Die MRD Diagnostik ist von erheblicher Bedeutung für die Risikostratifizierung kindlicher Leukämien. Um aber gesunde, sich regenerierende Vorstufen von blastären Zellen unterscheiden zu können ist die genaue Kenntnis des Antigenverlaufs sowohl der Vorstufen der B-Zellreihe als auch der Blasten notwendig. In dieser Arbeit wird eine Vergleichende Analyse von B-Zellvorstufen und Blasten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Von besonders diskriminativem Wert waren die Vorläufermarker CD10, CD34, sowie die lymphatischen Marker CD19, CD20, CD22, CD45, cyCD79a und cyTdT. Zur Beschreibung des individuellen LAIP eigneten sich vor allem die Marker CD11b, CD38, CD58, CD123 und CD133, sowie die myeloischen Marker CD13 und CD33. Die Bessere Unterscheidung zwischen gesunden und kranken Zellen zusammen mit neuen Entwicklungen in Diagnostik und Therapie muss in Zukunft zur weiteren Verbesserung der Überlebensraten, auch im Rezidiv führen. / MRD diagnostic is important for the ongoing therapy of cALL in children. For better discrimination between blasts and b-cell progenitors we used flow cytometry to analyse the antigen expression on b cell progenitors with those on cALL blasts.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

Eine etablierte Methode zur Analyse komplexer Ökosysteme ist die Durchflusszytometrie. Im Rahmen der Arbeit sollte die Validierung der Methodik, sowie die Ausarbeitung eines standardisierten und reproduzierbaren Arbeitsflusses für die Analyse des Speichelmikrobioms erfolgen. Zusätzlich sollte der Einsatz verschiedener Stressfaktoren (Zucker, Säure und antibakterielle Mundspüllösungen) getestet werden. Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle Überwachung und Verfolgung von Veränderungen innerhalb und zwischen mikrobieller Gemeinschaften. Ein tieferer Einblick in individuelle, ökologische Grundsätze des Speichelmikrobioms, bezogen auf Balance und Dysbalance unter gestressten Bedingungen wurde ermöglicht.

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Polyphosphat-speichernde Bakterien entfernen das im Abwasser enthaltene Phosphat durch Speicherung in Form von Granula, die dann mit einem Teil des Belebtschlammes aus dem Abwasser entfernt werden können. Dies ist wichtig um negative Einflüsse auf Oberflächengewässer wie Flüsse und Seen so gering wie möglich zu halten. Trotz intensiver Forschung ist der Prozess der sogenannten biologischen Phosphatelimination oft uneffektiv und im Jahresverlauf instabil, da über die im Belebtschlamm aktiven Polyphosphat-speichernden Bakterien nur wenig bekannt ist. Hauptproblem ist hierbei die geringe Kultivierbarkeit der Bakterien unter definierten Bedingungen (nur etwa 10-15 % der Mikroorganismen im Belebtschlamm sind kultivierbar). Aus diesem Grund war das Ziel der Arbeit die aktiven, Polyphosphat-speichernden Bakterien durchflusszytometrisch zu bestimmen und deren Dynamiken im Belebtschlamm kultivierungsunabhängig zu messen. Zunächst wurde ein Fixierungsprotokoll für die durchflusszytometrische Untersuchung der Polyphosphat-speichernden Bakterien erarbeitet, welches die größtmögliche Stabilität der hochdiversen mikrobiellen Gemeinschaft in Belebtschlammproben gewährleistet. Eine Mischung aus den Metallen Barium und Nickel (jeweils 5 mM) in einer 10%igen Natriumazidlösung erwies sich als bestes Fixierungsmittel mit einer Belebtschlamm-Stabilität von mindestens 9 Tagen. Um sowohl den DNA-als auch den Polyphosphat-Gehalt der Zellen messen zu können wurde weiterhin eine neue und sehr spezifische Polyphosphatfärbung auf Basis des fluoreszierenden Antibiotikums Tetrazyklin etabliert. Tetrazyklin bindet divalente Kationen, die auch in großer Menge in Polyphosphatgranula enthalten sind und fluoresziert gelblich grün. Die entwickelten Methoden zur Fixierung und Polyphosphatfärbung wurden an Belebtschlamm einer kommunalen Kläranlage getestet. Neben DNA- und Polyphosphat-Gehalt der Bakterienzellen wurde eine Vielzahl abiotischer Parameter (pH, Temperatur, Leitfähigkeit, …) gemessen. Diese wurden zusammen mit den durchflusszytometrischen Daten mittels Korrelationsanalyse ausgewertet. Hieraus ergaben sich wichtige Hinweise auf die Art der Polyphosphat-speichernden Bakterien, fördernde und störende Einflüsse des in der Kläranalage behandelten Abwassers auf die biologische Phosphatelimination und die Abhängigkeiten der mikrobiellen Gemeinschaft von Faktoren wie Temperatur, pH oder der anfallenden Regenmenge. Diese Erkenntnisse können genutzt werden um die biologische Phosphatelimination aus dem Abwasser zu verbessern und damit den Weg zu einer Ressourcen- und Umweltschonenden Phosphatrückgewinnung zu bereiten. Außerdem ist es, bei Kenntnis des kläranlagenspezifischen Prozesses, möglich anhand der durchflusszytometrischen Daten schnell die aktuelle Situation zu erfassen und gegebenenfalls rechtzeitig auf Änderungen zu reagieren, bevor es zu einer massiven Störung kommt. Eine Kombination von Durchflusszytometrie und der Erfassung abiotischer Daten ist nicht nur auf die biologische Phosphateliminierung anwendbar, sondern auch auf viele andere wissenschaftliche Fragestellungen.

Die humane Mundhöhle beheimatet als hoch komplexes Ökosystem eines der vielfältigsten Mikrobiome des gesamten Körpers. Das Vorhandensein diverser Nischen wird durch abiotische und biotische Parameter wie mikrogeographische Charakteristiken, die Verfügbarkeit von Nahrung und Sauerstoff, spezifische pH-Werte und Temperaturen, Abwehrsysteme und Essgewohnheiten des Wirtes sowie molekulare und bakterielle Interaktionen bedingt. Zum derzeitigen Kenntnisstand umfasst das orale Mikrobiom etwa 700 bakterielle Phylotypen, die zum Teil als orts- und/oder wirtsspezifisch klassifiziert werden können. Aufgrund kurzer Generationsfolgen innerhalb des bakteriellen Wachstums adaptieren die mikrobiellen Kompartimente schnell an sich verändernde Umweltbedingungen. Dabei ist ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der residenten Mikroflora und dem Wirt ohne die Prädominanz potenziell pathogener Spezies für die Mundgesundheit elementar. Dem Erhalt dieser oralen Homöostase dient u.a. der Speichel mit seinen vielfältigen Funktionen. Als globales Reservoir der Mikrobiota der Mundhöhle in ihrer planktonischen Phase reflektiert er zudem Veränderung innerhalb der bakteriellen Zusammensetzung, welche mit oralen Erkrankungen wie Karies, Gingivitis und Parodontitis assoziiert sind. Die einfache, non-invasive und kostengünstig durchführbare Entnahme gestaltet den Speichel zum attraktiven Analysemedium. Derzeit stellen hierfür Sequenzierungstechniken den Goldstandard zur Untersuchung der phylogenetischen Vielfalt des oralen Mikrobioms dar. Allerdings sind diese Methoden mit einem hohen finanziellen, zeitlichen und laboratorischen Aufwand verbunden. Ein bereits in der Umweltmikrobiologie etabliertes Verfahren zur Betrachtung komplexer Ökosysteme ist die Durchflusszytometrie. Sie ermöglicht - gemäß eines Screenings - die Visualisierung und Bewertung sich schnell verändernder Gemeinschaftsstrukturen. Außerdem können quantitative Analysen im Sinne von Zellzahlmessungen der betrachteten Proben durchgeführt werden. Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, die Anwendbarkeit der Durchflusszytometrie auf Untersuchungen bakterieller Kompartimente im humanen Speichel zu evaluieren. Dafür sollten im Rahmen des Teilprojektes der vorliegenden Dissertationsschrift zunächst intra- und interindividuelle Unterschiede der bakteriellen Zusammensetzung innerhalb eines dreimonatigen Entnahmezeitraums untersucht werden. In einem weiteren Teilprojekt verfolgte Frau van Gelder die Reaktion der Bakteriengemeinschaften auf verschiedene extrinsische Stresseinflüsse (Zucker, Säure und antibakterielle Mundspüllösungen). Für die geplante Untersuchung erfolgte die Auswahl von zehn oral und allgemein gesunden Probanden beider Geschlechter im Alter über 18 Jahren. Alle Teilnehmer der Studie erhielten eine einheitliche Zahnbürste (Elmex InterX mittel) und die Zahnpasta Meridol (beides CP GABA Hamburg, Deutschland). Die standardisierten Mundhygieneartikel sollten während des gesamten Zeitraums der Untersuchungen verwendet werden. Die Probanden wurden angewiesen, zweimal täglich ihre Zähne zu putzen. Für die Analyse zeitabhängiger intra- und interindividueller Unterschiede der Speichelmikrobiome erfolgten 11 Probenentnahmen in festgelegten Intervallen: 0 Stunden (h), 8h, 24h, 3 Tage (d), 7d, 2 Wochen (w), 4w, 6w, 8w, 10w und 12w nach Beginn der Untersuchung. An den Tagen der Speichelgewinnung wurden die Probanden angehalten, ihre Zähne bis zur Entnahme nicht zu putzen. Das letzte Zähneputzen sollte spätestens bis 24 Uhr des Vortages erfolgt sein. Ferner sollte eine Stunde vor Probengewinnung keine Nahrungs- oder Getränkeaufnahme stattfinden. Die Gewinnung unstimulierten Speichels wurde gemäß eines standardisierten und validierten Protokolls durchgeführt: Hierfür spülten die Probanden nach einer fünfminütigen Adaptationszeit für 30 Sekunden mit destilliertem Wasser und sammelten dann innerhalb weiterer fünf Minuten den unstimulierten Speichel im Mund. Im Anschluss an die Speichelprobengewinnung erfolgten die Fixierung des Gesamtspeichels mit Glycerol, eine Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff und die Lagerung bei -80°C. Für die weiterführende laboranalytische Auswertung wurden die Speichelproben aufgetaut und ihre Zellen entsprechend eines definierten Färbeprotokolls mit dem DNA-Farbstoff DAPI (Di-Amidino-2-Phenyl-Indol) behandelt bzw. gefärbt. Nachfolgend konnten die Proben im Durchflusszytometer (MoFlow Legacy cell sorter) vermessen und bezüglich der optischen Parameter Zellgröße (Vorwärtsstreulicht, „Forward Scatter“) und DNA-Gehalt (DAPI-Fluoreszenz) analysiert werden. Mit Hilfe der Programme Summit Ver. 4.3, FlowJo und flowCyBar erfolgte die bioinformatische Auswertung der zytometrischen Daten. Die Profile der Speichelmikrobiome zeigten über den untersuchten Zeitraum intra-individuelle Stabilitäten, aber unterschieden sich zwischen den Probanden, mit Ausnahme partieller Überlappungen. Personenspezifische Muster waren nachweisbar. Dabei stellten sich die Mikrobiomstrukturen einiger Probanden sehr beständig dar, während die bakteriellen Kompartimente anderer Probanden größere Schwankungen aufwiesen. Die zytometrischen Messungen wurden exemplarisch mittels Illumina®Sequenzierung verifiziert. Die phylogenetischen Unterschiede (Anzahl und Verteilung der operational taxonomic units) der Proben einer Versuchsperson zu unterschiedlichen Entnahmezeitpunkten waren hierin geringer als die der Proben zweier Teilnehmer zur selben Entnahme. Die unter Teilprojekt I formulierte Arbeitshypothese wurde durch die Ähnlichkeitsanalysen der Longitudinalstudie bestätigt. Auf dieser Basis können folgende Schlussfolgerungen getroffen werden: Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle Detektion komplexer bakterieller Kompartimente und deren Veränderungen im Speichel mundgesunder Probanden. Dabei sind individuelle, personenspezifische Bakterienprofile innerhalb der untersuchen Probanden graphisch darstellbar. Diese Profile weisen eine hohe innergemeinschaftliche Beständigkeit auf. Als qualitative Analyse bestätigt die Illumina®-Sequenzierung die Messung typischer Vertreter des Speichelmikrobioms im Zytometer sowie das Vorliegen intraindividueller Stabilitäten. Zur Verifizierung der Ergebnisse ist eine Ausweitung der Studie auf einen größeren Probandenpool erforderlich.:1. Einführung 1.1 Das orale Mikrobiom 1.2 Entwicklung des adulten oralen Mikrobioms und Einflüsse auf die mikrobielle Homöostase 1.3 Untersuchungsmethoden der oralen Mikrobiota 1.4 Durchflusszytometrie 1.5 Speichel 1.6 Zielsetzung und Fragestellung der vorliegenden Studie 2. Publikationsmanuskript 3. Zusammenfassung der Arbeit 4. Ausblick 5. Literaturverzeichnis 6. Wissenschaftliche Präsentationen 7. Darstellung des eigenen Beitrags 8. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 9. Lebenslauf 10. Danksagung

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

Polyphosphat-speichernde Bakterien entfernen das im Abwasser enthaltene Phosphat durch Speicherung in Form von Granula, die dann mit einem Teil des Belebtschlammes aus dem Abwasser entfernt werden können. Dies ist wichtig um negative Einflüsse auf Oberflächengewässer wie Flüsse und Seen so gering wie möglich zu halten. Trotz intensiver Forschung ist der Prozess der sogenannten biologischen Phosphatelimination oft uneffektiv und im Jahresverlauf instabil, da über die im Belebtschlamm aktiven Polyphosphat-speichernden Bakterien nur wenig bekannt ist. Hauptproblem ist hierbei die geringe Kultivierbarkeit der Bakterien unter definierten Bedingungen (nur etwa 10-15 % der Mikroorganismen im Belebtschlamm sind kultivierbar). Aus diesem Grund war das Ziel der Arbeit die aktiven, Polyphosphat-speichernden Bakterien durchflusszytometrisch zu bestimmen und deren Dynamiken im Belebtschlamm kultivierungsunabhängig zu messen. Zunächst wurde ein Fixierungsprotokoll für die durchflusszytometrische Untersuchung der Polyphosphat-speichernden Bakterien erarbeitet, welches die größtmögliche Stabilität der hochdiversen mikrobiellen Gemeinschaft in Belebtschlammproben gewährleistet. Eine Mischung aus den Metallen Barium und Nickel (jeweils 5 mM) in einer 10%igen Natriumazidlösung erwies sich als bestes Fixierungsmittel mit einer Belebtschlamm-Stabilität von mindestens 9 Tagen. Um sowohl den DNA-als auch den Polyphosphat-Gehalt der Zellen messen zu können wurde weiterhin eine neue und sehr spezifische Polyphosphatfärbung auf Basis des fluoreszierenden Antibiotikums Tetrazyklin etabliert. Tetrazyklin bindet divalente Kationen, die auch in großer Menge in Polyphosphatgranula enthalten sind und fluoresziert gelblich grün. Die entwickelten Methoden zur Fixierung und Polyphosphatfärbung wurden an Belebtschlamm einer kommunalen Kläranlage getestet. Neben DNA- und Polyphosphat-Gehalt der Bakterienzellen wurde eine Vielzahl abiotischer Parameter (pH, Temperatur, Leitfähigkeit, …) gemessen. Diese wurden zusammen mit den durchflusszytometrischen Daten mittels Korrelationsanalyse ausgewertet. Hieraus ergaben sich wichtige Hinweise auf die Art der Polyphosphat-speichernden Bakterien, fördernde und störende Einflüsse des in der Kläranalage behandelten Abwassers auf die biologische Phosphatelimination und die Abhängigkeiten der mikrobiellen Gemeinschaft von Faktoren wie Temperatur, pH oder der anfallenden Regenmenge. Diese Erkenntnisse können genutzt werden um die biologische Phosphatelimination aus dem Abwasser zu verbessern und damit den Weg zu einer Ressourcen- und Umweltschonenden Phosphatrückgewinnung zu bereiten. Außerdem ist es, bei Kenntnis des kläranlagenspezifischen Prozesses, möglich anhand der durchflusszytometrischen Daten schnell die aktuelle Situation zu erfassen und gegebenenfalls rechtzeitig auf Änderungen zu reagieren, bevor es zu einer massiven Störung kommt. Eine Kombination von Durchflusszytometrie und der Erfassung abiotischer Daten ist nicht nur auf die biologische Phosphateliminierung anwendbar, sondern auch auf viele andere wissenschaftliche Fragestellungen.

Die Dissertation umfasst zwei Themenblöcke: Zum einen wurden die optisch-spektroskopischen Eigenschaften von fluoreszenten, farbstoffbeladenen Polymer-Mikropartikeln untersucht. Zum anderen wurde die Anwendbarkeit solcher Partikel für die Lumineszenzlebensdauer-Kodierung in der Durchflusszytometrie evaluiert. Die Charakterisierung der farbstoffbeladenen Mikropartikel erfolgte mittels optischer Spektroskopie. Am Beispiel mit Rhodamin 6G beladener Polymethylmethacrylat-Partikel konnte ein besseres Verständnis des Einbaus der Farbstoffmoleküle und der resultierenden Fluoreszenz-Charakteristika gewonnen werden. Es stellte sich heraus, dass die Beladungseffizienz stark vom mittleren Partikeldurchmesser und den Synthesebedingungen abhängt. In Verbindung mit den beobachteten optisch-spektroskopischen Eigenschaften wurde geschlussfolgert, dass sich eine farbstoffreiche Schicht an der Oberfläche der Partikel bildet, die sich wesentlich von den sterisch eingebauten Farbstoffmoleküle im Partikelvolumen unterscheidet. Hohe Farbstoffkonzentrationen in dieser Oberflächenschicht führen vermutlich zu Aggregation. Des Weiteren deuten Veränderungen der Fluoreszenzeigenschaften auf intrapartikuläre Energiewanderung bei zunehmender Farbstoffkonzentration hin. Diese Interpretation der experimentellen Ergebnisse konnte qualitativ durch einen Algorithmus zur Simulation der Energiewanderung bestätigt werden. Die Anwendbarkeit der Lumineszenzlebensdauer als Kodierungsparameter in der Zeitdomäne konnte unter Verwendung eines Durchflusszytometer-Prototypen analysiert werden. Die wohl größte Herausforderung bei der Lebensdauermessung in der Durchflusszytometrie ist die kurze Interaktionszeit zwischen Objekt und Anregungslicht. Synthetische Daten wurden herangezogen, um den Einfluss einzelner Messparameter und -bedingungen unabhängig voneinander abzuschätzen. Es konnte festgestellt werden, dass die Lumineszenzlebensdauer als Kodierungsparameter in der Zeitdomäne prinzipiell zugänglich ist. / This thesis comprises two main topics. First, the optical-spectroscopic properties of fluorescent microbeads loaded with organic dyes were studied. In the second part, the feasibility of time-domain luminescence lifetime encoding in flow cytometry based on such microbeads was assessed. The study of the dye-loaded polymer microbeads was based on optical spectroscopy. Poly(methyl methacrylate) beads loaded with rhodamine 6G were used as an example system to achieve a better understanding of the dye incorporation procedure. The dye loading efficiency turned out to be strongly dependent on the mean diameter of the beads and on the amounts of certain compounds used for the bead synthesis. In correlation with the observed fluorescence characteristics, it was deduced that a layer with high local dye concentration forms around each bead. The properties of this layer substantially differ from those of the sterically incorporated dye molecules in the bead core. The high dye concentration in this layer results in aggregation accompanied by the respective changes of the fluorescence characteristics of the beads. Moreover, the observed changes in fluorescence properties indicated the existence of an intra-particulate energy migration process at increased dye loading concentrations. A simulation of the energy migration process based on a random walk algorithm confirmed the interpretation of the experimental results. For the assessment of luminescence lifetime encoding in time-domain flow cytometry, a prototype setup was used. The main issue of lifetime determination in flow cytometry is represented by the short interaction time of only tens of microseconds of the objects with the excitation light spot. Synthetic data were used to study certain measurement parameters and conditions as well as the data analysis procedure independently of other influences. As a result, luminescence lifetime is generally applicable as an encoding parameter in time-domain flow cytometry.