Im Rahmen der Dichtematrixtheorie wurde die dissipative Exzitonendynamik in photosynthetischen Pigment--Protein-- Komplexen untersucht. Es konnten zwei verschiedene Modelle entwickelt werden. In einem ersten Effektivmoden--Modell wird eine Kopplung der Pigmente an eine effektive Proteinmode pro Pigment behandelt. Die volle Quantendynamik der effektiven Moden findet Ber\"ucksichtigung. Auf diese Weise ist das Modell in der Lage, koh\"arente Kerndynamik und Ged\"achtnisseffek te in der Exziton--Schwingungswechselwirkung zu beschreiben. Diese Effekte treten in einer st\"ohrungstheoretischen Beschreibung in Form von Ged\"achtnisintegralen in den Bewegungsgleichungen f\"ur die dynamischen Variablen auf und werden oft im Rahmen einer {\it Markov} N\"aherung vernachl\"assigt. In einer nichtst\"ohrungstheoretischen Behandlung der Exziton--Schwingungswechselwirkung sind {\it nicht--Markov} Effekte nat\"urlicherweise enthalten. Die restlichen niederfrequenten Schwingungsmoden der Proteine und h\"oherfrequenten intramolekularen Moden der Pigmente werden als W\"armebad behandelt. Die Kopplung der Pigmente und effektiven Proteinmoden an das W\"armebad wird st\"ohrungstheoretisch (in zweiter Ordnung)beschrieben. Diese Wechselwirkung umfa\ss t(i) eine D\"ampfung der Dynamik der effektiven Moden, (ii) die Modulation der {\it Coulomb}--Wechselwirkung zwischen den Pigmenten und (iii) interne Konversion zwischen den h\"oherangeregten $S_n$--Zust\"anden und den ersten angeregten Singlet $S_1$--Zust\"anden der Pigmente. In einem zweiten sogenannten Multimoden--Modell wurde die gesamte Exziton-- Schwingungswechselwirkung st\"ohrungstheoretisch behandelt, und die Standard {\it Redfield}--Theorie fand Anwendung in der Darstellung der Multiexzitoneneigenzust\ "ande. In diesem Modell l\"a\ss t sich Exzitonenrelaxation durch die kopplungsgewichtete Zustandsdichte (sogenannte Spektraldichte) der niederfrequenten Proteinmoden, welche ein W\"armebad bilden, beschreiben. Die Standard {\it Redfield}--Theorie wurde bereits in \cite{Kueh97} auf einen anderen Pigment--Protein Komplex (LH-2) angewendet. Das Neue an dem hiergew\"ahlten Zugang besteht in der Formulierung eines Korrelationsradius der Proteinschwingungen. Dieser gibt an wie die Kopplungen unterschiedlicher Pigmente an ihre lokalen Proteinumgebungen korreliert sind. Die Multiexzitonenspektraldichte der Proteine kann mittels des Korrelationsradius auf molekulare Spektraldichten der lokalen Kopplungen der Pigmente zur\"uckgef\"uhrt werden. Diese wurden f\"ur alle Pigmente als gleich angenommen, und die Theorie wurde so formuliert, da\ss{} Exzitonenrelaxation zu einer Globalanalyse der Spektraldichte der Proteinschwingungen benutzt werden kann. F\"ur die numerische Behandlung konnte eine effiziente Propagationsmethode der Dichte\-matrix entwickelt werden. Diese gestattet eine nichtst\"ohrungstheoretische Behandlung externer Felder und eine Unterscheidung der verschiedenen r\"aumlichen Anteile der lichtinduzierten Polarisationswelle. Dies wurde durch eine Entwicklung der Dichtematrix nach den Tr\"agerwellen der externen Felder erreicht. Die hohe Effizienz dieser Methode beruht auf der Abwesenheit der hochfrequenten Anteile der externen Felder. Lediglich die Einh\"ullenden der Lichtfelder treten in den Bewegungsgleichungen f\"ur die Entwicklungskoeffizienten der Dichtematrix auf. Diese Methode gestattete es bis zu 9 elektronische Zust\"ande gekoppelt an zwei effektive Moden zu ber\"ucksichtigen. Bislang konnten in der Literatur lediglich Modelle mit bis zu 3 elektronischen Zust\"anden und zwei effektiven Moden behandelt werden \cite{Matr95}. Die ultraschnelle Exziton--Schwingungs--Dynamik in einem Chl{\it a/b} Heterodimer des Lichtsammelkomplexes LHC-II gr\"uner Pflanzen wurde im Effektivmoden--Modell untersucht. Aus der Simulation der zweifarbigen Pump--Test--Spektren von \cite{Bitt94} konnten Schlu\ss folgerungen zur Lage der optischen \"Ubergangsdipolmomente des Chl{\it a} und des Chl{\it b} Pigments (welche bei 680 nm und 650 nm absorbieren) getroffen werden. Die Dipole sind eher in {\it in line} als in {\it sandwich} Geometrie angeordnet. Die gemessene Femtosekunden Komponente im Pump--Test--Signal kann auf die, durch die {\it Coulomb}--Wechselwirkung induzierte, Umverteilung der Oszillatorst\"arke innerhalb der Ein-- und Zwei--Exzitonen\"uberg\"ange zur\"uchgef\"uhrt werden. Durch die Einbeziehung h\"oherangeregter Singlet $S_n$--Zust\"ande der Pigmente und interner--Konversionsproz esse zwischen diesen und den $S_1$--Zust\"anden war eine mikroskopische Beschreibung von Exziton--Exziton Annihilation m\"oglich. Im Rahmen dieser Beschreibung konnten die intensit\"atsabh\"angigen zweifarbigen Pump--Test--Spektren von \cite{Bitt94} simuliert werden. Die Simulation ergab eine interne Konversionsrate $1/R^{(\rm IC)}_{S_n\rightarrow S_1}=2.2$ ps und ein Verh\"altnis der Dipolmomente der Pigmente $\mu_{S_1\rightarrow S_n}/\mu_{S_0 \rightarrow S_1}=$1.19. Mit einem einheitlichen Parametersatz konnten neben den zweifarbigen Pump--Test--Spektren auch die 77 K einfarbigen Pump--Test--Spektren von \cite{Viss96}erfolgreich simuliert werden.Wiederum erkl\"art die Umverteilung der Oszillatorst\"arke durch die {\it Coulomb}--Wechselwirkung den Verlauf des gemessenen Signals. Nach etwa 2 ps \"andert dieses sein Vorzeichen. In dieser Zeit findet die Exzitonenrelaxation zwischen dem hochenergetischen und dem niederenergetischen Ein--Exzitonenniveau des Dimers statt und von diesem wird ein Zwei--Exzitonen\"ubergang mit hoher Oszillatorst\"arke m\"oglich.Um den Einflu\ss{} von intramolekularer angeregter Zustandsabsorption zu untersuchen, wurde der h\"oherangeregte $S_n$--Zustand von Chl{\it a} energetisch in Resonanz zum Testpuls gebracht. Eine zus\"atzliche Umverteilung von Oszillatorst\"arke unter den Zwei--Exzitonen\"uberg\"angen wurde gefunden. Der Haupteffekt tritt jedoch schon bei Ber\"ucksichtigung von zwei elektronische Zust\"anden pro Pigment auf. Schlie\ss lich konnte gezeigt werden, da\ss{}, falls die effektiven Moden ebenfalls st\"ohrungstheoretisch (im Rahmen des W\"armebades) behandelt werden, die Berechnung der Pump--Test--Signale signifikant schlechtere \"Ubereinstimmung mit den gemessenen Daten ergibt. Es konnte lediglich \"Ubereinstimmung auf einer Femtosekunden-- oder einer Pikosekundenzeitskala erreicht werden. F\"ur eine konsistente Beschreibung \"uber den gesamten Zeitverlauf hinweg, m\"ussen Ged\"achtniseffekte in der Exziton--Schwingungswechselwirkung Ber\"ucksichtigung finden. Es gilt jedoch zu beachten, da\ss{} die Wechselwirkung des Chl{\it a/b} Dimers mit den restlichen Pigmenten des LHC-II Monomers vernachl\"assigt wurde. Deshalb w\"are es sehr aufschlu\ss reich die im Rahmen des Effektivmoden--Modells erzielten Resultate, mit einem Multimodenzugang unter Ber\"ucksichtigung aller 12 Pigmente des LHC-II Monomers zu vergleichen. Eine Hauptschwierigkeit bei diesem Vorgehen stellt die Unkenntnis der genauen Geometrie der optischen \"Ubergangsdipolmomente der Pigmente im LHC-II dar. Deshalb ist es schwierig die {\it Coulomb}--Wechselwirkung zwischen den Pigmenten abzusch\"atzen. Erste Absch\"atzungen der Dipolgeometrien der Chl{\it a} Pigmente wurden k\"urzlich in \cite{Guel97} ver\"offentlicht. Man k\"onnte diese Absch\"atzungen, mit den hier erzielten Ergebnissen kombinieren. Die Chl{\it b} Dipole m\"u\ss ten demnach so orientiert werden, da\ss{} in den Chl{\it a/b} Dimeren {\it inline} Geometrie vorliegt. Jedoch k\"onnen erste Simulationen im Multimoden-Modell diesen Ansatz bis jetzt nicht best\"atigen. F\"ur den bakteriellen FMO--Komplex erlaubte die Strukturanalyse die Angabe der optischen \"Ubergangsdipolmomente der 7 Bakteriochlorophylle \cite{Tron85,Li97}. Im Standardzugang der Simulation linearer Spektren von FMO-Komplexen wurden die homogenen Linienbreiten der Exzitonen\"uberg\"ange stets vernachl\"assigt \cite{Pear92,Pear93,guelen97,Louw97}. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein mikroskopisches Modell der Exzitonenrelaxation, formuliert im Multimoden--Modell, zur Berechnung realistischer homogener Exzitonen--Linienbreiten benutzt werden. Die verwendete Dichtematrixtheorie erlaubte dar\"uberhinaus auch die Simulation der Temperaturabh\"angigkeit optischer Spektren.So war ein simultaner Fit der linearen Absorption, gemessen in \cite{Frei97}, bei zwei verschiedenen Temperaturen essentiell, um den richtigen mikroskopischen Parametersatz zu finden. Dieser Parametersatz, welcher nachher in der Simulation von nichtlinearen zeitaufgel\"osten Pump--Test--Signalen verifiziert werden konnte, umfa\ss t die lokalen sogenannten {\it site} Energien der 7 BChl Molek\"ule, die globale Form der Spektraldichte der Proteinschwingungen und den Korrelationsradius der Exziton--Schwingungswechselwirkung. F\"ur letzteren wurde der Wert $R_c=21 \AA$ bestimmt, welcher zwischen kleinsten (11\AA) und gr\"o\ss ten (30 \AA) Pigmentabst\"anden im FMO--Monomer liegt. Somit kann die Kopplung der Proteinschwingungen an verschiedene Pigmente als teilkorreliert bezeichnet werden. Die Abh\"angigkeit der Exzitonenrelaxation und der linearen Absorptionsspektren von $R_c$ wurde untersucht. Als genereller Trend zeigte sich, da\ss{} die Exzitonenrelaxation umso schneller verl\"auft, je kleiner der Korrelationsradius ist. Mit demselben Zugang und denselben Parametern konnten in der Folge ultraschnelle zweifarbige Pump--Test--Experimente, durchgef\"uhrt von \cite{Frei97} bei 20 K, erfolgreich simuliert werden. Die gute \"Ubereinstimmung mit den gemessenen Daten bei den verschiedenen Testwellenl\"angen erlaubt es, die St\"arke der intramolekularen angeregten Zustandsabsorption der Pigmente im FMO--Protein abzusch\"atzen. Ein Verh\"altnis $\mu_{S_1\rightarrow S_n}/\mu_{S_0\rightarrow S_1}=0.5$ der optischen \"Ubergangsdipolmomente ergab den besten Fit. Dieser Parameter war der einzigste, der nicht aus den linearen Spektren ermittelt werden konnte, da er lediglich in nichtlinearen optischen Experimenten auftritt. Eine genauere Pr\"ufung der Pump--Test--Simulationen ergibt Abweichungen von den gemessenen Daten f\"ur kleine Verz\"ogerungszeiten ($ / The dissipative dynamics of excitons in photosynthetic pigment--protein--complexes has been investigated in the framework of the density matrix theory. Two different model pigment--protein--complex Hamiltonians could be developed. In a first so called effective mode model the local coupling of the pigments to one effective protein mode per pigment has been considered. The full quantum motion of these effective modes was taken into account. In this way the model is capable to describe coherent nuclear motion and also memory effects in the exciton--vibrational interaction. The latter usually appear in a perturbation theory with respect to the exciton--vibrational interaction as memory integrals in the equation of motion for the dynamic variables. And often, a Markov approximation is applied, i.e. memory effects are neglected. In a non--pertubative treatment of the coupling between excitons and effective protein modes non-Markovian effects are of course included. The remaining low frequency modes of the protein and high frequency intramolecular modes of the pigments were treated as a heat bath. The coupling of pigments and effective protein modes to the heat bath was described in second order perturbation theory. This coupling includes (i) a damping of the motion of the effective modes, (ii) a modulating of the inter pigment {\it Coulomb} interactions, and (iii) internal conversion transitions between the higher excited singlet $S_n$--states and the first excited $S_1$--states of the pigments. The coupling to external light fields as well as the inter--pigment Coulomb interaction are included non--pertubatively. A microscopic description of exciton--exciton annihilation processes could be offered, which together with the non--pertubative inclusion of external fields allows to simulate the intensity dependence of non--linear optical spectra. In a second so called multi--mode model the whole exciton--vibrational interaction was described in second order perturbation theory, and the standard Redfield theory was applied in the representation of multi--exciton eigenstates of the pigment--protein--complex. Exciton relaxation in this model is characterized by the coupling weighted density of states (so called spectral density) of the low frequency protein vibrations, which form a multi--mode heat bath. The standard multi--level Redfield theory has been applied also in \cite{Kueh97} on another pigment--protein complex (LH-2). However, what is new in the present approach is the formulation of a correlation radius of protein vibrations. It enables one to charaterize how the couplings of different pigments with their local protein environments are correlated. The multi--exciton spectral density of the protein vibrations can be discussed in terms of the correlation radius and molecular spectral densities characterizing the local coupling of pigments and proteins. These spectral densities have been taken equal for all pigments, and the theory was formulated in such a way that exciton relaxation could be used for a global shape analysis of the spectral density of protein vibrations. An efficient propagation scheme for the density matrix could be developed. It allows for an exact inclusion of external fields and for a distinction of the different spatial contributions of the light induced polarization wave. An expansion of the density matrix with respect to the carrier waves of the external light fields has been carried out. The high efficiency of this method is due to the absence of the high frequency part of the external fields. Instead only the envelopes of the external fields enter the equation of motion for the expansion coefficients of the reduced density matrix. This efficient propagation scheme allowed for the treatment of up to 9 electronic states including two effective modes. Up to now in the literature a 3 electronic state system with two effective modes could be investigated \cite{Matr95}. The ultrafast exciton--vibrational dynamic in a Chla/b hetero dimer of the light--harvesting complex LHC-II of green plants has been studied within the effective mode model. From the simulation of the two--color pump--probe spectra of \cite{Bitt94} evidence could be obtained for the geometry of the optical transition dipoles of the Chla and Chlb pigments absorbing at 680 nm and 650 nm, respectively. They are arranged rather in line than like a sandwich. The measured femtosecond component in the pump--probe signal reflects the Coulomb interaction induced redistribution of oscillator strength among the one-- and the two--exciton transitions of the dimer. Changing the dipole geometry resulted in a qualitative change of the signal. The inclusion of higher excited singlet $S_n$--states of the pigments and internal conversion transitions to the first excited singlet $S_1$--states allowed for a microscopic description of exciton--exciton annihilation. Within this model the intensity dependence of the two--color pump--probe signal measured in \cite{Bitt94} could be simulated, revealing an inverse internal conversion rate of $1/R^{(\rm IC)}_{S_n\rightarrow S_1}=2.2$ ps, and a ratio of dipole moments $\mu_{S_1\rightarrow S_n}/\mu_{S_0\rightarrow S_1}=$1.19. The energy of the $S_n$--state has been taken twice the $S_1$--state energy for both pigments. Consistently to the simulation of the two--color pump--probe experiments also the 77 K one--color pump--probe experiment of \cite{Viss96} could be successfully simulated. It could be demonstrated that again the redistribution of oscillator strength by the {\it Coulomb}interaction can explain the observed switch of the sign of the signal after about 2 ps. In this time exciton relaxation between the high-- and the low energetic exciton states of the dimer occurs and a two exciton transition starting from the low energetic one exciton state becomes possible. To look for an influence of intramolecular excited state absorption of the pigments the higher excited $S_n$--state of Chl{\it a} has been shifted to reach resonance with the probe pulse. A further redistribution of oscillator strength among the two exciton states could be found. However, the principle effect is already included if only interacting two--level molecules are considered. Finally it could be demonstrated that if the effective modes are shifted into the heat bath, the simulation of the one-- and two--color pump--probe experiments gives significantly worse results. Such a simplified approach corresponds to the multi--mode model applied afterwards on the FMO--complex. Only the behavior on the femtosecond or the picosecond time scale could be understood within the simple model. For a consistent description over the whole time range memory effects in the exciton--vibrational interaction had to be taken into account. However the interaction of the Chl{\it a/b} dimer with the remaining pigments in the LHC-II monomer have been neglected. Therefore it would be interesting to compare the dimer results within the effective mode model with a multi --mode approach including all 12 pigments of the LHC-II monomer. A major difficulty arises from the fact that the geometry of the optical transition dipoles of the pigments in the LHC-II has not been resolved yet. Therefore it is difficult to estimate the mutual {\it Coulomb} interactions between the pigments. However, a promising result has been published recently in \cite{Guel97} giving estimates for the dipole geometries of the Chl{\it a} molecules. It is tempting to combine these results with the result of this work and arrange the remaining Chl{\it b} transition dipoles in such a way that within the Chl{\it a/b} dimers {\it in li ne} geometry is obtained. However first calculations up to now do not give such a consistent fit of the one-- and two-- color pump--probe experiments as it could be obtained within the effective mode model. Further work is in progress. For the bacterial light harvesting FMO complex a high resolution structural investigation allowed to give the geometry of the $Q_y$ transition dipoles of the 7 BChls \cite{Tron85,Li97}. In the standard approaches \cite{Pear92,Pear93,guelen97,Louw97} of the simulation of the linear response of FMO--complexes the homogeneous line width has been always neglected. In this work, a microscopic model of exciton relaxation formulated in the multi--mode model could be used to calculate realistic homogeneous exciton transition line shapes. Moreover, since temperature enters the density matrix theory, it was possible to simulate the temperature dependends of the spectra measured in \cite{Frei97}. A simultaneous fit of the linear absorption at two different temperatures was essential for getting the right microscopic parameter set which could be verified afterwards in the simulation of non--linear optical experiments in the time domain. These parameters include the site energies of the 7 BChl molecules, the global shape of the spectral density of protein vibrations, and the correlation radius of exciton--vibrational coupling. For the latter a value $R_c=$ 21 \AA{} could be obtained, which lies in the middle between smallest (11\AA) and largest (30\AA) center to center distances of pigments in the FMO monomer. Hence the coupling of the protein vibrations to different pigments can be characterized as partly correlated. The dependence of the exciton dynamics and linear absorption spectra on $R_c$ was investigated, and as a general trend it could be obtained that a small correlation radius enhances exciton relaxation. Using the same approach and the same parameters ultrafast pump--probe experiments of \cite{Frei97} performed at 20 K could be successfully simulated at three different probe wavelengths. The nice agreement with the measured data did allow for an estimation of the intramolecular excited state absorption of the pigments in the FMO protein. A ratio of dipole moments $\mu_{S_1\rightarrow S_n}/\mu_{S_0\rightarrow S_1}=0.5$ was obtained. This was the only parameter, which could not be determined from the linear absorption fit, since it appears only in the non--linear optical response. A closer examination of the pump--probe simulations revealed some deviations from the measured data for small delay times ($

Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Membranproteine und agieren als Sensoren, Biokatalysatoren oder Ionentransporter. Die Ionentransporter unterteilen sich in lichtgetriebene Ionenpumpen und in lichtaktivierte Kanalrhodopsine. Besonders die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin steht schon lange im Fokus biophysikalischer Untersuchungen. Obwohl die Protonenpumpen seit über 40 Jahren intensiv untersucht werden, ist das Wissen über deren elektrophysiologische Eigenschaften noch immer gering. Aus diesem Grund widmete sich diese Arbeit der elektrophysiologischen Charakterisierung der mikrobiellen Rhodopsine mit dem Fokus auf Protonenpumpen. Hierfür wurden vor allem „Two-Electrode Voltage Clamp“ -Messungen (TEVC) an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus leavis durchgeführt. Die Untersuchung verschiedener Protonenpumpen hat gezeigt, dass diese eine unerwartet große Diversität in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen. Von besonderem Interesse war die Beobachtung, dass einige Protonenpumpen neben Pumpströmen auch passive einwärts gerichtete Photoströme zeigten. Besonders deutlich war der „Pump-Kanal-Dualismus“ bei dem Gloeobacter-Rhodopsin ausgeprägt. Andere Protonenpumpen, wie das Bakteriorhodopsin oder Coccomyxa-Rhodopsin, zeigten keine einwärts gerichteten Photoströme. Das Coccomyxa-Rhodopsin wurde aufgrund seiner hohen Photostrom-Amplituden in Oozyten für eine Mutationsanalyse ausgewählt. Diese Mutationsanalyse verhalf die strukturellen Ursachen für die funktionalen Unterschiede zu identifizieren, welche sowohl zwischen den Protonenpumpen untereinander als auch gegenüber Kanalrhodopsinen beobachtet wurden. Mutationen im Gegenion-Komplex führen zu rein passiven oder inaktiven Transportern. Dagegen übernimmt der extrazelluläre Halbkanal in Protonenpumpe die Aufgabe einen passiven Protonen-Rückfluss während des Pumpzyklus zu verhindern, denn Mutationen in dieser Region verursachen passive Photoströme zusätzlich zum aktiven Pumpstrom. / Microbial rhodopsins are light-sensitive membrane proteins and operate as sensors, enzymes or ion-transporters. The ion transporters are subdivided into light-driven ion pumps and light-gated channels. Biophysical research has put focus on the proton pump bacteriorhodopsin for long time. Despite the fact that light-driven proton pumps are investigated for over 40 years, the knowledge about their electrophysiological properties is surprisingly low. For this reason, this thesis is devoted to the electrophysiological characterization of microbial rhodopsins with special focus on light-driven proton pumps. For this purpose, “Two-Electrode Voltage Clamp”-recordings (TEVC) were primarily performed using oocytes from African clawed frog Xenopus leavis. The investigation of diverse proton pumps has shown that the differences in their electrophysiological behaviors are unexpectedly high. Special interest was laid on proton pumps which show passive inward directed photocurrents when the electrochemical load exceeds a certain level. The dualism of pump and channel activity was particularly pronounced in the proton pump Gloeobacter-rhodopsin. Other proton pumps, for instance bacteriorhodopsin or Coccomyxa-rhodopsin, do not show inward directed photocurrents. Due to high photocurrent amplitudes, the Coccomyxa-rhodopsin was selected for an efficient mutagenesis study. This study allowed the identification of structural key determinants for the differences among proton pumps themselves and for the differences of proton pumps in comparison with light-gated ion channels (channelrhodopsins). Therefore, mutations of the counter-ion-complex cause inactive or purely passive transporters. The extracellular half-channel is the key element in proton pumps which prevents passive proton-backflow during the pump-cycle. Mutations in this region lead to passive leak-currents in overlap with the remaining pump-activity.

Das Anliegen dieser Arbeit besteht darin, die Kinetik von elektronischen Singulett- und Triplett-Anregungen innerhalb des solubilisierten Lichtsammelkomplexes des Photosystem II (LHCII) zu untersuchen. Die Untersuchungen gliedern sich in drei Teilkomplexe: Klärung der Frage, in welchem Maße die gegenseitige Wechselwirkung zwischen angeregten Singulett-Zuständen (Singuletts)zu deren Vernichtung führt. Um dies zu analysieren, wurden Messungen zur nichtlinearen Fluoreszenz von LHCII in einem großen Bereich der Anregungsimpuls-Intensität durchgeführt. Dazu war es notwendig, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt, die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz räumlich zu selektieren. Die so gemessene Fluoreszenzausbeute von solubilisiertem LHCII verringert sich um bis zu 4 Größenordnungen bei maximaler Intensität und entspricht einem sättigenden Verhalten der Fluoreszenz. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, daß der Transfer der Anregungsenergie innerhalb eines gesamten solubilisierten LHCII-Trimers extrem schnell vonstatten geht. Untersuchung zur Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung im LHCII. Dazu wurde ein Meßaufbau für Pump-Test-Messungen der nichtlinearen Transmission mit optischer Zeitverzögerung zwischen Pump- und Test-Impuls realisiert. Besonderes Augenmerk wurde auf die Vermeidung von Meß-Artefakten gelegt. Die zeitliche Änderung der Absorption bei 507 nm spiegelt die Kinetik der Karotinoid-Triplett-Bildung in solubilisiertem LHCII wider. Bei der Modellierung der gemessenen Daten wurde die Rate für den Triplett-Transfer von 3Chl nach Car variiert. Die beste Anpassung ergibt den Grenzfall . Als untere Grenze kann im Rahmen der Meßgenauigkeit ein Wert von (0.5 ns)-1 angegeben werden. Dieser Wert ist mehr als eine Größenordnung größer, als der noch vor kurzer Zeit akzeptierte Wert von Kramer und Mathis (1980). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen Chlorophyllen und Karotinoiden in LHCII wesentlich stärker ist, als bisher angenommen wurde. Untersuchung der Wechselwirkung von Singuletts mit langlebigen Tripletts anhand der Fluoreszenz, die durch einen elektronisch verzögerten Test-Laser-Impuls hervorgerufen wird. Diese "Test-Fluoreszenz" nimmt mit Erhöhung der Pump-Intensität drastisch ab und erreicht bei hohen Pump-Intensitäten wenige Prozent des Ausgangswertes. Das Zurückkehren zum Ausgangswert wurde als Funktion der Verzögerungszeit bei verschiedenen Pump-Intensitäten gemessen. Mit Hilfe der Stern-Volmer Gleichung lassen sich daraus die quenchenden Populationen berechnen. Dies ergibt, daß das Quenching bei vergleichsweise geringen Pump-Intensitäten eindeutig den Karotinoid-Tripletts zugeordnet werden kann. Bei hohen Pump-Impuls-Intensitäten wurde eine zusätzliche, extrem stark quenchende Spezies identifiziert, bei der es sich möglicherweise um Chlorophyll-Tripletts oder -Ionen handelt. / In this study the kinetics of electronically excited singlet and triplet states within solubilized light harvesting complexes of photosystem II (LHCII) is investigated. It is subdivided into three parts: The mutual interaction between excited singlet states and their annihilation was analyzed. For that purpose nonlinear fluorescence measurements were performed in a huge range of excitation pulse intensity. A method was developed that allows a spatial selection of the fluorescence. The fluorescence yield determined in this way shows a drastic decrease of up to 4 orders of magnitude at the highest intensity used and corresponds to a saturation like behavior of the fluorescence. As a result of the theoretical investigation of this result, the excitation energy transfer within the overall LHCII-trimer is extremely fast. The kinetics of carotenoid triplet formation in LHCII was analyzed by pump-probe measurements of nonlinear transmission using an optically generated delay between pump- and probe-pulses. Special care was taken to prevent artifacts in this kind of measurement. The temporal change of the absorbance at 507 nm reflects the kinetic of carotenoid triplet formation in solubilized LHCII. The fit of the experimental data by a kinetic model provides that the rate for the triplet transfer from 3Chl to Car is (0.5 ns)-1. This value is more than one order of magnitude higher than the results obtained so far (Kramer and Mathis, 1980). This shows that the interaction between chlorophylls and carotenoids is much higher than previously assumed. The interaction between singlets and (long living) triplets was investigated by measurements of the fluorescence originating from a delayed probe pulse in the presence of a pump pulse. This "probe-fluorescence" decreases drastically with increasing pump pulse intensity up to a level of a few percent at the highest intensity. The recovery to the initial value (pump pulse off) was studied as a function of the electronically generated time delay and at different pump intensities. The population of quenching species was calculated by means of the Stern-Volmer Equation. As a result of this analysis the quenching at low pump intensities can clearly be attributed to carotenoid triplets. At high pump pulse intensities an extremely strong quenching species is formed which can be probably identified by chlorophyll-triplets or -ions.

In dieser Arbeit werden Strategien zur Entwicklung von biohybriden Photoelektroden, die Licht in elektrische Energie umwandeln, demonstriert und diskutiert. Der natürliche Photonen-transformierende Superkomplex der oxygenen Photosynthese aus Thermosynechococcus elongatus, das Photosystem I (PSI), kann durch die nicht-native Interaktion zum Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c), erfolgreich funktional in Elektroden integriert werden. Hierfür wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, z. B. bilden beide Biokomponenten unspezifische Komplexe in Lösung und assemblieren gemeinsam auf modifizierten Goldoberflächen. Aus der Kontaktierung des PSI mit einer thiol-modifizierten Goldelektrode via Cyt c ergeben sich unidirektionale kathodische Photoströme. DNA, als ein Polyelektrolytmatrixelement, kann zum Aufbau von 3D-Protein-Mehrschichtarchitekturen höherer Stabilität und Leistungsfähigkeit verwendet werden. Der Einsatz von mesoporösen Indium-Zinnoxid-Elektroden vergrößert die Photostromgenerierung um mehr als eine Größenordnung, wodurch sich hieraus skalierbare transparente Photobioelektroden mit hohen Quanteneffizienzen (bis zu 30%) erzeugen lassen. / In this thesis, strategies are demonstrated and discussed for the development of biohybrid photoelectrodes transforming light into electrical energy. The natural photon-to-charge carrier converting super-complex from oxygenic photosynthesis of Thermosynechococcus elongatus, photosystem I (PSI), can be functionally implemented into such electrodes, due to the non-native interaction with the small redox protein cytochrome c (cyt c). Different strategies have been developed, e. g. both biocomponents form complexes in solution and self-assemble on modified gold-surfaces. The electrical connection of PSI to thiol-modified gold electrodes via cyt c results in unidirectional cathodic photocurrents of high efficiency. DNA, as a polyelectrolyte matrix element, can be used to build up 3D protein multilayer architectures of higher stability and performance. The use of mesoporous indium tin oxide electrodes further enhances the photocurrent generation more than one order of magnitude, thus resulting in scalable transparent photobioelectrodes of high quantum efficiencies (up to 30 %).

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.

Seit mehr als 10 Jahren kann biologische Aktivität durch eine Vielzahl photosensorischer Proteine beeinflusst werden. In diesem als Optogenetik bezeichneten Forschungsgebiet, werden Kationen leitende Kanalrhodopsine (CCRs) als lichtinduzierte neuronale Aktivatoren eingesetzt. Diese Arbeit soll zur Vervollständigung von optogenetischen Werkzeugen durch die Entwicklung Anionen leitender Kanalrhodopsine (ACRs) dienen, um die bestehenden Nachteile mikrobieller lichtgetriebener Ionenpumpen zu überwinden, die bislang zur neuronale Inhibition genutzt wurden. Der Austausch von E90 in C. reinhardtii Kanalrhodopsin 2 (CrChR2) durch positiv geladene Aminosäuren führte zu Entwicklung Chlorid leitender ChRs (ChloCs), die jedoch eine Restkationen-permeabilität aufwiesen. Durch Substitution zweier weiterer negativen Ladungen innerhalb des Ionenpermeationsweges, konnte die Kationenleitung vollständig aufgehoben werden. Parallel wurde durch A. Berndt et al. ein inhibitorisches C1C2 (iC1C2), basierend auf der CrChR1/2 Chimäre entwickelt. Wie auch bei den ChloCs, zeigte iC1C2 verbesserungswürdige biophysikalische Eigenschaften. Mutagenesestudien des Ionenpermeationsweges führten zur Entwicklung der verbesserten Nachfolgervariante iC++. Um ausgehend von weiteren CCRs neuartige ACRs zu entwickeln (eACRs), wurden die zuvor angewandten Mutagenesestrategien auf weitere CCRs übertragen. Zwei neue eACRs, Phobos und Aurora, mit jeweils blau- und rotverschobenen Aktionsspektrum konnten generiert werden. Bistabile eACRs wurden erzeugt, die ein lichtgesteuertes Schalten zwischen offenen und geschlossenen Zuständen ermöglichen. Schlussendlich wurde ein natürlich vorkommendes ACR (nACR) aus Proteomonas sulcata (PsACR1) identifiziert und charakterisiert. Die Maximalaktivität von PsACR1 zählt mit 540 nm zu den am stärksten rotverschobenen unter den nACRs. Elektrophysiologische und spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich der Photozyklus von PsACR1 signifikant von jenen der CCRs unterscheidet. / For more than 10 years, photosensory proteins have developed as powerful tools to manipulate biological activity. In this research field termed optogenetics, cation-conducting channelrhodopsins (CCRs) mainly are utilized as light-induced neural activators. This study aimed at a complementation of the optogenetic tool box by engineering anion-conducting channelrhodopsins (ACRs) to overcome the existing drawbacks of microbial light-driven ion pumps utilized for neural inhibition so far. Replacement of E90 in the cation-conducting C. reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) with positively charged residues reversed the ion selectivity and yielded chloride-conducting ChRs (ChloCs). Applied in neuronal cell culture, ChloCs showed residual cation permeability occasionally leading to excitation instead of the desired inhibition. Further charge elimination within the ion permeation pathway completely abolished cation conduction. In parallel, an inhibitory C1C2 (iC1C2) was developed by A. Berndt et al. based on a CrChR1/2 chimera. Though, iC1C2 displayed unsatisfactory biophysical properties as well. Further mutational modifications of the ion permeation pathway led to the development of the improved successor variant iC++. A systematic transfer of both conversion strategies to other CCRs was conducted to create engineered ACRs (eACRs) with distinct biophysical properties. Two novel eACRs, Phobos and Aurora, with blue- and red-shifted action were obtained. Additionally, step-function mutations greatly enhanced the operational light sensitivity and enabled temporally precise toggling between open and closed states using two different light colors. Finally, a natural ACR (nACR) originating from Proteomonas sulcata (PsACR1) was identified and characterized. With a maximum activation at 540 nm it is one of most red-shifted nACRs. Single turnover electrophysiological measurements and spectroscopic investigations revealed an unusual photocycle compared to that of CCRs.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, welche nach Absorption eines Photons durch den Retinal-Cofaktor einen passiven Ionentransport über die Zellmembran katalysieren. Im Zuge von optogenetischen Anwendungen wird diese Reaktion für die Beeinflussung der Ionenhomöostase von verschiedenen Zelltypen und Geweben ausgenutzt. Zu Beginn dieser Arbeit wurden lichtinduzierte Strukturänderungen und Protontransferschritte in einem breiten Zeitbereich (Nanosekunden bis Minuten) in dem grün-absorbierenden ChR ReaChR mithilfe von stationärer und transienter UV-vis- und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) untersucht. Auf Basis der experimentellen Daten wurde ein komplexes Photozyklus-Modell konzipiert. Anschließend wurde die IR-aktive, nichtkanonische Aminosäure p-Azido-L-phenylalanin (azF) mittels Stopp-Codon-Suppression ortsspezifisch an mehreren Positionen innerhalb der vermuteten ionenleitenden Kanalpore in ReaChR inkorporiert und mit FTIR untersucht. azF ist sensitiv gegenüber Polaritätsänderungen und absorbiert in einem hochfrequenten Bereich (~2100 cm-1). Aufgrund der großen spektralen Separation zu endogenen Proteinschwingungen (< 1800 cm-1) können globale Konformations- und lokale Hydratisierungsänderungen simultan detektiert werden. Die erhobenen Daten leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung einer temporären Wasserpore in ChRs und demonstrieren zum ersten Mal den erfolgreichen in-vivo-Einbau einer artifiziellen Aminosäure in mikrobielle Rhodopsine und dessen schwingungsspektroskopische Analyse. Die Methode bietet aufgrund ihrer hohen Ortsauflösung ein großes Potential für die Studie von Mikroumgebungen innerhalb komplexer Proteinensemble. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels. Upon absorption of a photon, the retinal chromophore isomerizes and drives conformational changes within the protein, which lead to a passive ion transport across the cell membrane. This capability is used for optogenetic applications to manipulate ionic homeostasis of different cell types and entire organisms. Within the work, light-induced structural changes and proton transfer steps were studied in the green-absorbing ChR ReaChR in great detail by steady-state and transient UV-vis and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The data were merged into a complex photocycle model. Next, the IR-active, unnatural amino acid p-azido-L-phenylalanine (azF) was site-specifically introduced at several sites of the putative ion pore of ReaChR by stop codon suppression. azF is sensitive to polarity changes and absorbs in a clear spectral window lacking endogenous protein vibrations. Thus, FTIR measurements of labeled mutants report for global conformational changes (< 1800 cm-1) and local hydration changes (~2100 cm-1) simultaneously. The presented findings reveal crucial insights regarding formation of a transient water pore in ChRs and demonstrate the first report of the successful in-vivo incorporation of an artificial amino acid into a microbial rhodopsin and its subsequent spectroscopic investigation. Additionally, the so far unprecedented spatial resolution renders this methodology superior over conventional FTIR methods to study microenvironments within complex protein ensembles.

In der vorliegenden Arbeit sind unterschiedliche Kopplungsstrategien des natürlichen Photosystems I (PSI) aus Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus mit verschiedenen Elektrodenoberflächen sowie Interaktion mit Nanomaterialien und Enzymen bearbeitet worden. Zum einen wurde gezeigt, dass die Immobilisierung des PSI auf modifizierten mehr-wandigen Kohlenstoffnanoröhrchen zur funktionalen Photobiohybridelektrode führt. Dabei wurde das PSI mit der Elektrode elektrisch mit Hilfe eines Redoxproteins, Cytochrom c (cyt c), verknüpft. Das System (PSI-cyt c) wurde auch auf eine dreidimensionale Elektrodenoberfläche des Metaloxids Indiumzinnoxid (eng. ITO) übertragen. Hierbei wurde zusätzlich die TransparenzEigenschaft solcher Oberflächen ausgenutzt. Die Präparation solcher transparenter Elektroden wurde optimiert, um höhere Photoströme zu generieren. Weiterhin wurde eine neue Methode der elektrischen Kontaktierung des PSI mit der Elektrode etabliert. Hierfür wurden Fullerene eingesetzt. Durch erhöhte molekulare Effizienz wurde gezeigt, dass Fullerene effektivere Elektronvermittler zwischen PSI und der Elektrode sind als das cyt c. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die photokatalytischen Eigenschaften von PSI mit den biokatalytischen Eigenschaften des Enzyms humane Sulphit Oxidase (hSOx) kombiniert. Hierbei wurde das Enzym als ein alternativer und effizienter Elektronzulieferer für PSI eingesetzt. Ein drittes Protein, das cyt c, fungierte als elektrisches Bindeglied und sicherte die elektrische Kommunikation zwischen den katalytischen Proteinen im System und der Elektrode. Die Komplexität des PSI sowie seine Kommunikation mit anorganischen Nanomaterialien und anderen komplexen Biomolekülen, wie z.B. Enzymen, zeigt ein großes Potential des Einsatzes von PSI-basierter Biohybriden in den Biotechnologien der Zukunft. / In this thesis, different strategies for coupling of the natural complex photosystem I from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus with different electrode surfaces, and the interaction of PSI with nanomaterials and enzymes has been investigated. First, it was shown that immobilization of PSI on modified multi-walled carbon nanotubes (MWNT) leads to a functional photobiohybrid electrode. Here, PSI has been electrically wired to the electrode via a redox-active protein, cytochrome c (cyt c). The system (PSI-cyt c) has been scaled up to the three-dimensional surface of a metal-oxide, indium tin oxide (ITO). Here, additionally the high transparency property of this material has been exploited. The new preparation procedure of such transparent electrodes has been optimized in order to achieve high pohotocurrents. Furthermore, a new method of electric wiring of the PSI with the electrode has been established. Here, fullerenes have been employed. The high molecular efficiency of such a system proves that fullerenes are more effective wiring agents between the PSI and the electrode as compared to the cyt c. Additionally, in this thesis the photocatalytic property of the PSI has been combined with the biocatalytic property of the enzyme human sulphite oxidase, hSOx. Here, the enzyme has been employed as an alternative electron supplier for PSI. The third protein, cyt c, acted as an electric wiring agent and ensured electric communication between both catalytic proteins of the system and the electrode. The versatility of the PSI as well as its communication with anorganic nanomaterials and biological molecules, e.g. such as enzymes, shows a great potential for use of PSI-based biohybrids in the future biotechnological applications.