In dieser Arbeit wurden die von Seitz et al. entwickelten forced intercalation (FIT)-Sonden zur mRNA-Charakterisierung in lebenden Zellen eingesetzt. Es erfolgte die Synthese verbesserter FIT-Sonden für die systematische Untersuchung der Aufnahme durch lebende Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen. Dafür wurden sowohl hergestellte FIT-Sonden-Konjugate/Aggregate als auch kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. die Palmitinsäure und das porenbildende Enzym Streptolysin-O auf ihre Effizienz untersucht. Die optimalen Bedingungen für das Einbringen von DNA- und PNA-FIT-Sonden in Flp-In™ 293 T-REx™-Zellen lieferte das Enzym Streptolysin-O. Durch den simultanen Einsatz von drei unterschiedlichen Sonden (BO-, TO- und CB-markiert), komplementär zu drei verschiedenen Zielsequenzen, gelang es erstmals eine Dreifarben-Lebendzell-Bildgebung mit FIT-Sonden durchzuführen. Des Weiteren wurden TO-FIT-Sonden zur Unterscheidung verschiedener T-Zelllinien eingesetzt. Mithilfe eines kompetitiven Hybridisierungsexperiments konnte die spezifische Fluoreszenzemission der Sonden in den Zellen belegt werden. Untersuchungen mit zwei T-Zelllinien zeigten, dass TO-FIT-Sonden sowie terminal Cy7-markierte TO-FIT-Sonden eine erhöhte TO-Emission bei Vorhandensein der komplementären TCR-mRNA-Zielsequenz in den Zellen aufwiesen. Der terminale Cy7-Farbstoff bot mit einem zweiten Detektionskanal die Möglichkeit die Cy7-Intensität und die vorhandene TO-Intensität ins Verhältnis zu setzen, sodass Signale von ungebundener Sonde leichter ausgeschlossen werden konnten. Dies ermöglichte eine spezifische Markierung der T-Zellen. Es folgte die Synthese CB-markierter FIT-Sonden zur Aufklärung biologischer Fragestellungen, wie dem Verlauf einer Influenza A Infektion und die Synthese und Evaluation neuer Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum bei 590/596 nm. Zudem wurde der Einbau eines zyklischen PNA- Monomers bezüglich der Verbesserung von Responsivität und Helligkeit von PNA-FIT-Sonden analysiert. / In this work forced Intercalation (FIT) probes, developed by Seitz et al. were used for the mRNA characterization in living cells. The synthesis of improved FIT probes as well as the systematic study on the uptake of FIT probes by living Flp-In™ 293 T-REx™ cells was performed. Therefore FIT probe conjugates/aggregates as well as commercially available reagents, e.g. palmitic acid and the pore-forming enzyme Streptolysin-O were investigated under various conditions. Furthermore, the transfection was tested using an electroporator. The optimal transfection condition for the introduction of DNA and PNA FIT probes into Flp-In™ 293 T-REx™ cells was achieved using Streptolysin-O. Multicolor live cell imaging with the simultaneous use of three different FIT probes (BO, TO and QB) against three different target sequences was performed successfully. In addition, FIT probes were used for the differentiation between T cell lines. A competitive hybridization experiment with cells confirmed the specific fluorescence emission of the probes. Further studies with two cell lines and TO-FIT probes as well as terminal Cy7-labeled TO-FIT probes showed an increased TO emission in the presence of the complementary TCR mRNA target sequence in the cells. A second detection channel of the terminal Cy7 dye provided the advantage of comparing the Cy7- and TO-intensity ratio, thereby making it easier to exclude signals from unbound probe. This enabled the specific tagging of t cells. This was followed by the synthesis of QB-DNA-based FIT probes for the use in various biological applications e.g. as a pan selective marker for Influenza A infection. Moreover, the synthesis and evaluation of new dyes with an absorption maximum at 590/596 nm was performed. The incorporation of a cyclic PNA monomer next to the TO dye has also been realized to improve responsiveness and brightness in PNA-FIT probes.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Verwendung von Präkursor microRNA-21(pre-miR21)-spezifischen Peptidnukleinsäure(PNA)-Sonden zur Inhibierung der Dicer-vermittelnden miRNA-Reifung untersucht. Im Gegensatz zur Arbeitshypothese wurde bei der Behandlung von Zellen mit den pre-miR21-spezifischen PNA-Sonden jedoch keine Änderung des miR-21 Niveau beobachtet. Um die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz nachzuweisen, wurden fluorogene Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (FIT-Sonden), unter Verwendung des Interkalationsfarbstoffes Thiazolorange (TO), entwickelt. Wie vorläufige Ergebnisse zeigen, könnte die TO-PNA Sonde für die Unterscheidung von Zellen mit hohem miR-21-Gehalt nützlich sein, aber eine weitere Verbesserung der Sonde ist noch erforderlich. Im nächsten Teil der Arbeit wurden neuartige FIT-Sonden für die Analyse der Dicer-vermittelnden miR-21-Reifung entwickelt. Um die gleichzeitige Detektion der entstehenden pre-miR21 und der antisense miR-21 (as-miR21) in Echtzeit zu ermöglichen, wurden die Verwendung von spektral unterscheidbaren FIT-Sonden auf Quinolinblau(QB)-und TO-Basis getestet. Das entwickelte Sonden-Paar ermöglichte die Analyse der rhDicer-Reaktion. Dabei wurde entdeckt, dass die rhDicer-Reaktion an der in vitro transkribierten pre-miR21 unspezifisch spaltet. Zusätzlich wies die kürze as-miR21 spezifische TO-Sonde (7nt) eine Sensitivität gegenüber der Anwesenheit des Ago-2 Proteins auf. In der Zukunft könnten die entwickelten Sonden für schnelle in vitro Screenings neuer Dicer-und Ago-2-Inhibitoren angewendet werden. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren (small molecular inhibitors, SMIs) getestet. Zusammenfassend könnten die zwei identifizierten SMIs für die Inhibierung der miR-122-Reifung genutzt werden, allerdings bleibt die Spezifität der SMIs fraglich und mögliche off-target-Effekte können nicht ausgeschlossen werden. / MicroRNAs (miRNAs) represent small non-coding RNA molecules that mostly negatively regulate gene expression. To yield mature miRNAs, primary miRNA precursors go through two consequent cleavages by Drosha and Dicer RNAse. This work describes the development of tools for inhibition und monitoring the dicer-mediated miRNA processing. Here, peptide nucleic acid (PNA) based probes, targeting the precursor miR-21 (pre-miR21), were designed for inhibition the dicer-mediated miR-21 maturation. In contrast, no change in miR-21 level was observed after cell treatment with the pre-miR21 specific PNA probes. To detect the probe/target hybridization state, the fluorogenic forced intercalation (FIT) PNA probes, bearing thiazole orange dye (TO), were developed. As preliminary results show, the FIT PNA probe might be useful for discrimination of high miR-21 abundant cells, but further probe improvement is still required. To monitor the pre-miR21 cleavage, the combination of the two spectrally distinguishable FIT PNA probes, bearing quinoline blue (QB) and TO fluorophore, was developed to allow the rapid and simultaneous detection of pre-miR21 and antisense mature miR-21 (as-miR21). The probe set was successfully used for detection of the modelled dicer reaction. However, the monitoring of rhDicer reaction have revealed that rhDicer cleaves the in vitro transcribed pre-miR21 nonspecifically. Additionally, the short as-miR21 specific TO PNA probe (7nt) was responsive to the presence of Ago-2 protein. In future, the developed probes can be applied for the fast in vitro screening of new Dicer and Ago-2 inhibitors. In the second part of this work, an alternative approach, small molecular inhibitors (SMIs), was tested. Two identified pre-miR122-targeting SMIs might be used for inhibition of the miR-122 maturation, although, a specificity of these SMIs remains questionable and possible off target effects cannot be excluded.