CYP3A) and (iii) on expression of enzymes oxidizing ellipticine (CYP1A1, CYP3A4, lactoperoxidase). Oxidation of ellipticine in vitro by model...

Cytochromes P450 are heme enzymes with very broad substrate specificity, they can oxidize tens to hundreds of different substrates including both eobiotics and xenobiotics, but with varying efficiencies and kinetics. They are responsible for the metabolic activation of many carcinogens resulting in formation of reactive intermediates, these reactive species participate in the formation of DNA adducts and also increase of oxidative stress. Eukaryotic cytochromes P450 are membrane bound enzymes found mostly in the endoplasmic reticulum. In vertebrates, they are expressed in a variety of tissues mostly in the liver, but also in kidney, lung, skin and others. The cytochrome P450 1B1 is an inducible enzyme which occurs mainly in the lung and skin. Its expression is induced predominantly by the presence of polycyclic aromatic hydrocarbons, dioxins and heterocyclic amines. The human cytochromes P450 are typically obtained using heterologous expression and isolated as a C-terminally modified hexa-histaq constructs using immobilized metal affinity chromatography. This thesis focuses on effect of C-terminal modifications on activity of human cytochrome P450 1B1. First, the two expression vectors encoding the human form of cytochrome P450 1B1 were prepared, one contained a classical C-terminal hexa-histaq...

Flavonoids are natural compounds commonly ingested in herbs and vegetables. They are believed to have a positive impact on human organism, in particular by their antioxidant, hepatoprotective and anti-cancer effects. In these days, it is possible to consume high concentrations of these compounds in form of dietary supplements. However it is not clear, whether flavonoids in such unnaturally high concentrations are still beneficial or rather harmful. It has already been proven, that flavonoids can influence the activity of biotransformation enzymes and interfere e.g. with the process of carcinogenesis and drug metabolism. For that reason it is important to investigate the impact of an increased intake of flavonoids. The aim of this thesis was to investigate the influence of dihydromyricetin (a potential drug to cure alcohol use disorder) and its structurally similar flavonoid myricetin on the activity of enzymes, cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) and N­acetyltransferases 1 and 2 (NAT1/2). The research included the determination of the impact of a premedication by these flavonoids on the expression and activity of CYP2E1 and NAT1/2. The inhibition capacity of myricetin and dihydromyricetin towards the activity of CYP2E1 and NAT1/2 was also investigated. After the flavonoid premedication of rats the...

Cytochrome P450 3A4 is integral membrane protein residing in endoplasmic reticular membrane. In human the highest concentration cytochrome P450 3A4 is expressed in liver, where it plays a major role in metabolism of many drugs and xenobiotics. The main aim of the thesis was to evaluate the effect of gene optimization on heterologous expression of human cytochrome P450 3A4. At first expression constructs based on vectors pET22b were prepared. Then the efficiency of heterologous expression of optimized vs. natural gene sequence encoding truncated form of the human cytochrome P450 3A4 compared. The results show that the gen sequence optimized for E. coli strains K12 was expressed in significantly higher efficiency than the original human gene based on cDNA sequence. Another aim was to evaluate the suitability of pET22b based expression vectors for recombinant production of native (complete) form of human cytochrome P450 3A4. The amount of native form of the protein found in bacterial membrane was however substantially lower then that of the truncated form. Keywords: cytochrome P450 3A4, heterologous expression, pET22b, gene synthesis

The use of food supplements containing natural chemopreventive compounds increased in recent years. Some of the most popular chemopreventive compounds are flavonoids. Due to their natural origin, flavonoids are generally accepted as safe compounds. They exert antioxidant, anti-cancer and anti-inflammatory properties. However, flavonoids should be considered as foreign compounds (xenobiotics). Flavonoids interact with many enzymes, among the most important belong cytochromes P450 (CYPs), key enzymes of the first phase of biotransformation of xenobiotics (e.g. drugs, carcinogens). CYPs catalyze reactions leading mainly to detoxification of xenobiotics. However, some CYPs are involved in the activation of carcinogens, particularly CYP1A1 and CYP1A2 activate e.g. heterocyclic amines. Flavonoids might enhance the activation of carcinogens via induction of these CYPs or stimulation of their activities and hence, increase the risk of a cancer development. The thesis is focused on the influence of flavonoids and food carcinogens on the induction and activity of CYP1A1 and CYP1A2 in liver and small intestine of rats. For the purpose of this study, the small intestine was dissected into three parts: proximal (nearest to stomach), middle and distal. Western blotting was used for the evaluation of CYP...