In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Anwendbarkeit eines hochmodernen 100 kHz BB-VSFG-Spektrometers, das kürzlich im SALSA Photonics Lab entwickelt wurde, für die Analyse der Grenzflächenstruktur von Alkylketten, des sie umgebenden Wassers und der Phosphatkopfgruppen von Phospholipidschichten. Zunächst wurden Phospholipid-Doppelschichten, die mehrere Komponenten enthalten, bei Laserwiederholraten von 5, 10, 50 und 100 kHz mit konstanter Pulsenergie untersucht. Die BB-VSFG-Spektren legen nahe, dass die Phospholipid-Doppelschichten während der Messungen ohne wärmeinduzierte Veränderungen stabil waren. Darüber hinaus bot die Erhöhung der Laserwiederholungsrate eine praktikable Möglichkeit, Spektren in kurzen Datenerfassungszeiten zu erhalten, ohne dass das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigt wurde. Die extrem kurze Aufnahmezeit von 500 ms, die hohe spektrale Auflösung und alle verwendeten Pulsparameter sorgen dafür, dass bei Messungen unter Umgebungsbedingungen keine thermisch bedingten Photoschäden auftreten. Es wurde eine systematische Untersuchung von ein- und zweikomponentigen Phospholipid-Monoschichten in Abhängigkeit von der Oberflächenspannung und dem Mischungsverhältnis für verschiedene Kombinationen an Polarisationen durchgeführt und die Abhängigkeit der Schwingungsspektren untersucht. Die Struktur von Alkylketten und umgebendem Wasser wurde anhand derselben Modellsystemen analysiert. Bislang nicht beobachtete Schwingungsbanden und Spektren von Monolagen mit geringer Oberflächenbedeckung wurden mit einem bisher nicht erreichten Signal-Rausch-Verhältnis gemessen und beschrieben. Die Struktur von Phospholipid-Monolagen mit identischen Kopfgruppen und unterschiedlichen Ketten wurde analysiert und verglichen. Die Spektren bestätigten die Anwesenheit von Wassermolekülen in der Nähe der Phosphat- und Cholingruppen der Phospholipid-Monolagen. / This thesis focuses on the applicability of a state-of-the-art 100 kHz BB-VSFG spectrometer recently developed at the SALSA Photonics Lab and on the analysis of the interfacial structure of alkyl chains, surrounding water, and the phosphate head groups of phospholipid layers. First, multi-component phospholipid bilayers were studied at laser repetition rates of 5, 10, 50, and 100 kHz at constant pulse energy. The spectra suggest that the phospholipid bilayers were stable during the measurements with no heat-induced distortions. Moreover, an increase in the laser repetition rate provided a feasible route to obtain spectra in short data acquisition times without compromising the signal-to-noise ratio. The extremely short acquisition time of 500 ms, the high spectral resolution, and all applied pulse parameters ensured no thermal induced photodamages occur during the measurements. A systematic study of one- and two-component phospholipid monolayers as a function of surface tension and mixture ratio at different polarization combinations was performed and the dependence of the vibrational spectra was explored. The structure of alkyl chains and surrounding water was analyzed using the same model systems. Vibrational modes that were previously unseen and spectra of monolayers at low surface coverage were reported for the first time with an unprecedented signal-to-noise ratio. The structure of phospholipid monolayers containing identical head groups and different chains was analyzed and compared. The order of the phospholipid molecules as a function of the composition of the monolayers was inferred from the spectral data. The influence of the hydration and/or changes in the orientation of the phosphate group was visible from the spectra as well.

Sphingolipide sind essentielle Bestandteile der Plasmamembranen aller eukaryotischen Organismen und besitzen als Signalmoleküle regulierende Eigenschaften auf diverse zelluläre Prozesse. Hierbei spielen die G-Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren eine wichtige Rolle. Diese werden durch das natürliche Sphingosin-1-phosphat sowie die Sphingosin-Derivate FTY720 und cis-4-Methylsphingosin selektiv adressiert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von fünfzehn neuartigen Sphingosin-Derivaten mit potenziell neuen biologischen Eigenschaften. Hierfür wurde die Leitstruktur des natürlichen D-erythro-Sphingosins an den Positionen 1, 3 und/oder 4 modifiziert. Die biologischen Studien mit diesen Verbindungen lieferten erste Erkenntnisse zur Inhibition des S1P-induzierten Calcium-Anstiegs, der Wechselwirkung mit den S1P-Rezeptoren und der zellulären Lokalisation in Chlamydia trachomatis infizierten Zellen. Darüber hinaus wurde eine Methode, die einen schnelleren und variablen Zugang zu den 4-verzweigten Sphingosin-Derivaten erlaubt, etabliert. / Sphingolipids are essential constituents of plasma membranes in all eukaryotic organisms. They also participate as signalling molecules in almost all physiological processes. Here G-protein coupled S1P receptors play an important role. These receptors are selectively addressed by natural ligand sphingosine-1-phosphate as well as by sphingosine analogues FTY720 and cis-4-methylsphingosine. This work describes the synthesis of fifteen sphingosine analogues with potential biological activity. For this purpose, the natural lead structure of D-erythro-sphingosine was modified at positions 1, 3 and/or 4. The biological studies of these compounds provided the first insights to the inhibition of S1P-induced calcium increase, the interaction with S1P receptors and the cellular localization in Chlamydia trachomatis infected cells. Moreover, an adapted method that allowed faster and adaptable access to 4-branched sphingosines was established.

Geladene Phosphatgruppen sind von wesentlicher Bedeutung für die Hydratisierung von Phospholipiden und DNS. Hydratisierungshüllen spielen eine wichtige Rolle für die Ausbildung und Stabilisierung von Zellmembranen und der DNS-Doppelhelixstruktur. In dieser Arbeit werden elementare Phosphat-Wasser-Wechselwirkungen in einem Phospholidmodellsystem – sogenannten inversen Mizellen - mit variablen Wassergehalt zwischen einem und 16 Wassermolekülen pro Phospholipid untersucht. Die schnellsten Prozesse an den Grenzflächen wie z.B. Phosphat-Wasser-Wasserstoffbrückendynamik und Schwingungsenergieumverteilung finden auf einer Femto- bis Pikosekundenzeitskala statt. Molekulare Schwingungen sind sensitive lokale Sonden für die Struktur und Dynamik. Deshalb ermöglicht Femtosekunden-Schwingungsspektroskope, insbesondere zweidimensionale Infrarotspektroskopie (2D IR) und Pump-Probe-Spektroskopie in einem breiten Spektralbereich, die Dynamik mikroskopischer Phosphat-Wasser-Wechselwirkungen in Echtzeit zu beobachten. Wir zeigen die ersten zweidimensionalen Infrarotspektren von Phosphat-Streckschwingungen, die unabhängig vom Wassergehalt grenzflächensensitive Sonden darstellen. Solche Spektren belegen, dass die schnellsten strukturellen Fluktuationen der Phospholipid-Kopfgruppen auf einer 300-fs Zeitskala ablaufen, wohingegen die Phosphat-Wasser-Wasserstoffbrücken länger als 10 ps bestehen bleiben. Die Schwingungsdynamik intramolekularer Wasserschwingungen, d.h. der OH-Streck- und Biegeschwingung, zeigen, dass sich kleine Wasserpools um die Phosphatgruppen bilden, sobald drei oder mehr Wassermoleküle pro Phospholipid vorliegen. Solche Wasserpools dienen als effiziente Wärmesenken für intramolekulare Schwingungen des Wassers und der Phosphatgruppen. / Charged phosphate groups are the major hydration sites of biomolecules such as phospholipids and DNA. Hydration shells play a key role in the formation and stabilization of cell membranes and the DNA double helix structure. Here, we introduce phospholipid reverse micelles with variable water content (between one and sixteen water molecules per phospholipid) as a model system to study elementary phosphate-water interactions. The fastest processes at phosphate-water interfaces , e.g. hydrogen-bond dynamics and vibrational energy transfer occur on a femto- to picosecond time scale. Since molecular vibrations are sensitive local probes of the structure and dynamics, the use of femtosecond vibrational spectroscopy, in particular two-dimensional infrared spectroscopy (2D IR) and pump-probe spectroscopy in a broad spectral range, allow for the observation of microscopic phosphate-water interactions in real time. We present the first two-dimensional infrared spectra of phosphate stretching vibrations that represent true interfacial probes independent of the hydration level. Such spectra reveal that the fastest structural fluctuations of phospholipid headgroups occur on a 300-fs timescale whereas phosphate-water hydrogen bonds are preserved for >10 ps. Vibrational dynamics of intramolecular water vibrations, i.e., the OH stretching and bending modes show that small water pools around the phosphate groups form when three or more water molecules per phospholipid are present. Such water pools act as efficient heat sinks of excess energy deposited in intramolecular vibrations of water or the phosphate groups.