Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Membranproteine und agieren als Sensoren, Biokatalysatoren oder Ionentransporter. Die Ionentransporter unterteilen sich in lichtgetriebene Ionenpumpen und in lichtaktivierte Kanalrhodopsine. Besonders die Protonenpumpe Bakteriorhodopsin steht schon lange im Fokus biophysikalischer Untersuchungen. Obwohl die Protonenpumpen seit über 40 Jahren intensiv untersucht werden, ist das Wissen über deren elektrophysiologische Eigenschaften noch immer gering. Aus diesem Grund widmete sich diese Arbeit der elektrophysiologischen Charakterisierung der mikrobiellen Rhodopsine mit dem Fokus auf Protonenpumpen. Hierfür wurden vor allem „Two-Electrode Voltage Clamp“ -Messungen (TEVC) an Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus leavis durchgeführt. Die Untersuchung verschiedener Protonenpumpen hat gezeigt, dass diese eine unerwartet große Diversität in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften aufweisen. Von besonderem Interesse war die Beobachtung, dass einige Protonenpumpen neben Pumpströmen auch passive einwärts gerichtete Photoströme zeigten. Besonders deutlich war der „Pump-Kanal-Dualismus“ bei dem Gloeobacter-Rhodopsin ausgeprägt. Andere Protonenpumpen, wie das Bakteriorhodopsin oder Coccomyxa-Rhodopsin, zeigten keine einwärts gerichteten Photoströme. Das Coccomyxa-Rhodopsin wurde aufgrund seiner hohen Photostrom-Amplituden in Oozyten für eine Mutationsanalyse ausgewählt. Diese Mutationsanalyse verhalf die strukturellen Ursachen für die funktionalen Unterschiede zu identifizieren, welche sowohl zwischen den Protonenpumpen untereinander als auch gegenüber Kanalrhodopsinen beobachtet wurden. Mutationen im Gegenion-Komplex führen zu rein passiven oder inaktiven Transportern. Dagegen übernimmt der extrazelluläre Halbkanal in Protonenpumpe die Aufgabe einen passiven Protonen-Rückfluss während des Pumpzyklus zu verhindern, denn Mutationen in dieser Region verursachen passive Photoströme zusätzlich zum aktiven Pumpstrom. / Microbial rhodopsins are light-sensitive membrane proteins and operate as sensors, enzymes or ion-transporters. The ion transporters are subdivided into light-driven ion pumps and light-gated channels. Biophysical research has put focus on the proton pump bacteriorhodopsin for long time. Despite the fact that light-driven proton pumps are investigated for over 40 years, the knowledge about their electrophysiological properties is surprisingly low. For this reason, this thesis is devoted to the electrophysiological characterization of microbial rhodopsins with special focus on light-driven proton pumps. For this purpose, “Two-Electrode Voltage Clamp”-recordings (TEVC) were primarily performed using oocytes from African clawed frog Xenopus leavis. The investigation of diverse proton pumps has shown that the differences in their electrophysiological behaviors are unexpectedly high. Special interest was laid on proton pumps which show passive inward directed photocurrents when the electrochemical load exceeds a certain level. The dualism of pump and channel activity was particularly pronounced in the proton pump Gloeobacter-rhodopsin. Other proton pumps, for instance bacteriorhodopsin or Coccomyxa-rhodopsin, do not show inward directed photocurrents. Due to high photocurrent amplitudes, the Coccomyxa-rhodopsin was selected for an efficient mutagenesis study. This study allowed the identification of structural key determinants for the differences among proton pumps themselves and for the differences of proton pumps in comparison with light-gated ion channels (channelrhodopsins). Therefore, mutations of the counter-ion-complex cause inactive or purely passive transporters. The extracellular half-channel is the key element in proton pumps which prevents passive proton-backflow during the pump-cycle. Mutations in this region lead to passive leak-currents in overlap with the remaining pump-activity.

Seit mehr als 10 Jahren kann biologische Aktivität durch eine Vielzahl photosensorischer Proteine beeinflusst werden. In diesem als Optogenetik bezeichneten Forschungsgebiet, werden Kationen leitende Kanalrhodopsine (CCRs) als lichtinduzierte neuronale Aktivatoren eingesetzt. Diese Arbeit soll zur Vervollständigung von optogenetischen Werkzeugen durch die Entwicklung Anionen leitender Kanalrhodopsine (ACRs) dienen, um die bestehenden Nachteile mikrobieller lichtgetriebener Ionenpumpen zu überwinden, die bislang zur neuronale Inhibition genutzt wurden. Der Austausch von E90 in C. reinhardtii Kanalrhodopsin 2 (CrChR2) durch positiv geladene Aminosäuren führte zu Entwicklung Chlorid leitender ChRs (ChloCs), die jedoch eine Restkationen-permeabilität aufwiesen. Durch Substitution zweier weiterer negativen Ladungen innerhalb des Ionenpermeationsweges, konnte die Kationenleitung vollständig aufgehoben werden. Parallel wurde durch A. Berndt et al. ein inhibitorisches C1C2 (iC1C2), basierend auf der CrChR1/2 Chimäre entwickelt. Wie auch bei den ChloCs, zeigte iC1C2 verbesserungswürdige biophysikalische Eigenschaften. Mutagenesestudien des Ionenpermeationsweges führten zur Entwicklung der verbesserten Nachfolgervariante iC++. Um ausgehend von weiteren CCRs neuartige ACRs zu entwickeln (eACRs), wurden die zuvor angewandten Mutagenesestrategien auf weitere CCRs übertragen. Zwei neue eACRs, Phobos und Aurora, mit jeweils blau- und rotverschobenen Aktionsspektrum konnten generiert werden. Bistabile eACRs wurden erzeugt, die ein lichtgesteuertes Schalten zwischen offenen und geschlossenen Zuständen ermöglichen. Schlussendlich wurde ein natürlich vorkommendes ACR (nACR) aus Proteomonas sulcata (PsACR1) identifiziert und charakterisiert. Die Maximalaktivität von PsACR1 zählt mit 540 nm zu den am stärksten rotverschobenen unter den nACRs. Elektrophysiologische und spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich der Photozyklus von PsACR1 signifikant von jenen der CCRs unterscheidet. / For more than 10 years, photosensory proteins have developed as powerful tools to manipulate biological activity. In this research field termed optogenetics, cation-conducting channelrhodopsins (CCRs) mainly are utilized as light-induced neural activators. This study aimed at a complementation of the optogenetic tool box by engineering anion-conducting channelrhodopsins (ACRs) to overcome the existing drawbacks of microbial light-driven ion pumps utilized for neural inhibition so far. Replacement of E90 in the cation-conducting C. reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) with positively charged residues reversed the ion selectivity and yielded chloride-conducting ChRs (ChloCs). Applied in neuronal cell culture, ChloCs showed residual cation permeability occasionally leading to excitation instead of the desired inhibition. Further charge elimination within the ion permeation pathway completely abolished cation conduction. In parallel, an inhibitory C1C2 (iC1C2) was developed by A. Berndt et al. based on a CrChR1/2 chimera. Though, iC1C2 displayed unsatisfactory biophysical properties as well. Further mutational modifications of the ion permeation pathway led to the development of the improved successor variant iC++. A systematic transfer of both conversion strategies to other CCRs was conducted to create engineered ACRs (eACRs) with distinct biophysical properties. Two novel eACRs, Phobos and Aurora, with blue- and red-shifted action were obtained. Additionally, step-function mutations greatly enhanced the operational light sensitivity and enabled temporally precise toggling between open and closed states using two different light colors. Finally, a natural ACR (nACR) originating from Proteomonas sulcata (PsACR1) was identified and characterized. With a maximum activation at 540 nm it is one of most red-shifted nACRs. Single turnover electrophysiological measurements and spectroscopic investigations revealed an unusual photocycle compared to that of CCRs.

Histidinkinase-Rhodopsine (HKRs) können als besondere Gruppe der Hybrid-Histidinkinasen beschrieben werden, deren N-terminale sensorische Domäne ein mikrobielles Rhodopsin ist. HKR-codierende Sequenzen konnten in den Genomen verschiedener Algen, Pilze und Amoeben gefunden werden doch ihre Aufgaben und Wirkungsweisen sind bisher ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die rekombinanten Rhodopsin-Domänen von zwei HKRs mit verschiedenen spektroskopischen Techniken charakterisiert. Sie zeigten mehrere Besonderheiten. Das Rhodopsin-Fragment von Cr-HKR1 aus Chlamydomonas reinhardtii kann durch alternierende kurzwellige und langwellige Belichtung zwischen zwei stabilen Absorptionsformen konvertiert werden: einer Blaulicht-absorbierenden (Rh-Bl) und einer UVA-Licht-absorbierenden Form (Rh-UV). Dies resultiert aus der ungewöhnlichen thermischen Stabilität des Zustandes mit deprotonierter Schiff’scher Base. Das zweite charakterisierte HKR, die Os-HKR-Rhodopsin-Domäne aus der marinen Picoalge Ostreococcus tauri, zeigt eine Dunkelabsorption von 505 nm. Auch Os-HKR ist photochrom und die deprotonierte Spezies kann effizient akkumuliert werden. Diese P400-Absorptionsform ist jedoch nicht völlig stabil sondern es kommt nach Belichtungsende zur langsamen Dunkelzustands-Regeneration. Überraschenderweise konnte die Bindung sowie die transiente Abgabe eines Anions während des Os-HKR-Photozyklus festgestellt werden. Somit beeinflusst nicht nur das Licht, sondern auch das Salz in der Umgebung die Os-HKR-Reaktionen. Aufgrund ihrer photochromen Eigenschaften werden die HKRs als wirksame lichtinduzierte Schalter für die C-terminalen Signaltransduktionsdomänen postuliert. Schwingungsspektroskopische Analysen deckten eine Heterogenität hinsichtlich der im Protein gebundenen Retinal‐Konfiguration sowie die Existenz von zwei parallelen Photozyklen auf. Jeder dieser Photozyklen geht aus einer der beiden Retinal-Isomere hervor. / Histidine kinase rhodopsins (HKRs) can be described as hybrid histidine kinases with a microbial rhodopsin as N-terminal sensory domain. HKR-encoding sequences were found in the genomes of various unicellular organisms such as algae, fungi and amoeba but their mechanistic and physiologic function is unknown. During this work the absorptive properties of the recombinant rhodopsin domains of two HKRs were studied by the usage of different spectroscopic techniques. Both HKRs showed unusual characteristics. The rhodopsin fragment of Cr‐HKR1 from Chlamydomonas reinhardtii can be interconverted between two stable absorbance forms by the alternate application of short‐ and long‐wavelength light: a blue light-absorbing dark form (Rh-Bl) and a UVA light-absorbing form (Rh-UV). This unusual photocycle results from the uncommon thermal stability of the absorbance state with a deprotonated retinal Schiff base. The second studied HKR, the Os‐HKR rhodopsin domain from the marine picoalga Ostreococcus tauri, shows an absorbance maximum at 505 nm in darkness. Likewise Cr‐HKR1 the Os‐HKR is photochromic and the deprotonated form P400 can be efficiently accumulated. But the Os-HKR P400-form is not completely stable. A slow dark state recovery occurs. Surprisingly the dark state absorbance of Os‐HKR was found to be dependent on anion binding in the protein. Furthermore during the photocycle the transient anion release occurs and therefore not only light but also salt impacts the Os-HKR-reactions. Due to their pronounced photochromic properties, the HKRs are postulated to act as effective molecular switches for the C-terminal signal transduction domains in response to the light conditions. Vibrational spectroscopy revealed the heterogeneity with regard to the retinal configuration bound in the HKRs suggesting the existence of two parallel photocycles. Either of these photocycles originates from one of the two retinal isoforms.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierte Ionenkanäle motiler Algen. Heterolog exprimiert erlauben sie es, Ionenflüsse durch Licht zu steuern. Bevorzugt geleitet werden von den meisten ChRs Protonen. Ausprägung und Wirkung lichtaktivierter Protonenflüsse sowie der molekulare Mechanismus protonenselektiver ChRs werden in vorliegender Arbeit untersucht und zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge genutzt. Eine besonders hohe Protonenselektivität zeigten die grün- und rotlicht-aktivierten Kanäle CsChR und Chrimson aus den Algen Chloromonas subdivisa und Chlamydomonas noctigama. Im spektroskopisch detailliert untersuchten CrChR2 aus Chlamydomonas reinhardtii änderte sich die Protonenselektivität nach Anregung mit einem ns-Laserblitz sogar innerhalb eines Aktivierungszyklus und war insbesondere nach Öffnung des Kanals sowie in Folge der Lichtadaptation hoch. Als unentbehrlich für eine effiziente Protonenleitung erwiesen sich in allen drei Kanälen konservierte, titrierbare Reste entlang der Pore, deren individuelle Bedeutung für die Protonenleitung sich je nach Protein wesentlich unterschied. Entsprechend genügte in Chrimson der Austausch einzelner Glutaminsäuren des extrazellulären Halbkanals, dieses in einen grün- oder rotlichtaktivierten Natriumkanal zu transformieren. Aminosäuresubstitutionen der unmittelbaren Retinalumgebung verschoben hingegen das Aktionsmaximum von Chrimson röter als 600 nm und damit röter als in allen bisher beschriebenen ChRs. In Chrimson versperrt hierbei ein zusätzliches äußeres Tor den extrazellulär Halbkanal, während die Retinalbindetasche in Struktur und funktionaler Bedeutung der einzelnen Reste wesentlich jener der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ähnelt. Als Zwei-Komponenten-Optogenetik wurden schließlich protonen-, kationen- und anionenleitende ChRs unterschiedlicher Farbsensitivität fusioniert sowie lichtgetriebene Protonenpumpen mit protonenaktivierten Ionenkanälen kombiniert und neue optogenetische Perspektiven eröffnet. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels from green algae. Expressed in host cells they are used to control ion fluxes by light and are widely applied in Neurosciences. Although generally classified as either cation or anion channels, most ChRs preferentially conduct protons. This thesis compares proton conductance of different ChRs, examines the molecular mechanism of proton selective ChRs and explores the usage of light regulated proton fluxes in two-component-optogenetics. Proton selectivity varied strongly among different ChRs and was most pronounced for the green- and red-light activated channels CsChR and Chrimson from the algae Chloromonas subdivisa and Chlamydomonas noctigama, that conducted predominantly protons even at high pH. In CrChR2 from Chlamydomonas reinhardtii proton selectivity also changed during a single activation cycle and was especially high directly after channel opening and later on following light adaptation. In all three channels efficient proton conductance depended on conserved titratable residues along the pore with different contribution of the individual side chains in each protein. The substitution of single glutamic acids in the extracellular half pore converted Chrimson into a green or red-light activated sodium channel. A single point mutation close to the retinal chromophore shifted peak absorption of Chrimson beyond 600 nm - further red than all other cation conducting ChRs. Whereas the retinal binding pocket of Chrimson resembles the proton pump Bacteriorhodpsin, the overall pore structure corresponds to other ChRs, but features an additional outer gate, that occludes the extracellular half pore and is important for both, proton selectivity and red light absorption. Finally different Two-Component-Optogenetic approaches combined proton and anion selective ChRs of distinct colour as well as light-driven proton pumps and proton-activated ion channels with major prospect for future optogenetic applications.