Mit dem Ziel stabile und photomodulierbare Fluorophore für ihre direkte Anwendung in der hochaufgelösten Mikroskopie, wurde die Synthese und Charakterisierung von neuen fern Rot emittierender photoschaltbarer Fluorophore erreicht. Hierbei wurde die elektronische Kopplung zwischen den Komponenten tiefgreifend untersucht, und die Struktur Eigenschafts Beziehung etabliert. Durch die Wechselwirkung der photochromen Einheit mit dem Fluorophor, konnte die Fluoreszenzemission ein- und ausgeschaltet werden. Zusätzlich wurden Einkapselungs Experimente in Micellen durchgeführt, um die Wasserlöslichkeit der synthetisierten Verbindungen zu untersuchen. Letzlich, wurden mögliche Anwendungen mittels Fluoreszenzmikroskopie geprüft. Mit dem Ziel hochaufgelöste Bilder unter biologischen Bedingungen zu erhalten, wurde die Verkapselung der Dyaden in riesige unilamellare Vesikel erprobt. Unter Ausnutzung der Vorteile nichtlinearer Prozesse wurde die Synthese und Charakterisierung von photochromen Verbindungen, die in der Lage indirekt durch einen anfänglichen sensibilisierten Prozess geschaltet werden, untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Triarylamin Chromophor als Zwei-Photonenabsorber kovalent an einen Azobenzol verbunden. Die Charakterisierung der angeregten Zustandsdynamik wurde ausgeführt und die zwei Photonen induzierte Isomerisierung der Dyade bestätigt. Eine detaillierte Untersuchung der elektrochemischen Eigenschaften wurde durchgeführt und Richtlinien zur Verbesserung des Systems wurden kurz genannt. / With the purpose of designing stable and photomodulable fluorophores for their direct application in subdiffraction microscopy techniques, the synthesis and characterization of new far-red emitting photoswitchable fluorophores was accomplished. Fluorescence emission was efficiently modulated or switched On and Off by the interaction of the photochromic unit with the fluorescent-unit. Additionally, encapsulation experiments in micelles were performed to investigate the water solubility of the synthesized compounds. Finally, potential applications were examined with fluorescence microscopy, encapsulating the dyads in giant uni-lamellar vesicles under biological conditions to explore the feasibility to obtain highly resolved subdiffraction images. Exploiting the advantages of nonlinear processes, the synthesis and characterization of photochromes which are able to be switched indirectly through an initial sensitized event were studied. With this determination a two-photon absorbing triarylamine chromophore was covalently linked to an electron poor azobenzene. In-depth characterization of the excited state dynamics was performed and two photon induced isomerization of the dyad was confirmed. A detailed study of the electrochemical properties was set and guidelines towards the improvement of the system were succinctly mentioned.

In dieser Arbeit wurde die Methode der breitbandigen fs-zeitaufgelösten Fluoreszenzaufkonversionsspektroskopie (FLUPS) weiterentwickelt und vollständig theoretisch beschrieben, was anhand des Vergleichs von vorhergesagten und experimentell bestimmten photometrischen Korrekturfunktionen gezeigt werden konnte. Die Methode wurde verwendet, um lokale Fluoreszenzspektren von solvatochromen Sonden in der Nähe bestimmter Matrizes in wässrigen Lösungen zu messen. Aus der Dynamik der Stokes-Verschiebung konnte die Solvatations- bzw. Umgebungsdynamik bestimmt werden. Es wurden mittlere Solvatationszeiten τsolv von 0.57±0.06 für reines Wasser, 2.8±0.2 ps für DNA, 480±30 ps für Phospholipid-Kopfgruppen, 0.71±0.03 ps für ein Peptid (α-Helix) und 0.76±0.03 ps für eine t-Butyl-Gruppe erhalten. Hervorzuheben sind dabei die überraschend schnelle Relaxation nahe des Peptids und die sehr langsame Dynamik nahe der Lipid-Kopfgruppen, welche über 5 Größenordnungen der Zeit beobachtet wurde. Um den Einfluss einer hydrophoben Gruppe auf die Solvatationsdynamik erstmals zu aufzuzeigen, wurden präzise Messungen bei verschiedenen Temperaturen vor-genommen. Zuordnungen dieser Dynamiken zu molekularen Prozessen konnten durch Vergleiche zu MD-Simulationen durchgeführt werden. / The method of broadband fs time-resolved fluorescence upconversion spectroscopy (FLUPS) was further developed and completely theoretically described in this work. This was shown by comparing predicted and measured photometric correction functions. This method was used to obtain local fluorescence spectra of solvatochromic dyes near certain matrices in aqueous solution. From the dynamics of the Stokes-Shift the solvation or environmental dynamics respectively were obtained. Average solvation times τsolv of 0.57±0.06 for bulk water, 2.8±0.2 ps for DNA, 480±30 ps for phospholipid head groups, 0.71±0.03 ps for a peptide (α-helix) and 0.76±0.03 ps for a t-butyl group were obtained. Emphasized are the surprisingly fast dynamics near the peptide and the slow dynamics of the lipid head group region. The latter was observed over 5 orders of magnitude in time. To distinguish the influence a hydrophobic group for the first time, precise measurements at different temperatures were performed. Molecular processes were assigned to the obtained dynamics by comparisons to MD studies.

Optische Sonden für die Bildgebung auf Grundlage des pH-Wertes sind für die Wissenschaft von großem Interesse, da es sich beim pH-Wert um eine entscheidende Kenngröße für viele Prozesse in der Biotechnologie, Biologie, medizinische Diagnostik, biomedizinische Forschung und Materialkorrosion handelt. Optische pH-Sensoren, deren Funktionsprinzip auf dem photophysikalischen Prozess Fluoreszenz basieren, sind dabei von besonderem Interesse, da die Fluoreszenz eine sehr hohe Empfindlichkeit, welche sogar die Auflösung einzelner Moleküle ermöglicht, bietet. Dies ermöglicht den Einsatz von molekularen über nanoskaligen Sensorformaten bis hin zur Anwendung in planaren Optoden oder faseroptischen Sensoren, und gilt, neben der nicht-invasiven, zerstörungsfreien und kontaktlosen Natur optischer Fluoreszenzmessungen, als anwendungsfreundliche Eigenschaft dieser optischen Sensoren. Der Informationsgehalt fluoreszenzintensität-basierender Sensoren ist normalerweise unspezifisch auf die An- oder Abwesenheit des Fluorophors und des Analyten beschränkt. Weiterhin kann er durch Schwankungen der Intensität des Anregungslichts und Änderungen der Fluorophorkonzentration, z.B. durch Photodegradation, beeinflusst werden. Daher werden Fluoreszenzsensoren oftmals in referenzierten Systemen verwendet. Diese Systeme ermöglichen, durch die Einführung einer analyt-inerten Referenz, ein duales, ratiometrisches Auslesen der Fluoreszenzintensitäten von zwei spektral unterscheidbaren Komponenten. In dieser Arbeit wird das konzeptionelle Design einer modular variierbaren, auf mehreren Komponenten basierenden Plattform für die ratiometrische optische Analytmessung vorgestellt. Dazu wurden fluoreszente, leicht zugängliche und analyt-sensitive Boron-Dipyrromethene (BODIPYs) mit durch nahes Infrarot (NIR) anregbare, mehrfarbig emittierende Aufkonvertierungs-Nanopartikel (UCNPs) kombiniert. Das Sensorprizip beruht dabei auf einem inneren Filter-Effekt der spektral abgestimmten Komponenten. / Optical probes for monitoring, imaging, and sensing of pH are of great interest for the scientific community as pH is a crucial marker for many processes in biotechnology, biology, medical diagnostics, biomedical research, and material corrosion. Thereby, optical pH sensors based on fluorescence have attracted interest in particular as fluorescence offers a high sensitivity down to the single molecule level, can be read out with relatively simple and readily miniaturized instrumentation, and allows online in situ measurements. Also the versatility ranging from molecular and nanosensor formats to planar optodes and fiber-optic sensors, and the non-invasive, non-destructive, and contactless nature of the measurement are application-friendly features. The information content, which is offered by a fluorescence intensity-based sensor, is usually unspecific and limited on the presence or the absence of the chromophore or analyte and can additionally be hampered by fluctuation of the excitation light intensity and changes in fluorophore concentration, e.g., due to photobleaching. Therefore, many fluorescence sensors are utilized in referenced systems, which enable twowavelength ratiometric measurements of the fluorescence intensity by the introduction of an analyte-inert reference with a spectrally distinguishable emission. This work presents the rational design of a versatile, modular, multi-component-based platform for ratiometric optical analyte sensing that can be simply adapted to different formats and measurement geometries. Therefore, readily available analyte-responsive fluorescent boron-dipyrromethene (BODIPY) dyes and near infrared (NIR)-excitable multicolouremissive upconversion nanoparticles (UCNPs) were combined utilizing an inner filter-based strategy with spectrally matched moieties.

In dieser Arbeit wurden die von Seitz et al. entwickelten forced intercalation (FIT)-Sonden zur mRNA-Charakterisierung in lebenden Zellen eingesetzt. Es erfolgte die Synthese verbesserter FIT-Sonden für die systematische Untersuchung der Aufnahme durch lebende Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen. Dafür wurden sowohl hergestellte FIT-Sonden-Konjugate/Aggregate als auch kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. die Palmitinsäure und das porenbildende Enzym Streptolysin-O auf ihre Effizienz untersucht. Die optimalen Bedingungen für das Einbringen von DNA- und PNA-FIT-Sonden in Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen lieferte das Enzym Streptolysin-O. Durch den simultanen Einsatz von drei unterschiedlichen Sonden (BO-, TO- und CB-markiert), komplementär zu drei verschiedenen Zielsequenzen, gelang es erstmals eine Dreifarben-Lebendzell-Bildgebung mit FIT-Sonden durchzuführen. Des Weiteren wurden TO-FIT-Sonden zur Unterscheidung verschiedener T-Zelllinien eingesetzt. Mithilfe eines kompetitiven Hybridisierungsexperiments konnte die spezifische Fluoreszenzemission der Sonden in den Zellen belegt werden. Untersuchungen mit zwei T-Zelllinien zeigten, dass TO-FIT-Sonden sowie terminal Cy7-markierte TO-FIT-Sonden eine erhöhte TO-Emission bei Vorhandensein der komplementären TCR-mRNA-Zielsequenz in den Zellen aufwiesen. Der terminale Cy7-Farbstoff bot mit einem zweiten Detektionskanal die Möglichkeit die Cy7-Intensität und die vorhandene TO-Intensität ins Verhältnis zu setzen, sodass Signale von ungebundener Sonde leichter ausgeschlossen werden konnten. Dies ermöglichte eine spezifische Markierung der T-Zellen. Es folgte die Synthese CB-markierter FIT-Sonden zur Aufklärung biologischer Fragestellungen, wie dem Verlauf einer Influenza A Infektion und die Synthese und Evaluation neuer Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum bei 590/596 nm. Zudem wurde der Einbau eines zyklischen PNA- Monomers bezüglich der Verbesserung von Responsivität und Helligkeit von PNA-FIT-Sonden analysiert. / In this work forced Intercalation (FIT) probes, developed by Seitz et al. were used for the mRNA characterization in living cells. The synthesis of improved FIT probes as well as the systematic study on the uptake of FIT probes by living Flp-In™ 293 T-REx™ cells was performed. Therefore FIT probe conjugates/aggregates as well as commercially available reagents, e.g. palmitic acid and the pore-forming enzyme Streptolysin-O were investigated under various conditions. Furthermore, the transfection was tested using an electroporator. The optimal transfection condition for the introduction of DNA and PNA FIT probes into Flp-In™ 293 T-REx™ cells was achieved using Streptolysin-O. Multicolor live cell imaging with the simultaneous use of three different FIT probes (BO, TO and QB) against three different target sequences was performed successfully. In addition, FIT probes were used for the differentiation between T cell lines. A competitive hybridization experiment with cells confirmed the specific fluorescence emission of the probes. Further studies with two cell lines and TO-FIT probes as well as terminal Cy7-labeled TO-FIT probes showed an increased TO emission in the presence of the complementary TCR mRNA target sequence in the cells. A second detection channel of the terminal Cy7 dye provided the advantage of comparing the Cy7- and TO-intensity ratio, thereby making it easier to exclude signals from unbound probe. This enabled the specific tagging of t cells. This was followed by the synthesis of QB-DNA-based FIT probes for the use in various biological applications e.g. as a pan selective marker for Influenza A infection. Moreover, the synthesis and evaluation of new dyes with an absorption maximum at 590/596 nm was performed. The incorporation of a cyclic PNA monomer next to the TO dye has also been realized to improve responsiveness and brightness in PNA-FIT probes.

In dieser Arbeit wurden fluoreszierende MIP-Partikel hergestellt, um polare Analyten von biologischer und ökologischer Bedeutung zu analysieren, zum Beispiel den Krebs-Biomarker Sialinsäure (SA) und die Herbizide Glyphosat (GPS), Haloxyfop P und Fenoxaprop P. Die MIP-Schale wurde auf Siliziumdioxid und siliziumdioxid-beschichtete Polystyrol (PS)-Kernpartikel synthetisiert und enthielt einen Fluoreszenzfarbstoff, dessen Signal in Anwesenheit der Zielanalyten verstärkt wurde. Die Leistungsfähigkeit aller MIP-Partikel wurde durch den Vergleich ihres Bindungsverhaltens mit den nicht geprägten Polymer (NIP)-Partikeln und/oder durch ihre Diskriminierungsfähigkeit gegenüber konkurrierenden Analyten bewertet. Fluoreszierende Monomer für die MIP-Synthese erwiesen sich als vorteilhaft, da sowohl die Bindungsleistung als auch die Assoziationskonstanten einfacher bestimmt werden konnten. Als Alternative zur traditionellen Wasserstoffbrückenbindung zwischen Analyt und Bindungseinheit des Farbstoffes in unpolaren Lösungsmitteln, kann die Deprotonierung-Protonierung von harnstoffhaltigen Farbstoffen als Sensing-Mechanismus in polaren Medien wie DMF verwendet werden. Darüber hinaus führte die Verwendung eines „Dummy“-Analyten für die NIP-Partikel-Synthese zu einer Polymerschicht mit ähnlichen Eigenschaften wie die der MIP-Partikel, womit "Dummy"-NIPs als deutlich bessere Kontrollpartikel herangezogen werden konnten. Insgesamt erwies sich die Bestimmung der Diskriminierung der MIPs gegenüber konkurrierenden Analyten als konsistenteres Maß für die Leistungsbeurteilung. Mit Siliziumdioxid beschichtete, farbstoffdotierte PS-Partikel erwiesen sich als vielseitige Plattform für das Aufwachsen fluoreszierender MIP-Schalen, um zweifach fluoreszierende MIPs zu erhalten. Das Vorhandensein eines Kontrollsignals ist vorteilhaft für die Korrektur instrumenteller Schwankungen während analytischer Tests. / Fluorescent MIP particles were prepared to target highly polar analytes of biological and environmental significance, namely sialic acid (SA) and glyphosate (GPS), haloxyfop P and fenoxaprop P. Silica and silica-coated polystyrene (PS) particles were used as core supports on which a MIP shell was synthesized. In all systems, the MIP shell contained a fluorescent dye with urea sensing motifs whose signal was enhanced in the presence of the target analyte. The performance of all MIP particles was evaluated by comparing their binding behaviour to that of non-imprinted polymer (NIP) controls and/or determining their discrimination ability against competing analytes. It was found that the application of fluorescent monomers in MIP synthesis is advantageous due to simplified determination of binding performance and binding parameters such as association constants. It was also shown that deprotonation-reprotonation of urea containing dyes can be used as a sensing mechanism in polar media such as DMF, as an alternative to traditional hydrogen bonding in non-polar aprotic solvents. In addition, the results showed that the inclusion of a “dummy” template during NIP synthesis led to the formation of a polymer layer with similar properties as the MIP, and thus, “dummy” NIPs provided a more relevant comparison for MIP binding. Overall, the discrimination of MIPs against competing analytes was found to be a more consistent measure of MIP performance. When a urea containing dye was used to prepare MIPs targeting anions by hydrogen bonding in non-polar media, the choice of counterion used during imprinting influenced the binding behaviour of the resulting MIPs and must be carefully chosen. Lastly, silica-coated dye-doped PS was found to be a versatile platform for the grafting of fluorescent MIP shells to achieve dual fluorescent MIPs, and the presence of a control signal was beneficial in correcting instrumental fluctuations during analytical assays.

In dieser Arbeit sollte eine Derivatisierungsmethode entwickelt werden, die die duale Quantifizierung funktioneller Gruppen an Oberflächen mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Fluoreszenz ermöglicht. Verschiedene Farbstoffe, die robuste Fluoreszenzeigenschaften mit hohen Fluorgehalten für XPS kombinieren, wurden auf ihre selektive Reaktion mit Aminogruppen getestet und der Prototyp einer tiefergehenden Analyse auf einer Oberfläche unterzogen. Durch Fluoreszenzlöschung konnten die Möglichkeiten der bimodalen Analyse nur begrenzt abgeschätzt werden, obwohl in XPS und Fluoreszenz intensive Signale gemessen wurden. Die Herstellung der Modelloberflächen mittels Gasphasenabscheidung von Silanen konnte durch Kontaktwinkelmessungen schrittweise optimiert werden. Die Kombination zweier Monoalkoxysilane ermöglichte die Herstellung von Oberflächen mit variabler Funktionalgruppendichte. Nach Reaktion mit dem dualen Marker ließen sich die Messungen aus XPS und Fluoreszenz mindestens über eine Größenordnung korrelieren. Durch Synchrotron-XPS (SR-XPS) und Röntgenfluoreszenz unter Totalreflektion (TXRF) konnte eine absolute und rückführbare Quantifizierung erzielt werden. Weitere Modelloberflächen auf Basis von Trialkoxysilanen zeigten, dass bei anwendungsnahen Proben Fluoreszenzlöschung auftritt. Diese konnte in einem gewissen Maße mittels Fluoreszenzlebensdauer berechnet werden. Darüberhinaus konnte mit der Photometrie eine unabhängige Methode gefunden werden, die die Quantifizierung des Farbstoffs an der Oberfläche in hoher Präzision ermöglicht und mit Hilfe der XPS auch der funtionellen Gruppen. Die Cavity Ring-Down Spektroskopie (CRDS) wurde als Laserbasierte Methode zur empfindlichen und ortsaufgelösten Messung der Absorption auf transparenten Substraten untersucht und erste vielversprechende Ergebnisse gewonnen. Weiterhin wurde ein modulares Farbstoffsystem entwickelt, das sowohl Variation der spektralen als auch der Bindungseigenschaften erlaubt. / This work aimed on the development of dual-mode labelling method that combines X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) with fluorescence measurements for surface functional group quantification. Label dyes combining robust fluorescence properties with high fluorine contents were investigated towards their selective reaction with surface amino groups and the lead candidate subjected to detailed analysis on a surface. Fluorescence quenching precluded a detailed investigation of the capabilities of dual-mode labelling, despite providing sufficient signal in XPS and fluorescence scanning. The fabrication of surfaces using vapour deposition (VD) of silanes in toluene was optimized under aid of contact angle measurements. Binary mixtures of mono-alkoxy silanes were used to prepare surfaces with variable functional group density. Treatment with the label dye showed that XPS and fluorescence provide a linear overlap in signal generation over at least one order of magnitude. The combination of synchrotron radiation XPS (SR-XPS) and total reflection X-ray fluorescence spectroscopy (TXRF) provided an absolute and traceable quantification . Different model surfaces based on trialkoxy silanes showed strong fluorescence quenching. A fluorescence lifetime based correction was developed to account for such quenching effects. Additionally, the application of spectrophotometry provided a independent method of quantification for the surface bound dye and in combination with information obtained from XPS, to determine the surface functional group density. With cavity ring-down spectroscopy (CRDS), a laser based technique for highly sensitive and spatially resolved absorption measurements on transparent substrates could be developed and applied in a proof-of-concept. A modular system for the fabrication of label dyes with adjustable spectral properties and different binding sites was investigated using prototype candidates to prove the general applicability of such systems.

Gadoliumbasierte Kontrastmittel werden in der Magnetresonanztomographie verwendet und gelangen nach der Exkretion durch behandelte Patienten in Oberflächengewässer, da sie von Klärwerken nur unzureichend entfernt werden. Das Verhalten der Kontrastmittel in der Umwelt und deren Wechselwirkung mit Organismen wurde in dieser Arbeit aufgrund der Toxizität des freien Gd-Ions und der damit verbundenen möglichen Gefahren, wie der Anreicherung in der menschlichen Nahrungskette, näher untersucht. Die bildgebenden elementanalytischen Methoden Laserablation mit induktiv gekoppelter Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) und Röntgenfluoreszenzanalyse mit Synchrotronstrahlung (SRXRF) wurden genutzt, um verschiedene biologische Systeme hinsichtlich ihrer Aufnahme, Verteilung und Abgabe von Gd-basierten Kontrastmitteln zu untersuchen. Zuvor wurden beide Methoden für diese Anwendung analytisch charakterisiert und verglichen. Die Nachweisgrenzen von Gadolinium wurden mittels LA-ICP-MS (0.78 pg) und SRXRF (89 pg) unter jeweils optimierten Bedingungen durch die Kalibrierung über Rückstände eingetrockneter Elementstandardtropfen bestimmt. Anhand von Fadenalgen konnte die Aufnahme und Abgabe der Gd-basierten Kontrastmittel gezeigt werden. Die Abhängigkeit von der Konzentration des Kontrastmittels in der Expositionslösung und die Unabhängigkeit der zeitlichen Aufnahme innerhalb eines Zeitraums von 1-7 Tagen wurden an Wasserlinsen studiert. Gadolinium konnte in einem Kresseblatt quantifiziert werden. Die Verifizierung der LA-ICP-MS-Ergebnisse erfolgte mit der SRXRF und der ICP-MS nach Aufschluss. Auch die Aufnahme und Abgabe von Gd in Wasserflöhen wurde beobachtet. Die Lokalisierung des Gds wurde mittels 3D µ-Computertomographie durch den Vergleich mit einem unbelasteten Wasserfloh aufgeklärt. In allen Untersuchungen wurde Gadolinium in den exponierten Modellorganismen nachgewiesen, woraus geschlussfolgert werden kann, dass die Kontrastmittel aus der Umgebung aufgenommen werden. / Gadolinium based contrast agents are used for magnetic resonance imaging. After their excretion by medicated patients they reach surface water passing waste water treat-ment plants where they are not removed sufficiently. The behavior of the contrast agents in the environment and the interaction with organisms was investigated in this work due to the toxicity of the free Gd3+ ion and the associated risks, such as accumulation in the human food chain. In this work, the two elemental analytical imaging methods laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) and synchrotron radiation X-ray fluorescence analysis (SRXRF) have been used to investigate the uptake, distribution, and excretion of Gd-based contrast agents by various biological systems. Both methods were analytically characterized and compared for this application. The detection limits of gadolinium were determined under optimized conditions by LA-ICP-MS and SRXRF. With calibration by remains of dried elemental standard droplets detection limits of 0.78 pg absolute amount of gadolinium (LA-ICP-MS), respectively 89 pg (SRXRF) were reached. Based on filamentous algae as water plants the uptake and the excretion of Gd-based contrast agents were revealed. The dependence on concentration of the contrast agent in the exposition solution and the independence of temporal uptake within one to seven days were studied for duckweed. By LA-ICP-MS gadolinium was quantified in a leaf of cress plant. The verification of the results was performed by SRXRF and ICP-MS after digestion. Furthermore, the uptake and distribution of Gd-based contrast agents in higher organisms (water flea) were observed. The exact location of gadolinium was resolved by three-dimensional μ-computed tomography by the comparison of an exposed with a Gd-free water flea. In all studies, gadolinium was detected in the investigated exposed model organisms. It can be concluded that the contrast agents were taken from the environment.

Die Detektion von Nukleinsäuren ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Erkennung von viralen und bakteriellen Spezies in biologischen Proben. Oligonukleotid-vermittelte Reaktionen (OVR), die die Zielsequenz als Katalysator der chemischen Reaktion zwischen reaktiven Sonden verwenden, bieten gegenüber den enzymatischen Methoden viele Vorteile, wie z.B. Simplizität und Kosteneffizienz. Normalerweise besitzt das Produkt der OVR deutliche fluoreszierende Eigenschaften, die durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen werden können. Die Haupteinschränkung solcher Systeme ist die nur moderate Helligkeit von organischen Farbstoffen, die meistens zur Markierung von reaktiven Sonden genutzt werden. Um dieses Problem zu lösen, sind Fluorophore mit höherer Helligkeit erforderlich. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Detektion von RNA durch Templat-vermittelten Transfer des Fluorophors auf den Quantum Dot (QD). Das System besteht aus zwei reaktiven Peptide Nucleic Acid (PNA)-basierten Antisense-Sonden. Die Label Akzeptor PNA (LAPNA) Sonde ist auf dem QD immobilisiert und enthält eine Cysteineinheit am N-terminus. Die Label Donor PNA (LDPNA) Sonde trägt eine Cy5-Einheit, die als Thioester gebunden ist. Durch die benachbarte Hybridisierung der Sonden am RNA-Templat nimmt die effektive Molarität der reaktiven Gruppen zu, und führt somit durch das Prinzip von Native Chemical Ligation zum Transfer des Cy5 auf den QD. Dies resultiert in Förster−Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen dem QD und den Cy5-Molekülen, der durch die Löschung der Emission des QDs sowie die Verstärkung der Fluoreszenz des Cy5 beobachtet werden kann. Die Verwendung von sehr hellen QDs als FRET-Donor ermöglicht die Umsetzung von Sonden bei geringen Konzentrationen und ermöglicht die Erkennung von RNA mit Nachweisgrenzen im Bereich von weniger pikomolar. / Detection of nucleic acids is one of the most reliable methods for the identification of bacterial and viral species in biological samples. Oligonucleotide-templated reactions (OTRs) that exploit an RNA or DNA target to catalyze a chemical reaction hold great promise for the development of enzyme-free and low-cost detection schemes. Commonly, these strategies rely on organic dyes and are designed so that the product of OTR exhibits distinct fluorogenic properties. The main constraint of such schemes is the moderate brightness of organic fluorophores, which limits the read-out when the probes are used at low concentrations. To tackle this obstacle, significantly brighter fluorophores are needed. This work describes the development of an RNA detection scheme that relies on target-templated fluorophore transfer onto a semiconductor quantum dot (QD). The approach uses two reactive peptide nucleic acid (PNA) antisense probes. Label acceptor peptide nucleic acid (LAPNA) probe is immobilized on a QD and bears a cysteine at the N-terminus; label donor peptide nucleic acid (LDPNA) probe is equipped with a Cy5 dye, attached as a thioester. The adjacent annealing of these recognition elements following binding to target RNA triggers the transfer of Cy5 onto a QD in a native chemical ligation manner. This leads to a detectable fluorescence signal brought about by FRET from QD to the Cy5. The use of unprecedentedly bright QDs that can act as FRET donors for several Cy5 functionalities allows application of probes at very low concentrations (pM range) and achieves enhanced sensitivity of target-templated RNA detection. The method enabled RNA detection in the low pM range using a conventional microtiter plate reader.

Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders. In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed. The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.