Proteasomen sind Protease-Komplexe, die im Nucleo- und Cytoplasma eukaryontischer Zellen vorkommen. 26S-Proteasomen bestehen aus einem proteolytisch aktiven 20S-Kernkomplex und zwei regulatorischen 19S-Komplexen. Die Regulatorkomplexe erkennen Proteinsubstrate und kontrollieren den Zugang der Substrate in den katalytisch aktiven 20S-Komplex. Die Assemblierung des 20S-Komplexes erfolgt über Halbproteasomen, in denen Ringe aus a-Untereinheiten mit pro-b-Untereinheiten assoziiert sind . Modellvorstellungen zufolge erfolgt die Dimerisierung zweier Halbproteasomen in ein kurzlebiges Intermediat, das naszierende 20S-Proteasom, bevor die aktiven b-Untereinheiten autokatalytisch prozessiert werden. Der konservierte Maturierungsfaktor Ump1 ist mit proteasomalen Vorläuferkomplexen assoziiert und wird nach der Dimerisierung der Halbproteasomen und der Prozessierung der katalytischen Untereinheiten im Inneren des naszierenden 20S-Proteasoms degradiert. Auch Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe sind vorwiegend nukleär. Grundlage dieser Arbeit war die Identifizierung des Proteins Blm3 als Proteasomen-assoziiertes Protein in Kernextrakten aus S. cerevisiae. Fluoreszenzmikroskopisch konnte die nukleäre Lokalisation von Blm3 in vivo gezeigt werden. Durch Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation und die Charakterisierung von durch native Gel­elektrophorese aufgetrennten Komplexen konnte gezeigt werden, dass Blm3 an Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe gebunden vorliegt. Durch native Gelelektrophorese und GFP-Markierungstechniken wurden Ump1-assoziierte Vorläuferkomplexe in Halbproteasomen und naszierende Proteasomen fraktioniert. Es konnte gezeigt werden, dass Blm3 nicht mit Halbproteasomen, sondern mit naszierenden 20S-Proteasomen interagiert. Im Dblm3-Deletionsstamm wurde durch Pulse Chase-Analysen eine beschleunigte Kinetik der Prozessierung des naszierenden Proteasoms und eine beschleunigte Degradation des Maturierungsfaktors Ump1 beobachtet. Das Protein Blm3 verzögert die Reifung des naszierenden Proteasoms in das maturierte 20S-Proteasom. Blm3 übt vermutlich einen koordinierenden oder regulatorischen Effekt auf die Maturierung und letztlich auf die Aktivierung des 20S-Proteasoms aus. / Proteasomes are multisubunit protease complexes that occur in the nucleo- and cytoplasm of eucaryotic cells. They participate in a variety of biological processes. 26S proteasomes consist of a proteolytically active 20S core complex and two regulatory 19S complexes. The regulatory complexes recognize substrate proteins and control the substrate access into the catalytically active 20S complex. The hollow cylindrical 20S complex consists of four heptameric staggered rings. The two inner rings contain seven different b-subunits each, three of which are catalytically active. The two outer rings possess seven different catalytically inactive a-subunits each. The assembly of the 20S complex occurs via half proteasomes in which rings of a-subunits are associated with pre-b-subunits. According to models, the dimerization of two half proteasomes into a short-lived intermediate, the nascent 20S proteasome, takes place before the active b-subunits are processed autocatalytically. The conserved maturation factor Ump1 is associated to half proteasomes and is, after their dimerization and the processing of the catalytical subunits, degraded inside the nascent 20S proteasome. In yeast, proteasomes are essentially localized at the nuclear periphery. Ump1-associated half proteasomes are also predominantly nuclear. The protein Blm3 was found associated with the Ump1-associated half proteasome in nuclear extracts of S. cerevisiae. By fluorescence microscopy, the nuclear localization of Blm3 could be shown in vivo. Ump1-associated precursor complexes were fractionated into half proteasomes and nascent proteasomes by native gel electrophoresis and GFP labelling techniques. It could be shown that Blm3 interacts with nascent proteasomes but not with half proteasomes. In a Dblm3 deletion strain, an accelerated kinetics of processing of proteasomal precursor complexes as well as an accelerated degradation of the maturation factor Ump1 could be observed by pulse chase analysis. Accordingly, the protein Blm3 delays the maturation of the nascent proteasome into the mature 20S proteasome. As a coordinating protein, Blm3 presumably exerts a regulating effect onto the maturation and, finally, onto the activation of the 20S proteasome.

Viele Bacillus Stämme sekretieren Phytasen, diese katalysieren die Dephosphorylierung von myo-Inositolhexakisphosphat (phytate). Das monocystronische phyC Gen aus dem im Boden lebenden Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte als Teil des, durch Phosphatmangel induzierbaren, PhoPR-Regulons identifiziert werden. Der Transkriptionsstart des SigmaA-abhängigen Promotors wurde 27 bp upstream von Translationsstart bestimmt. Der Promotor weist jedoch eine ungewöhnliche Struktur auf, da die –35 und die –10 Region durch ein 21 bp Fenster voneinander getrennt sind. Die in vitro Transkriptionsanalyse zeigte, dass PhoP-P für die Initiation der phyC-Transkription notwendig ist. Die PhoP-Bindungsstellen der meisten B. subtilis Promotoren, die durch PhoP aktiviert werden, besitzen mindestens vier TTAACA-ähnliche Sequenzmotive, welche durch 5-6 bp- Intervalle getrennt sind. Die upstream Region von phyC aus B. amyloliquefaciens FZB45 weicht von dieser Struktur ab. Hier konnten nur zwei solcher Motive, die für die Bindung eines PhoP-Dimeres zuständig sind und die Positionen -47 und -35 überlagern, identifiziert werden. Ein weiteres Motiv befindet sich zwischen -13 und –8 und überlappt um eine Base mit der –10 Region. Die Funktionen der drei Bindungsstellen konnten durch DNaseI-Footprinting ermittelt werden. Ein PhoP-Dimer besetzt die –35 Region und dirigiert dabei die RNA-Polymerase wahrscheinlich in Richtung –10 Region. Durch die Bindung von PhoP an die PhoP-Erkennungsstelle bei –10 wird die Transkription gehemmt. Diese PhoP-vermittelte duale Kontrolle des phyC-Promotors scheint bis lang einzigartig für Pho-Regulongene zu sein. Der globale Regulator AbrB konnte als weiterer Repressor des phyC identifiziert werden. Die Bindungsstelle befinden sich upstream von –147 und downsteam von +29, müssen aber in weiteren Experimenten genauer spezifiziert werden. Diese Arbeit stellt als erste die Modelle der phyC-Regulation durch PhoP und AbrB vor. / Several Bacillus strains secrete phytase, an enzyme catalysing dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The monocistronic phyC (phytase) gene from environmental Bacillus amyloliquefaciens FZB45 was identified as a member of the phosphate-starvation inducible PhoPR regulon. The transcriptional start was determined downstream of a sigmaA-like promoter region located 27 bp upstream of the translation start codon. Inspection of the phyC promoter sequence revealed an unusual structure, since the -35 and -10 region are separated by a window of 21 bp. In vitro transcription analysis established that PhoP-P is necessary to initiate the transcription from phyC promoter. PhoP binding boxes occurring in most B. subtilis promoters activated by PhoP consist of at least four TTAACA-like sequences repeated at intervals of 5-6 bps. The upstream region of the B. amyloliquefaciens FZB45 phyC gene deviates from this general architecture in that there is only one appropriate binding site for the dimeric PhoP protein, which consists of two motives centered at -47 and -35 and separated by five base pairs. A single PhoP binding site is located at -13 to -8, nearly matching the -10 consensus. Functionality of the three PhoP binding boxes was demonstrated by DNaseI footprinting suggesting that a pair of dimeric PhoP molecules cover the -35 region directing the RNA-polymerase to the –10 region. Binding of PhoP at a single PhoP binding site covering the -10 consensus repress the transcription. It seems to be a unique feature of the phyC promoter structure and has not been reported for any other member of the PhoPR regulon, previously. Furthermore an inhibitory effect via AbrB, a global regulator, could be verified. The binding regions could be determine upstream of –147 and downstream of +29, but have to be specify in further experiments. This work presents for the first time the models for the regulation of phyC in Bacillus via PhoP and AbrB.

Prolylcarboxypeptidase (PRCP, EC3.4.16.2) ist ein ubiquitär exprimiertes Enzym, mit höchster Expression im Maushirn. Es spaltet spezifisch die letzte carboxyterminale Aminosäure von Substraten, deren vorletzte Aminosäure ein Prolin ist. Seine bisher publizierten Substrate Angiotensin II (AngII) und alpha Melanocortin Stimulierendes Hormone (alphaMSH) legen eine Rolle von PRCP in der Entwicklung von kardiovaskulären und metabolischen Krankheiten nahe. Um die in vivo Funktion von PRCP zu studieren, wurde eine Knockout Maus generiert (PRCP-/-). Metabolischer Phänotyp: PRCP-/- Mäuse zeigten generell ein reduziertes Körpergewicht, selbst wenn sie über Monate mit einer Hochfettdiät versorgt wurden. Erhöhte Plasmaleptin Werte und Proopiomelanocortin (pomc) Expression in knockout Hypothalami wiesen auf eine wichtige Rolle von PRCP in der Regulation von Futteraufnahme und Energiehomöostase hin. Eines der Genprodukte von pomc ist alphaMSH, welches im Hypothalamus die Futteraufnahme terminiert. Die carboxyterminale Struktur dieses Neuropeptids erfüllt alle Voraussetzungen, um von PRCP gespalten zu werden. Zudem konnte prcp Promotoraktivität in den selben Hirnstrukturen gezeigt werden, in denen auch alphaMSH-Wirkung beschrieben wurde. Eine mögliche Funktion von PRCP wäre somit die Inaktivierung des Appetitzüglers alphaMSH im Hypothalamus. Kardiovasculärer Phänotyp: Zunächst erwiesen sich zirkulierende Ang-Peptide in PRCP-/- Mäusen als unverändert. Jedoch konnte ein erhöhtes Niveau des Degradationsproduktes Ang1-7 in der Niere gezeigt werden. Die Entdeckung einer erhöhten Enzymaktivität von Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) in PRCP-/- Nieren, wurde als Kompensation der fehlenden PRCP Aktivität in PRCP-/- Nieren interpretiert. bot einen Erklärungsansatz für dieses Ergebnisse. Es wird davon ausgegangen, daß ACE2 die fehlende PRCP Aktivität in knockout Mäusen kompensiert. Das es sich hierbei um eine lokale begrenzte Kompensation handeln muß, zeigten der erhöhte Blutdruck und Herzrate, sowie die milde Herzhypertrophie. Da spezifische prcp Promotoraktivität in Hirnnuclei gefunden wurde, die in die Kontrolle der Herzfrequenz und des Blutdrucks involviert sind, wird eine regulatorische Funktion von Hirnstamm-PRCP auf Herzrhytmus und Blutdruck vermutet. / Prolylcarboxypeptidase (PRCP, EC3.4.16.2) is an enzyme specifically cleaving the last carboxy-terminal amino acid from substrates containing a penultimate proline. Its known potential substrates are linked to cardiovascular and metabolic phenomenon. To analyse the in vivo function of this enzyme a PRCP knockout mouse was generated. Homozygous knockout mice are viable but show tendency of decreased life span. In mice prcp expression is present in all tissues tested with very specific localizations of prcp promotor activity to distinct brain areas within the cortex, hippocampus, hypothalamus and the brain stem. The metabolic phenotype of PRCP deficient mice is characterized by low body weight even when feeding the animals a high fat diet. The increased plasma leptin levels and elevated expression of proopiomelanocortin gene (pomc) found in knockout hypothalami suggests an involvement of PRCP in the regulation of food intake and energy homeostasis. One of the gene products of pomc is alpha-melanocortin stimulating hormone (alphaMSH) that is terminating feeding when released from hypothalamic POMC neurons. Its carboxy-terminal structure is fitting the cleavage preferences of PRCP. Prcp promotor activities are localized in arcuate nucleus and paraventricular nucleus, brain areas of known alphaMSH signalling, supporting a role of PRCP in the degradation of central alphaMSH. The impact of PRCP on angiotensin II (AngII) metabolism was studied by determining the level of AngII and its degradation product Ang1-7 in blood and tissues. But instead of increased AngII levels due to the missing degradation enzyme in knockout mice, Ang1-7 levels were increased in kidney. These results were explainable by the increased activity of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) found in kidney. Probably ACE2 is compensating the lack of PRCP in the knockout mouse. Nevertheless, blood pressure and heart rate of PRCP knockout mice was increased. The mild hypertension was accompanied by mild hypertrophy of the hearts. Prcp promotor activity was found in brain stem an area important for regulation of blood pressure and heart rate suggesting that central PRCP regulates blood pressure.

Polyelektrolytmikrokapseln (PEMC) stellen ein neuartiges System künstlicher Zellen dar. Durch Einbringen von z.B. Hämoglobin in solche PEMC können sie als  künstliche Erythrozyten den Gastransport im Organismus unterstützen bzw. übernehmen. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass jede Zelle des Säugtierorganismus zur Aufrechterhaltung ihrer Funktion Enzyme benötigt, die ihre Stoffwechselfunktionen katalysieren. Um sich der Lösung dieses Problems bei der Entwicklung eines künstlichen Erythrozyten schrittweise zu nähern, wurde als Modellenzym Trypsin ausgewählt. Es wurden Polyelektrolytmikrokapseln (PEMC) auf der Basis von Erythrozyten durch Selbstassemblierung von Polynatriumstyrensuphonat (PSS) und Polyallylamino-hydrochlorid (PAH) hergestellt ((PSS/PAH)2PSS), und anschliessend nach der Layer-by-Layer Methode (LbL) alternierend mit Trypsin und den Polyelektrolyten (PE) PSS, Alginat oder Dextransulphat weiterbeschichtet. Der Schichtenaufbau wurde durch Zellelektrophorese, konfokale Laserscanning-mikroskopie (CLSM), Durchflusszytometrie (FACS) und photometrische Proteinbestimmung charakterisiert und quantifiziert. Die Aktivität des an der PEMC-Membran immobilisierten Enzyms wurde untersucht und mit der Aktivität freien Trypsins verglichen. Weiterhin wurden pH-Profile von freiem Enzym mit denen des immobilisierten Trypsins verglichen. Der Schichtaufbau aus Trypsin und den unterschiedlichen Polyelektrolyten wurde anhand der Änderung der elektrophoretischen Mobilität beim Aufbringen jeder Schicht, sowie durch die Zunahme der photometrisch bestimmten Proteinmenge pro PEMC charakterisiert. Außerdem wurde Trypsin mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) markiert und in den Beschichtungsserien die Zunahme der flowzytometrisch bestimmten Fluoreszenz-Intensität mit jeder aufgebrachten FITC-Trypsin Schicht beobachtet. Die Aktivität des an den PEMC immobilisierten Trypsins beträgt etwa 30% der Aktivität freien Trypsins gleicher Konzentration. Es konnte gezeigt werden, dass sich Trypsin im Rahmen eines Schichtaufbaus nach der LbL-Technologie in die Membran der verwendeten PEMC einbringen lässt. Dabei behält das Enzym einen Teil seiner Funktion. / Artificial cells are not only used to study the biological processes of living cells, they also serve as micro reactors to provide certain functions in the organism. Polyelectrolyte microcapsules (PEMC) represent a new approach to artificial cell studies. When filled with hemoglobin, PEMC are able to perform the erythrocyte gas exchange. This work shows the general possibility of integrating enzymes into the PEMC membrane. PEMC were composed using the layer-by-layer (l-b-l) technique. Glutaraldehyde stabilized human red blood cells (RBC) served as templates and were coated with five layers poly(styrene sulfonate) (PSS) and poly(allylaminehydrochloride) (PAH). After decomposition of the RBC by sodium hypochlorite, the PEMC were coated with ten layer pairs of trypsin and either PSS or alginate. The trypsin layer growth was followed performing measurements by cell electrophoresis, confocal laser scanning microscopy (CLSM), flow cytometry (FACS) and protein determination according to Lowry after each adsorption step. Results showed a continuous layer buildup for both polyelectrolytes and no desorption of trypsin. The amount of immobilized enzyme was larger for the coating series with trypsin/PSS compared to that with trypsin/alginat. This was concluded as a result of PSS/trypsin complex formation. Normalizing the enzym activity to the amount of adsorbed trypsin no significant differences between the activity of PSS-PEMC and alginate-PEMC were found. Further experiments prove that PSS inhibits the enzyme activity and alginat does not.

Bakterien haben eine Vielzahl an Strategien entwickelt, um sich an ständig wechselnde Umweltbedingungen anzupassen, darunter auch post-transkriptionelle regulatorische Mechanismen. Die Genexpression kann hierbei durch gezielten Abbau oder Stabilisierung von RNA durch Ribonukleasen (RNasen) reguliert werden. RNasen weisen je nach Spezies allerdings unterschiedliche Effekte auf Genexpression und bakterielle Physiologie, sowie verschiedene Strategien der Substraterkennung auf. Dies zeigt, dass unser Verständnis des RNA-Abbaus bei weitem nicht vollständig ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die Eigenschaften und Funktionen der endoRNase Y des humanpathogenen Bakteriums Streptococcus pyogenes zu studieren. Um Einblick in Funktion und Spezifität dieser RNase zu gewinnen, wurden deren genomweite Schnittpositionen (“targetome”) mit Hilfe von RNA-Sequenzierung identifiziert. Zur weiteren Analyse des RNase Y-abhängigen RNA-Abbaus wurde dieses Ergebnis mit dem “targetome” der drei 3′-5′-Exoribonukleasen (ExoRNasen) PNPase, YhaM und RNase R verglichen. Schließlich wurden die Anforderungen für die Prozessierung durch RNase Y und deren Rolle in der Regulation von Virulenzgenen in vivo anhand der speB mRNA, die einen wichtigen Virulenzfaktor codiert, untersucht. Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass RNase Y Substrate bevorzugt nach einem Guanosin schneidet und dieses Nukleosid essenziell für die Prozessierung der speB mRNA in vivo ist. Obwohl RNase Y die speB mRNA schneidet, unterstützen die Daten ein Modell nach dem RNase Y die Expression von speB auf transkriptioneller Ebene reguliert. Mit Hilfe des “targetome”-Vergleichs konnten wir ferner zeigen, dass RNase Y den RNA-Abbau in S. pyogenes initiiert und die dabei generierten 3′-Enden der RNA hauptsächlich von den 3′-5′-exoRNasen PNPase und/oder YhaM prozessiert werden. Zusammenfassend erweitern diese Erkenntnisse unser Verständnis der Funktionalität von RNase Y und des RNA-Abbaus in Gram-positiven Bakterien. / Bacteria have developed a plethora of strategies to cope with constantly changing environmental conditions, including post-transcriptional regulatory mechanisms. With this regard, regulation of gene expression can be achieved by either the rapid removal or stabilization of RNA molecules by ribonucleases (RNases). RNases exhibit species-specific effects on gene expression, bacterial physiology and different strategies of target recognition, indicating that our understanding of the RNA degradation machinery is not yet complete. The aim of this thesis was to investigate the features and functions of endoRNase Y from the strict human pathogen Streptococcus pyogenes. To gain insight into the role and specificity of this RNase, we identified RNase Y cleavage positions (i.e. targetome) genome-wide by RNA sequencing. Next, to investigate the RNA degradation pathway depending on RNase Y, we compared the RNase Y targetome with the ones of the three 3′-to-5′ exoribonuclease (exoRNases), namely PNPase, YhaM and RNase R. Finally, to dissect the requirements for RNase Y processing and to decipher the role of RNase Y in virulence gene regulation, we studied the impact of RNase Y on speB mRNA, encoding a major virulence factor. This study reveals that RNase Y preferentially cleaves RNAs downstream of a guanosine and for the first time we were able to show that the presence of a guanosine residue is essential for the processing of speB mRNA, in vivo. Although RNase Y cleaves the speB mRNA, our data underpin a model in which RNase Y-mediated regulation of speB expression occurs at the transcriptional level. Using the targetome comparative approach, we demonstrated that RNase Y initiates RNA decay in S. pyogenes and that the RNase Y-generated RNA 3′ ends are usually further trimmed by PNPase and/or YhaM. Overall, these findings increase our understanding of RNase Y functionality and RNA degradation in Gram-positive bacteria.

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) stellt eines der wichtigsten zellulären Abbausysteme dar. Es vermittelt die Degradation fehlgefalteter, beschädigter sowie regulatorischer Proteine. Folglich ist es essentiell für die Proteinqualitätskontrolle und für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Eine Störung des UPS steht im engen Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen und malignen Tumoren. Adaptive Mechanismen ermöglichen es der Zelle das UPS an den stetig schwankenden Bedarf proteolytischer Aktivität anzupassen. So wirkt eine erhöhte Expression proteasomaler Gene einem Abfall der proteasomalen Aktivität entgegen. Der Transkriptionsfaktor TCF11/Nrf1 wurde hierbei als Hauptregulator identifiziert. Unter physiologischen Bedingungen ist TCF11/Nrf1 in der ER-Membran lokalisiert und wird über das ER-assoziierte Degradationssystem (ERAD) abgebaut. In Antwort auf Proteasominhibition wird der Transkriptionsfaktor aktiviert und in den Nukleus transferiert. Hier vermittelt er durch Bindung der regulatorischen antioxidative response elements die Genexpression proteasomaler Untereinheiten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass es sich bei diesem autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus um einen generellen adaptiven Regulationsmechanismus in Mammalia handelt. Zudem ergaben weitere Untersuchungen, dass der durch Proteasominhibition hervorgerufene oxidative Stress, die TCF11/Nrf1-vermittelte Aktivierung der Genexpression fördert. Die induzierende Wirkung von oxidativem Stress wurde ferner unter Verwendung des Pro-Oxidans Rotenon bekräftigt. Dieses Neurotoxin induziert die TCF11/Nrf1-abhängige Transkription proteasomaler Untereinheiten und folglich die Neubildung aktiver Proteasomkomplexe. Der Transkriptionsfaktor förderte ferner die Zellviabilität Rotenon-behandelter SH-SY5Y Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die TCF11/Nrf1-vermittelte Genexpression proteasomaler Untereinheiten bedeutend für die Aufrechterhaltung der Redox- sowie der Protein Homöostase ist. / The ubiquitin proteasome system (UPS) represents a major protein degradation machinery. It facilitates the degradation of misfolded and damaged as well as regulatory proteins, thereby ensuring protein quality control and regulation of various cellular processes. Disturbances of the UPS are strongly associated with neurodegeneration and cancer. Adaptive mechanisms enable the cell to deal with changing demand in proteolytic activity. A rise in proteasomal gene expression compensates for decreased proteasomal activity. This adaption is mainly regulated by the transcription factor TCF11/Nrf1. Under unstressed conditions TCF11/Nrf1 resides in the ER-membrane where it is degraded via the ER-associated protein degradation system (ERAD). Proteasome inhibition causes the nuclear translocation of TCF11/Nrf1. In the nucleus, it mediates the gene expression of proteasomal subunits by interacting with their regulatory antioxidant response elements. Within this thesis, it was shown, that this autoregulatory feedback loop represents a general adaptive mechanism in mammalian cells. Moreover, experiments using antioxidative compounds revealed, that the oxidative stress induced by proteasomal inhibition promotes the TCF11/Nrf1-dependent proteasomal gene expression. The inducing effect of oxidative stress was verified using the pro-oxidant rotenone. This neurotoxin activates the transcription of the proteasomal genes resulting in the formation of newly synthesised, active proteasome complexes. Thus, TCF11/Nrf1 exerts a cytoprotective function in response to oxidative and proteotoxic stress in SH-SY5Y cells. In conclusion, this thesis revealed that TCF11/Nrf1-dependent induction of the proteasome expression promotes the maintenance of the redox as well as protein homeostasis.

EcoP15I ist ein Vertreter der multifunktionalen, heterooligomeren Typ III Restriktionsendonukleasen. Typ III Restriktionsendonukleasen sind wegen der Lage ihres Spaltortes, ca. 25 bp vom Erkennungsort entfernt, von besonderem Interesse für Anwendungen in der Medizin und funktionellen Genomanalyse. EcoP15I erkennt die DNA-Sequenz 5''-CAGCAG und benötigt für eine effektive DNA-Spaltung zwei invers orientierte Erkennungsorte auf einem DNA-Molekül. Nach dem bisherigen DNA-Translokations-Modell bindet je ein EcoP15I-Protein an je einen Erkennungsort und startet dann durch ATP-Hydrolyse vermittelte DNA-Translokation. Die Kollision der beiden EcoP15I-DNA-Komplexe initiiert die DNA-Doppelstrang-Spaltung. Experimente zur Erkennungsort-Suche von EcoP15I zeigen, dass über längere Distanzen offenbar nicht das "Sliding", sondern ein dreidimensionaler Prozess die bevorzugte Bewegung von EcoP15I an der DNA ist. Eine erhöhte Anzahl von Wiederholungen von CAG-Trinukleotiden (CAG-Repeats) im Exon 1 des Gens für Chorea Huntington (Huntington Disease - HD) führt zur Manifestation dieser neurodegenerativen Erkrankung. Für die Diagnostik der Erkrankung ist die exakte Bestimmung der Anzahl der CAG-Repeats von Bedeutung. Diese Arbeit zeigt die Spaltung von HD Gen Exon 1 DNA durch EcoP15I. Die halbautomatische, hoch-sensitive Analyse dieses Spaltmusters ermöglicht die exakte Bestimmung der Anzahl der CAG-Repeats. Diese Arbeit liefert den ersten Nachweis für die DNA-Translokation durch eine Typ III-Restriktionsendonuklease. Die postulierten EcoP15I-DNA-Schlaufen wurden mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (SFM) abgebildet. Dadurch wird das DNA-Translokations-Modell der DNA-Spaltung durch EcoP15I bestätigt. Es werden Gemeinsamkeiten und Unterschiede des gesamten DNA-Spaltvorganges der Typ III Restriktionsendonuklease EcoP15I in bezug auf andere Restriktionsendonukleasen diskutiert. / EcoP15I is a multifunctional, hetero-oligomeric Type III restriction enzyme. Type III restriction enzymes are of general interest in medicine and functional genome analysis because they cut DNA 25 bp downstream of their recognition site. EcoP15I recognises the DNA sequence 5`-CAGCAG and needs two inverse oriented recognition sites for effective DNA cleavage. According to the present translocation collision model DNA cleavage was proposed to result from ATP dependent DNA translocation, which is expected to induce DNA loop formation, and collision of two enzyme-DNA complexes. Experiments show that EcoP15 moves rather in a three-dimensional than in a "sliding" process in search for its recognition site. Huntington''s disease (HD) is a progressive neurodegenerative disorder with autosomal-dominant inheritance. The disease is caused by a CAG trinucleotide repeat expansion located in the first exon of the HD gene. To diagnose the illness the exact determination of the number of CAG repeats is necessary. This study shows that the number of CAG repeats in the HD gene can be determined by restriction of the DNA with the endonuclease EcoP15I and subsequent high-resolution analysis of the restriction fragment pattern using the ALFexpress DNA Analysis System. Here, for the first time DNA translocation by the Type III restriction enzyme EcoP15I is demonstrated. The postulated EcoP15-DNA loops are visualised using scanning force microscopy. This confirms the translocation-collision model for DNA cleavage by EcoP15. Similarities and differences between the DNA cleavage processes of the Type III restriction enzyme EcoP15I and other restriction enzymes are discussed.

Die homodimere Typ IIE Restriktionsendonuklease EcoRII erfordert im Gegensatz zu den orthodoxen Typ II Restriktionsendonukleasen die simultane Wechselwirkung mit zwei Kopien ihrer DNA-Erkennungssequenz 5'CCWGG, um die spezifische endonukleolytisch Spaltung der DNA zu katalysieren. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie bewiesen, daß EcoRII die Bildung von DNA-Schlaufen an einem linearen DNA-Substrat mit zwei DNA-Erkennungsorten induziert - ähnlich wie andere DNA prozessierende Enzyme und Transkriptionsfaktoren. Kinetische Untersuchungen der DNA-Spaltreaktion von EcoRII mit superhelikaler Plasmid-DNA, die entweder einen oder zwei DNA-Erkennungsorte für EcoRII enthielt, zeigten, daß EcoRII pro Spaltereignis nur an einem der beiden involvierten doppelsträngigen DNA-Erkennungsorte spaltet. Die Studie, in der EcoRII photochemisch mit den Basen der DNA-Erkennungssequenz vernetzt wurde, ergab ein asymmetrisches Vernetzungsmuster, das durch die partielle Asymmetrie an der A/T-Position der ansonsten palindromischen Erkennungssequenz hervorgerufen wird. Wir konnten zeigen, daß die Aminosäure Tyr41 von EcoRII das 5'C des 5'CCAGG-Stranges der Erkennungssequenz kontaktiert. Durch Aufklärung der Domänenorganisation von EcoRII konnten wir das Modell der EcoRII-DNA-Interaktion verbessern. Wir zeigten, daß für die simultane Interaktion des Enzyms EcoRII mit zwei Kopien der Erkennungssequenz zwei verschiedene Domänen verantwortlich sind. Die C-terminale Domäne ist eine neue Restriktionsendonuklease, die effizienter als das vollständige EcoRII an einzelnen Erkennungsorten spaltet. Die N-terminale Domäne bindet spezifisch an die DNA und reduziert die Aktivität des vollständigen Enzyms, indem sie die Spaltung von einem zweiten Erkennungsort abhängig macht. Daher nehmen wir an, daß EcoRII in der Evolution in Form der N-terminalen Domäne eine zusätzliche DNA-Bindungsfunktion akquiriert hat, um eine neue Proteinfunktion zu entwickeln, die die Spaltung von DNA und die Interaktion mit zwei DNA-Erkennungsorten einschließt. Solche Interaktionen sind z.B. Voraussetzung für die DNA-Rekombination oder Transposition. Daher könnte die gegenwärtige EcoRII Restriktionsendonuklease eine evolutionärer Übergang von ortsspezifischen Endonukleasen zu einem neuen Protein sein, das spezifisch mit zwei DNA-Orten interagiert. / The homodimeric type IIE restriction endonuclease EcoRII requires the cooperative interaction with two copies of the recognition sequence 5'CCWGG for DNA cleavage. This is in contrast to the orthodox type II restriction endonucleases which interact with single recognition sequences. We have proven by transmission electron microscopy that EcoRII simultaneously binds two recognition sites on a linear DNA-substrate by looping out the intervening DNA. This DNA-loop formation is similar to that of other DNA processing enzymes and transcription factors. Kinetic investigations of the DNA cleavage of supercoiled DNA-plasmids containing either one or two recognition sites for EcoRII showed that EcoRII cleaves only at one of the two involved double-stranded DNA recognition sites. Photocross-linking of EcoRII to the bases of the recognition sequence revealed an asymmetric cross-linking pattern. This asymmetry is due to the partial asymmetry of the recognition sequence at the central A/T position. Furthermore, we found that amino acid Tyr41 of EcoRII specifically contacts the 5'C of the 5'CCAGG strand of the recognition sequence. We found by limited proteolysis that a two-domain structure enables EcoRII to interact cooperatively with two recognition sites. The C-terminal domain is a new restriction endonuclease that, in contrast to the complete EcoRII, specifically cleaves at single 5'CCWGG recognition sites. Moreover, this new restriction endonuclease cleaves much more efficiently than EcoRII. The N-terminal domain specifically binds the DNA-substrate and reduces the activity of EcoRII by making the enzyme dependent on a second recognition site. Therefore, we assume that a precursor EcoRII enzyme acquired another DNA binding domain to develop a new protein function that includes DNA cleavage and specific interaction with two DNA sites. The current EcoRII protein could be an evolutionary intermediate between a site-specific endonuclease and a protein that functions specifically with two DNA sites such as DNA recombinases and transposases.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.

Die fünf CSS-Domänen Phosphodiesterasen aus Escherichia coli K12 (E. coli) gehören zu den weit verbreiteten c-di-GMP-PDEs. Ein Vertreter, PdeC, wurde bereits von Herbst et al. (2018) charakterisiert. Durch DsbA/DsbB geförderte Disulfidbrückenbindung (DSB) in der CSS-Domäne von PdeC wird die PDE-Aktivität des Proteins gehemmt. Gegenteilig ist die freie Thiolform, in Abhängigkeit von der TM2 als Dimerisierungs-Domäne, enzymatisch aktiver. Diese Form wird von den periplasmatischen Proteasen DegP und DegQ prozessiert. Ein irreversibel aktiviertes TM2+EAL-Fragment wird generiert, dass durch weitere Proteolyse langsam entfernt wird. Die Reduktion der CSS-Domäne von PdeC zur der freien Thiolform stimuliert die PDE-Aktivität der EAL-Domäne in vitro. Zusammen mit den Daten von Herbst et al. (2018) wird die CSS-Domäne in dieser Arbeit als eine neue sensorische Domäne charakterisiert, dessen Aktivität durch einen DSB/Thiol-Schaltmechanismus reguliert wird. Alle fünf CSS-Domänen-PDEs von E. coli K12 weisen eine ähnliche Domänenarchitektur auf, jedoch unterscheiden sich Redox-Biochemie, Proteolyse und PDE-Aktivität innerhalb dieser Proteinfamilie. Auf Basis der PDE-Aktivität von Nicht-DSB-Varianten wurden PdeB, PdeC und PdeG als aktivierbare (Reduktion steigert die PDE-Aktivität) und PdeD und PdeN als nicht aktivierbare (Reduktion inaktiviert PDEs) charakterisiert. Ein weiterer Vertreter de CSS-Domänen PDEs, PdeN, scheint nicht über die Ausbildung einer DSB in der CSS-Domäne reguliert und aktiviert zu werden. Nach erfolgter Proteinbiosynthese wird die Proteinkonzentration vielmehr über den N-Terminus reguliert, wobei saure Wachstumsbedingungen das Protein maßgeblich induzieren und die Aktivität erhöhen. Wird das Protein erfolgreich in die Membran eingelagert, kann es bedingt durch die strukturelle DSB seine PDE-Aktivität entfalten und die Biofilmmatrixproduktion maßgeblich beeinflussen. / The five CSS domain phosphodiesterases from Escherichia coli K12 (E. coli) belong to the widespread group of c-di-GMP PDEs. One representative, PdeC, has already been characterized by Herbst et al. (2018). DsbA/DsbB promoted disulfide bond (DSB) formation in the CSS domain of PdeC inhibits the PDE activity of the protein. On the contrary, the free thiol form is more enzymatically active, depending on the TM2 as the dimerization domain. This form is processed by the periplasmic proteases DegP and DegQ. An irreversibly activated TM2 + EAL fragment is generated that is slowly removed by further proteolysis. The reduction of the CSS domain of PdeC to the free thiol form stimulates the PDE activity of the EAL domain in vitro. Together with the data from Herbst et al. (2018) the CSS domain is characterized as a new sensory domain whose activity is regulated by a DSB / thiol switch mechanism. All five E. coli K12 CSS domain PDEs share a similar domain architecture, but redox biochemistry, proteolysis, and PDE activity differ within the protein family. On the basis of the PDE activity of non-DSB variants, PdeB, PdeC and PdeG were characterized as activatable (reduction increases PDE activity) and PdeD and PdeN as non-activatable (reduction inactivated PDE activity). Another representative of the CSS domain PDEs, PdeN, does not seem to be regulated and activated by forming a DSB in the CSS domain. After protein biosynthesis the protein concentration is rather regulated via the N-terminus, with acidic growth conditions significantly inducing the protein and increasing its activity. If the protein is successfully inserted in the membrane, it can develop its PDE activity due to the structural DSB and influence the biofilm matrix production significantly.