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Biochemical and structural characterization of the ATP-dependent maturation factor of acetyl-CoA synthase

Gregg, Christina Maria 21 March 2018 (has links)
Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.
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Mechanistic insights into carbon monoxide and CoA binding at the Ni,Ni-[4Fe-4S] active site of the acetyl-CoA synthase from Carboxydothermus hydrogenoformans

Kreibich, Julian 23 August 2021 (has links)
Die Acetyl-CoA Synthase (ACS) beinhaltet ein einzigartiges Metallcluster (Cluster A) in seinem aktiven Zentrum, welches wichtig für ein autotrophes Wachstum von Bakterien und Archaeen ist, die den reduktiven Acetyl-CoA-Weg nutzen. Der letzte Schritt dieses Syntheseweges wird von der ACS am proximal zum [4Fe-4S] Cluster liegenden Ni ion katalysiert (Nip). In meiner Arbeit wurde die ACS von Carboxydothermus hydrogenoformans (ACSCh) auf seine Ligandenbindung untersucht und in verschiedenen Konformationen kristallisiert. Zuerst wurde die ACSCh in einer neuen Konformation (ACSCh-closed) kristallisiert und deren Struktur mit einer Auflösung von 2.1 Å bestimmt. Diese wies einen geringeren Kontakt zur Solventumgebung auf als die vorher bekannte Struktur der ACSCh (ACSCh-open, PDB-ID: 1RU3). Das Cluster A der ACSCh-closed unterscheidet sich von der ACSCh-open in der Koordination des Nip, welches verzerrt tetraedrisch koordiniert in ACSCh-closed vorliegt und quadratisch planar in ACSCh-open. Eine Analyse des Modells wies einen molekularen Tunnel auf, der nur in ACSCh-closed vorhanden ist, welcher als CO-Kanal zur Substratversorgung dienen könnte. Zweitens wurde die Kristallstruktur einer CO gebunden ACSCh-closed mit einer Auflösung von 2.0 Å gelöst. Darin wurde eine Elektronendichte am Nip identifiziert, die als CO überzeugend modelliert werden konnte. CO bindet am ebenfalls verzerrt tetraedrisch koordinierten Nip. Die Konformationsänderung von ACSCh-open zu ACSCh-closed scheint der entscheidende Schritt zu sein, um CO zur Bindungsstelle zu leiten. Die dritte Struktur zeigt eine CoA gebundene ACSCh Struktur mit einer Auflösung von 2.3 Å. CoA bindet am Nip, wobei Nip quadratisch planar koordiniert wird. Die Gegenwart von CoA wurde mit Berechnungen verschiedener Elektronendichte-Karten für CoA validiert. Die Bindung von CO und CoA an ACSCh wurde zudem mittels isothermaler Titrationskalorimetrie weiter charakterisiert. Dabei bindet CoA enthalpisch getrieben mit einem KD von 3.1 µM und CO entropisch getrieben mit einem KD von 9.4 µM an ACSCh. / The acetyl-CoA synthase (ACS) harbors a unique metal cluster (cluster A) in its active site, which is important for bacteria and archaea to survive in autotrophic growth using the reductive acetyl-CoA. The last step of this pathway is catalyzed by ACS at the Nip, the Ni ion proximal to the [4Fe-4S] cluster. In my study, the monomeric ACS of Carboxydothermus hydrogenoformans (ACSCh) was studied in its ligand binding and crystallized in different forms. At first, an ACSCh structure was solved in a new conformation at dmin of 2.1 Å and less solvent exposed (called ACSCh-closed) than the known structure of ACSCh (called ACSCh-open, PDB-ID:1RU3). The cluster A of ACSCh-closed differs to that of ACSCh-open in the coordination of the proximal Ni, which is distorted tetrahedrally coordinated in ACSCh-closed and square planar coordinated in ACSCh-open. Analysis of the model revealed a molecular tunnel that is only present in ACSCh-closed, which might act as CO channel for substrate delivery. Secondly, a CO-bound ACSCh-closed crystal was obtained and solved at a resolution of 2.0 Å. An electron density fitting with a diatomic ligand at the Nip site was clearly identified and modeled as a CO molecule. CO binds at the Nip site completing the tetrahedral coordination geometry of Nip. The conformational switch between open and closed is responsible for CO migration and binding to the catalytic site. A third crystal structure depicts a CoA bound ACSCh structure at 2.3 Å resolution. CoA binds at the Nip which shows a square planar geometry. This was further supported by calculating different electron density maps for CoA. The binding of CO and CoA to ACSCh has been characterized by isothermal calorimetry experiments. While CoA binding is enthalpically driven with a KD of 3.1 µM, CO binds to ACSCh by entropic contribution with a KD of 9.4 µM.
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Investigation of Rhodopsin Guanylyl Cyclase from Catenaria anguillulae with a new combined FTIR and UV-Vis spectrometer

Fischer, Paul 20 May 2022 (has links)
Rhodopsin-Guanylyl-Zyklasen (RGCs) gehören zur Familie der Enzymrhodopsine, welche sich durch eine Lichtregulation ihrer Enzymaktivität durch ein Rhodopsin (Rh) auszeichnen. Das membranständige Rh ist hierbei mit einer Guanylylzyklase (GC) verbunden, welches nach Lichtaktivierung des Rh GTP zu zyklisiertem GMP (cGMP) umsetzt. Der sekundäre Botenstoff cGMP sowie das verwandte cAMP spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen. Die lichtgesteuerte Kontrolle dieser Botenstoffe bietet der Optogenetik somit eine Möglichkeit zur Erforschung ihrer Signalwege und könnte so den Weg zu medizinisch nutzbaren Erkenntnissen weisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine RGC, gefunden im Genom des Pilzes Catenaria anguillulae aus der Abteilung der Blastocladiomycota, spektroskopisch untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein FTIR- und UV-Vis-spektroskopischer Messaufbau entwickelt, der eine parallele Aufzeichnung von UV-Vis- und FTIR-Spektren an derselben Proteinprobe erlaubt. Neben konventionellen Belichtungsmethoden, wurde ein durchstimmbarer Hochleistungspulslaser integriert, welcher den praktisch simultanen Umsatz der Proteinprobe erlaubt. Um auch früheste Prozesse spektroskopisch zu erfassen, wurde zusätzlich ein Hochdruck-Heliumkryostat integriert, der Messungen bis unterhalb des Siedepunkts von Helium ermöglicht (bis ~3 K). Nach der UV-Vis- und FTIR-spektroskopischen Charakterisierung der Photointermediate konnte ein Modell des Photozyklus abgeleitet werden, während Messungen an trunkierten Varianten eine aktive Rolle des N-Terminus in der Enzymregulation aufzeigten. Unter Verwendung eines photolabilen und nichtumsetzbaren GTP-Substrats konnte die Aktivität von RGC und freiem GC in Echtzeit spektroskopisch untersucht werden. Neben der Identifizierung des aktiven Zustands wurde entgegen bisheriger Annahmen gezeigt, dass GTP schon vor Lichtaktivierung an RGC bindet. Die Lichtregulation erfolgt demnach direkt über Modifikationen in der Bindetasche und nicht deren Zugänglichkeit. Ein Aktivierungsmechanismus wurde skizziert, der sowohl die hier vorgelegten Ergebnisse, als auch Ergebnisse vorhergehender Untersuchungen kombiniert. / Rhodopsin guanylyl cyclases (RGCs) belong to the family of enzymerhodopsins, which are characterized by light regulation of their enzyme activity by a rhodopsin (Rh). The embrane-bound Rh is linked to a type III guanylyl cyclase (GC). Upon light activation of Rh, inhibition of GC is abolished and conversion of GTP to cyclic GMP (cGMP) is initiated. The secondary messengers cGMP and the closely related cAMP play important roles in a variety of biological processes. Hence, light-controlled regulation of these messengers provides an opportunity to investigate their signaling pathways using optogenetics and could pave the way for medically useful findings. In this work, a RGC found in the genome of the fungus Catenaria anguillulae from the division of Blastocladiomycota was spectroscopically investigated. For this purpose, an FTIR and UV-Vis spectroscopic measurement setup was developed which supports parallel recording of UV-Vis and FTIR spectra of the same protein sample. In addition to conventional illumination methods, a tunable high-power pulse laser was integrated which allows virtually simultaneous turnover of the protein sample due to its pulse duration in the nanosecond and power in the megawatt range. To investigate the earliest molecular processes a high-pressure helium cryostat was integrated which allows measurements down to below the boiling point of helium (~3 K). Based upon the UV-Vis and FTIR spectroscopic characterization of the photointermediates, a model of the photocycle was derived, while experiments on truncated variants revealed an active role of the N-terminus in enzyme regulation. Using a photolabile and non-convertible GTP substrate, the activity of RGC and free GC could be investigated spectroscopically in real time. In addition to identifying the active state, it was shown, contrary to previous assumptions, that GTP binds to RGC even before light activation. Thus, light regulation occurs directly via modifications in the binding pocket rather than its accessibility. An activation mechanism was outlined that combines both the results presented here and results of previous studies.

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