Die Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) ist ein Schlüsselenzym des reduktiven Acetyl-CoA Wegs, und katalysiert in diesem die Reduktion von CO2 zu CO mit Raten von bis zu 12 s 1. Die Rückreaktion, die Oxidation von CO, katalysiert die CODH mit Raten von bis zu 31000 s-1. Beide Reaktionen finden am aktiven Zentrum des Enzyms, einem [NiFe4S4OHx]-Cluster (C Cluster), statt. Das Genom des hydrogenogenen Bakteriums C. hydrogenoformans beinhaltet fünf putative CODHs, welche vermutlich unterschiedliche Funktionen im Organismus ausüben. Diese Arbeit charakterisiert CODH-II und CODH-IV strukturell und biochemisch. In CODH-II wurden dafür Seitenketten der 1. und 2. Koordinationssphäre des C-Clusters ausgetauscht und einer strukturellen und kinetischen Analyse unterzogen. Der zweite Teil der Arbeit analysiert den Einfluss von O2 auf CODH-II und CODH-IV. In Lösung zeigte CODH-II bei Inkubation mit O2 einen Verlust der CO-Oxidationsaktivität. Analog dazu konnte in CODH-II Kristallen die Zerstörung des C Clusters durch O2 verfolgt werden. Elektrochemisch wurde das Verhalten der CODH-II in der Gegenwart von O2 mit der CODH-IV, für welche eine Rolle in der oxidativen Stressantwort von C. hydrogenoformans diskutiert wird, verglichen. CODH-IV ist sauerstofftoleranter als CODH-II und katalysiert die Oxidation von CO hocheffizient nahe des CO-Diffussionslimits. Die Aufklärung der Struktur von CODH-IV erlaubte die Identifikation einer möglichen Ursache der höheren O2-Toleranz. Die Strukturen beider CODHs ähneln sich stark. Allerdings weist CODH IV an der Rückseite des C-Clusters eine dichtere Packung der Seitenketten auf, wodurch der Cluster von einem Angriff durch O2 abgeschirmt werden könnte. / CO-Dehydrogenase (CODH) is a key enzyme of the reductive acetyl-CoA pathway, in which it catalyses the reduction of CO2 to CO with rates up to 12 s-1. CODH catalyses the reverse reaction, the oxidation of CO with rates up to 31000 s-1. Both reactions take place at the active site of the enzyme, a [NiFe4S4OHx] cluster (cluster C). The genome of the hydrogenogenic bacterium C. hydrogenoformans contains five putative CODHs which might serve distinctive functions within the organism. This study characterises CODH-II and CODH-IV structurally and biochemically. Residues of the first and second coordination sphere of cluster C from CODH-II were exchanged and analysed concerning their structural and biochemical properties. The second part of this study analyses the influence of O2 on CODH-II and CODH-IV. CODH-II showed in solution a loss in CO-oxidation activity upon incubation with O2. In an analogous experiment, the destruction of cluster C by O2 was followed crystallographically. A role for CODH-IV in the oxidative stress response of C. hydrogenoformans has been discussed previously. Therefore, the behaviour of CODH-II and CODH-IV was analysed electrochemically in the presence of O2. CODH IV is more O2-tolerant than CODH-II and catalyses the oxidation of CO with high efficiency close to the diffusion limit of CO. Reasons for the enhanced O2-tolerance of CODH-IV could be deduced by elucidating its structure. Generally, both CODHs show high structural similarity. However, at the backside of cluster C CODH-IV shows a tighter packing of residues by which the cluster C might be shielded from O2.

In der vorliegenden Arbeit wurde der ATP-gekoppelte uphill Elektronentransfer von reduziertem RACo auf Kobalt(II)-CoFeSP untersucht. Dazu wurden zunächst die Bedingungen der rekombinanten Genexpression in Escherichia coli und die Reinigungsstrategie der Proteine verbessert, um einen Cofaktorgehalt beider Proteine von annähernd 100 % zu erreichen. Anschließend wurden die Reaktionsbedingungen des Elektronentransfers optimiert, um eine tiefergehende Analyse zu ermöglichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass durch die Bindung von ATP ein bidirektionaler Elektronentransfer induziert wird. Der Elektronentransfer konnte mit nicht-hydrolysierbaren ATP-Analoga und mit ADP induziert werden. Weder für die nicht-hydrolysierbaren ATP-Analoga noch für ADP konnten anschließend Hydrolyseprodukte nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte für die limitierende Rate der ATP-Hydrolyse ein mehr als 100-fach kleinerer Wert bestimmt werden als für den Elektronentransfer. Beide Ergebnisse zeigen, dass der Elektronentransfer unabhängig von der ATP-Hydrolyse ist. Kobalt(I)-CoFeSP kann jedoch auch ein Elektron auf oxidiertes RACo übertragen, was auf einen bidirektionalen Elektronentransfer hindeutet. Diese These wurde mit der Beobachtung untermauert, dass sich durch Zugabe von ADP und der Erhöhung der ADP-Konzentration die Anzahl der transferierten Elektronen pro CoFeSP zunimmt und sich somit die Lage des entstehenden Gleichgewichts verschieben lässt. Auf dieser Datengrundlage konnten drei mögliche Modelle für den Reaktionsmechanismus erstellt werden, von welchen ein Modell als am wahrscheinlichsten erscheint. In diesem Reaktionsmechanismus gleichen sich die Redox-Potentiale beider Redox-Zentren durch die ATP-Bindung an. Dies ermöglicht den Elektronentransfer vom [2Fe2S]-Cluster von RACo auf das Kobalt-Ion des Cobalamins. Die Rückreaktion wird durch eine erneute Reduktion des [2Fe2S]-Clusters verhindert und durch die anschließende ATP-Hydrolyse dissoziiert der Komplex. / In the present work, ATP-coupled uphill electron transfer from reduced RACo to cobalt(II)-CoFeSP was investigated. For this purpose, the conditions of recombinant gene expression in Escherichia coli and the purification strategy of the proteins were improved to achieve a cofactor content of both proteins close to 100%. Subsequently, the electron transfer reaction conditions were optimized to enable a more in-depth analysis. The results of this work indicate that a bidirectional electron transfer is induced by the binding of ATP. Electron transfer could be induced with non-hydrolysable ATP analogues and with ADP. Neither for the nonhydrolyzable ATP analogues nor for ADP hydrolysis products could subsequently be detected. In addition, a value more than 100-fold smaller could be determined for the limiting rate of ATP hydrolysis than for electron transfer. Both results indicate that electron transfer is independent of ATP hydrolysis. However, cobalt(I)-CoFeSP can also transfer an electron to oxidized RACo, suggesting bidirectional electron transfer. This hypothesis was supported with the observation that adding ADP and increasing the ADP concentration increases the number of transferred electrons per CoFeSP by shifting the position of the emerging equilibrium. Based on these data, three possible models for the reaction mechanism are suggested, of which one model appears to be the most plausible. In this reaction mechanism, the redox potentials of both redox centers equalize due to ATP binding. This allows electron transfer from the [2Fe2S] cluster of RACo to the cobalt ion of cobalamin. The back reaction is prevented by a further reduction of the [2Fe2S] cluster, and subsequent ATP hydrolysis dissociates the complex

Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.

Tfap2a gehört zur Familie der AP-2-Transkriptionsfaktoren. Heterozygote Mutationen von TFAP2A im Menschen führen zum Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom (BOFS) und sind mit Nierenanomalien assoziiert. Molekulare Mechanismen, die zu diesen BOFS-assoziierten Nierenanomalien führen, sind noch unbekannt. In diesem Projekt wurde die Expression von Mitgliedern der AP-2-Familie in neugeborenen und erwachsenen Wildtyp-Mäusen analysiert. Tfap2a wurde in der Ureterknospe und der distalen Region des S-förmigen Körpers in den Nieren neugeborener Mäuse exprimiert. Die Expression blieb in ausgereiften distalen Tubuli und Sammelrohren erhalten. Tfap2b, ein zweites Mitglied der AP-2-Familie, das in der Niere exprimiert wird und mit Zystenbildung assoziiert ist, wurde im aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife sowie in den distalen Tubuli und dem in der Nierenrinde liegenden Sammelrohr exprimiert. Um die Rolle von Tfap2a in der Niere zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer sammelrohrspezifischen Deletion von Tfap2a (Tfap2a-KO) erzeugt. Phänotypische und morphologische Analysen ergaben, dass Tfap2a-KO-Mäuse mäßig reduzierte Nierengewichte und eine fortschreitende Dilatation der äußeren medullären Sammelrohre aufwiesen. Einzelkern- und RNA-Sequenzierung der Nieren adulter Mäuse zeigte eine deregulierte Expression von Genen, die mit der Organisation von Aktinfilamenten, Zelladhäsion, Wnt-Signalen und anderen Signalwegen der Nierenentwicklung in Verbindung stehen. In einem isolierten Modell von kultivierten Sammelrohrzellen mit einer Deletion von Tfap2a waren ähnliche Signalwege dereguliert. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass Tfap2a für die Differenzierung des Sammelrohrepithels und die Regulierung des Durchmessers des Tubuluslumens erforderlich ist. Dies ermöglicht Einblicke in die molekularen Grundlagen der beim BOFS beobachteten Nierenfehlbildungen. / The transcriptional regulator Tfap2a is part of the AP-2 transcription factor family. Heterozygous mutations of TFAP2A in humans lead to branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) and are associated with renal anomalies. Molecular mechanisms leading to BOFS-associated renal anomalies are still unknown. In this project, expression patterns of AP-2 family members were analyzed in newborn and adult wildtype mice. Tfap2a was expressed in the ureteric bud and distal region of the S-shaped body in kidneys of newborn mice. Expression was maintained in mature distal tubules and collecting ducts. Tfap2b, a second AP-2 family member expressed in the kidney and associated with cyst formation, was found in the ascending limb and showed overlapping expression with Tfap2a in distal tubules and the cortical collecting duct. To investigate the role of Tfap2a in the kidney, mice with a collecting duct-specific deletion of Tfap2a (Tfap2a-KO) were generated by crossing mice carrying a Cre-recombinase under the Hoxb7 promotor and mice with floxed Tfap2a alleles. Phenotypic and morphological analyses revealed that Tfap2a-KO mice displayed moderately reduced kidney weights and a progressive dilation of outer medullary collecting ducts. Single-nucleus and bulk RNA sequencing of kidneys of three months old Tfap2a-KO mice and littermate controls indicated deregulated expression of genes associated with actin filament organization, cell adhesion, Wnt signaling, and other kidney developmental pathways. Genes deregulated in Tfap2a-deficient mice included several genes previously implicated in the development of congenital anomalies of the kidney and urinary tract. In an isolated model of cultured collecting duct cells carrying a Tfap2a knockout similar pathways were deregulated. Taking together, this study indicates that Tfap2a is required for collecting duct epithelium differentiation and tubular lumen diameter regulation, providing insights into the molecular basis of renal defects observed in BOFS.

Der Komplex aus Kohlenmonoxid-Dehydrogenase und Acetyl-CoA-Synthase (CODH/ACS Komplex) des thermophilen Bakteriums Carboxydothermus hydrogenoformans katalysiert die Fixierung von CO2 in Acetyl-CoA und ist damit ein potenzieller Katalysator für die Erzeugung erneuerbarer Kraftstoffe aus CO2. Die Katalyse erfolgt an zwei verschiedenen Stellen: CO2 wird am Cluster C in der CODH-Untereinheit zu CO reduziert, das dann durch einen Tunnel innerhalb des Proteins zum Cluster A in der ACS-Untereinheit wandert, wo es mit einer Methylgruppe und CoA zu Acetyl-CoA reagiert. Die Art und Weise, wie die beiden katalytischen Aktivitäten zusammenwirken, sind noch unklar. Um hier mehr Licht ins Dunkel zu bringen, verfolgte diese Arbeit drei Ziele: die Bestimmung der Struktur des CODH/ACS-Komplexes von C. hydrogenoformans, die Untersuchung der CO2-Reduktionsaktivität von CODHasen und die Analyse der Rolle des internen Tunnels im CODH/ACS-Komplex. Die Struktur des CODH/ACS-Komplexes von C. hydrogenoformans wurde durch Röntgenkristallographie mit einer Auflösung von 2,04 Å bestimmt. Die CO2-Reduktion am Cluster C wurde kinetisch untersucht. Es zeigte sich, dass die CO2-Reduktion durch einen Ping-Pong-Mechanismus mit zwei Reaktionsstellen erfolgen könnte, der in früheren Studien vorgeschlagen wurde, aber auch durch andere Mechanismen. Um eine Struktur-Funktionsbeziehung für CODHs zu ermitteln, wurde die CO2-Reduktionsaktivität für drei CODHasen von C. hydrogenoformans untersucht, deren Strukturen bekannt sind: CODH-II, CODH-IV, und der CODH/ACS-Komplex. Das Tunnelsystem im CODH/ACS-Komplex ist viel enger als in den anderen CODHs und könnte somit der Grund für die vergleichsweise geringe Aktivität des CODH/ACS-Komplexes sein. Dies wurde auch durch die Manipulation und Analyse des internen Tunnels des CODH/ACS-Komplexes unterstützt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Hauptzweck des Tunnels im CODH/ACS-Komplex die Kompartimentierung von CO und nicht der schnelle Substrattransport ist. / The complex of carbon monoxide dehydrogenase and acetyl-CoA synthase (CODH/ACS complex) of the thermophilic bacterium Carboxydothermus hydrogenoformans catalyses the fixation of CO2 into acetyl-CoA and is thus a potential catalyst for the production of renewable fuels from CO2. Catalysis occurs at two different sites: CO2 is reduced to CO at cluster C in the CODH subunit, which then travels through a tunnel within the protein to cluster A in the ACS subunit, where it reacts with a methyl group and CoA to form acetyl-CoA. The way in which the two catalytic activities interact is still unclear. To shed more light on this, this work pursued three goals: to determine the structure of the CODH/ACS complex of C. hydrogenoformans, to investigate the CO2 reduction activity of CODHases and to analyse the role of the internal tunnel in the CODH/ACS complex. The structure of the CODH/ACS complex of C. hydrogenoformans was determined by X-ray crystallography at 2.04 Å resolution. The CO2 reduction at cluster C was investigated kinetically. It was found that CO2 reduction could occur by a two-site ping-pong mechanism proposed in previous studies, but also by other mechanisms. To establish a structure-function relationship for CODHs, CO2 reduction activity was investigated for three CODHases of C. hydrogenoformans whose structures are known: CODH-II, CODH-IV, and the CODH/ACS complex. The tunnel system in the CODH/ACS complex is much narrower than in the other CODHs and could thus be the reason for the comparatively low activity of the CODH/ACS complex. This was also supported by the manipulation and analysis of the internal tunnel of the CODH/ACS complex. The results suggest that the main purpose of the tunnel in the CODH/ACS complex is to compartmentalise CO and not to rapidly transport substrate.

Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. / Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.

In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um selektive Kinaseinhibitoren für verschiedene Ziele zu entwickeln. Ein chemisch-genetisches Verfahren, das als "analog-sensitiv" bezeichnet wird, wurde eingesetzt, um isozymselektive Inhibitoren zu erzeugen, die auf die Gatekeeper-Mutante der IP6Ks abzielen. Diese Kinasen sind für die Synthese von PP-InsPs verantwortlich, dicht geladenen und allgegenwärtigen sekundären Botenstoffen mit einer Vielzahl von Funktionen. Ein Hochdurchsatz-Screening lieferte die vielversprechende Leitverbindung FMP-201300, die wünschenswerte Eigenschaften und ein günstiges Inhibitionsprofil aufwies. Interessanterweise ergaben kinetische Messungen einen allosterischen Wirkmechanismus, während HDX-MS-Analysen auf eine Bindung von FMP-201300 in der Nähe der ATP-Stelle hindeuteten, was möglicherweise die durch die Gatekeeper-Mutation bewirkte Steigerung der Wirksamkeit erklärt. Parallel dazu wurde Photopharmakologie eingesetzt, um die Aktivität von TgCDPK1 mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision reversibel zu steuern. Bekannte Inhibitoren wurden in Arylazopyrazole mit guten photochemischen und photophysikalischen Eigenschaften umgewandelt. Während die Optimierung der photostationären Verteilungen eine Herausforderung blieb, ermöglichten die ausgezeichneten bioaktiven Unterschiede zwischen den beiden isomeren Formen die reversible Kontrolle der Kinaseaktivität in situ durch abwechselnde Bestrahlung mit Licht verschiedener Wellenlängen. Obwohl diese photoschaltbaren Inhibitoren auch auf CDPK1-Orthologe anderer Parasiten abzielten, führte eine sequentielle Erhöhung der Gatekeeper-Größe zu einem deutlichen Rückgang der Wirksamkeit. Wichtig ist, dass das Wachstum von T. gondii in vivo gehemmt werden konnte, mit reduzierter Wirksamkeit nach UV-Bestrahlung. / The development of potent and highly selective kinase inhibitors is a long-standing pursuit in pharmacological research. These efforts continue to provide invaluable tools to decipher the intricate cellular functions of these ubiquitous enzymes. Kinases are involved in a cornucopia of signaling events, many of which are related to widespread diseases such as diabetes and cancer. In this work, different approaches were taken to obtain selective kinase inhibitors for diverse targets. A chemical genetics method termed ‘analog-sensitive’ was employed to generate isozyme-selective inhibitors targeting the gatekeeper mutant of mammalian IP6Ks. These kinases are responsible for the synthesis of PP-InsPs, densely-charged and highly pervasive second messengers with a multitude of functions. High-throughput screening yielded the promising lead compound FMP-201300, which exhibited desirable properties and a favorable inhibitory profile. Intriguingly, kinetic measurements revealed an allosteric mode of action, while HDX-MS analysis suggested a binding of FMP-201300 adjacent to the ATP-site, potentially explaining its increase in potency conferred by the gatekeeper mutation. In a parallel effort, photopharmacology was used to reversibly control the activity of TgCDPK1 with high temporal and spatial precision. Known inhibitors were converted into arylazopyrazoles with good photochemical and photophysical properties. While the optimization of the photostationary distributions remained a challenge, excellent bioactive discrepancies between the two isomeric forms enabled the reversible control over kinase activity in situ by alternating irradiation with light of different wavelengths. Although these photoswitchable inhibitors also targeted CDPK1 orthologs from other parasites, sequential increase of the gatekeeper size led to a significant decline in potency. Importantly, the growth of T. gondii could be inhibited in vivo with reduced potency after UV irradiation.

Diese Arbeit hatte es zum Ziel, eine neue und effiziente Affinitätsplattform für die Aufreinigung und Isolierung von Proteinen basierend auf nicht‐porösen und stabilen Korund‐Partikeln zu entwickeln. Das Rohmaterial wurde kovalent mit Proteinbindern modifiziert, um so die Isolierung spezieller Target‐Proteine aus komplexen biologischen Proben zu realisieren. Für die erste Modifizierungsschicht auf der Korundoberfläche wurden verschiedene Phosphonsäuren und Silane untersucht. Anschließend wurde der etablierte bifunktionale Crosslinker Glutaraldehyd mit dem biokompatibleren verzweigten Polyglycerol (PG) verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass Polyglycerol eine hervorragende Alternative zu Glutaraldehyd darstellen kann. Für die angestrebte Anwendung als neues Tool für die Antikörperreinigung wurde humanes IgG mit Protein‐A‐funktionalisierten Korundpartikeln erfolgreich aus Humanplasma isoliert. Um das Anwendungsspektrum der neuen Korundmethode auszuweiten, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine Affinitätsplattform für die Isolierung Polyhistidin‐getaggten Proteinen basierend auf Metallionen‐funktionalisiertem Korund entwickelt und angewendet. Hauptkriterien dieser Methodenentwicklung waren die schnelle, effiziente und ökonomische Aufreinigung rekombinanter Proteine aus bakteriellen Lysaten in einem säulenfreien Format. Als Modellsystem wurde Polyhistidin‐getaggtes Protein A/G (His6‐PAG) mit Rinderserumalbumin versetzt, was die Entwicklung eines optimierten Protokolls für die Isolierung rekombinanter Proteine ermöglichte. Im direkten Vergleich mit kommerziellen Ni‐NTA‐Agarose‐Beads zeigten die Korundpartikel höhere Proteinreinheiten. Abschließend konnte gezeigt werden, dass Zink eine ideale Alternative als Metallion darstellt, um etwaige Nachteile des Nickels in der Anwendung von Life‐Science‐Methoden zu umgehen und eine zukunftsträchtige Methode mit weiterem Potenzial zu realisieren. / This work aimed to develop and establish a novel efficient affinity platform for protein purification based on nonporous, stable, and easily available corundum powder. The material was functionalized covalently with protein binders to isolate and enrich specific proteins from complex biological matrices. Phosphonic acids and silanes were tested as the first modification layer. In the next step, the well‐known bifunctional crosslinker glutaraldehyde was compared with a more biocompatible, hyperbranched polyglycerol (PG). It could have been shown that oxidized polyglycerol is an excellent alternative to glutaraldehyde. Human IgG was purified with protein A functionalized corundum from crude human plasma for the initial purpose of antibody isolation. To broaden the application of functionalized corundum, a novel purification platform for the isolation of poly His‐tagged proteins based on metal‐ion‐functionalized corundum was established.The main goal of this approach was the efficient, economical, and fast purification of recombinant proteins in a column‐free format that can also easily be performed in moderately equipped laboratories. As a model system for method optimization, His‐tagged protein A/G (His6‐PAG), mixed with bovine serum albumin (BSA), was established leading to a purification protocol with minimal nonspecific binding by the variation of the imidazole content in the used binding and washing buffers. Corundum in direct comparison with standard Ni‐NTA agarose beads generated higher purities of isolated proteins. Finally, it was shown that zinc‐functionalized corundum is another efficient approach to circumvent potential negative effects of nickel use in life science applications.

Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.

Das zu den Protozoen gehörende Phylum der Apicomplexa umfasst nahezu 6000 Parasitenarten. Die meisten Apicomplexa haben sich an eine obligat intrazelluläre Lebensweise angepasst und infizieren verschiedenste Tiere und den Menschen. Zu den bedeutendsten Vertretern der Apicomplexa zählen Toxoplasma, Plasmodium und Eimeria. In dieser Arbeit lag der Schwerpunkt auf den drei repräsentativen Organismen Toxoplasma gondii, Eimeria falciformis und Plasmodium berghei, welche sich alle in einem etablierten Wirt (der Maus) reproduzieren, sich allerdings hinsichtlich ihrer Wirtszellen, Persistenz sowie in ihrem Reproduktionsverhalten deutlich unterscheiden. Somit ermöglichen die genannten Parasiten eine umfassende Untersuchung der Biologie der Apicomplexa. Die meisten Entwicklungsstufen dieser Pathogene sind sehr eng mit der Wirtszelle assoziiert, was auch metabolische Wechselwirkungen beinhaltet. Das Verständnis dieser Interaktionen ist unerlässlich, um die Evolution von Parasiten zu ergründen. Grundsätzlich war das Ziel dieser Arbeit, die metabolischen Netzwerke der genannten Parasiten zu eruieren und den Einfluss des Metabolismus auf Wachstum, Pathogenese und Adaption in verschiedenen Nährstoffumgebungen zu untersuchen. Unsere Vorgehensweise verband biochemische, revers-genetische, zellbiologische und optogenetische Bottom-Up-Methoden mit Top-Down-Methoden wie Lipidomics, Metabolomics und Transcriptomics um folgende Prämissen anzugehen: • Vergleichender Entwurf der metabolischen Netzwerke in den obengenannten Parasiten • Nährstoff-Plastizität für die Überlebensfähigkeit des Parasiten in verschiedenen Milieus • Umregulierung oder Ausbeutung des Wirtsmetabolismus durch intrazelluläre Parasiten • Stadien-spezifische Regulation des Metabolismus während der asexuellen Reproduktion • Identifizierung und Validierung potentieller anti-parasitischer Wirkstoffe / The protozoan phylum apicomplexa comprises nearly 6000 parasitic species. Most apicomplexans have adapted to obligate intracellular parasitism in a wide range of organisms, including animals and humans. Some notable members of the phylum include Toxoplasma, Plasmodium and Eimeria species. This study focused on three representative parasites, namely Toxoplasma gondii, Eimeria falciformis and Plasmodium berghei, all of which infect a common and well-established model host organism (i.e. mouse), but have diverged from each other considerably with respect to the target host cells, persistence and reproduction behavior. These parasites together therefore enable a fairly inclusive study of the apicomplexan biology. Most developmental stages of these pathogens intimately associate with host cells, involving a metabolic crosstalk between the two entwined entities. A germane understanding of such interactions is vital to appreciate the evolution of parasites. In a nutshell, this work aimed to determine the design of metabolic networks in indicated parasites and the impact of metabolism on growth, pathogenesis and adaptation in discrete nutritional milieus. Our approach blended bottom-up methods of biochemistry, reverse genetics, cell biology and optogenetics with the top-down lipidomics, metabolomics and transcriptomics to address the following major premises: • Comparative design of the selected metabolic networks in aforementioned parasites • Nutritional plasticity underlying the parasite survival in variable environments • Subversion or exploitation of host metabolism by intracellular parasites • Stage-specific rewiring of parasite metabolism during asexual reproduction • Identification and endorsement of potential anti-parasitic drug targets