Mit der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen weiteren Schritt zur Aufklärung der visuellen Kaskade beizutragen. Erstmals konnten die Enthalpieänderungen für den G-Protein-Zyklus und dessen Teilreaktionen im Titrationskalorimeter am rekonstituierten System bestimmt werden. Der G-Protein-Zyklus Der Photorezeptor Rhodopsin katalysiert in seinem lichtaktivierten Zustand (R*) die Aktivierung des G-Proteins Transducin (Gt) durch Austausch von GDP gegen GTP in der Nukleotidbindungstasche von Transducin. Durch die intrinsische GTPase des G-Proteins, wird GTP hydrolysiert und Gt kehrt in den inaktiven Zustand zurück. Die Titration von GTP zum Komplex aus lichtaktiviertem Rhodopsin und Transducin (R*G-Komplex) ergab für den gesamten G-Protein-Zyklus eine Reaktionsenthalpie von - 4.6 ± 0.8 kcal pro Mol GTP. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den in der Literatur aufgeführten Werten für die Reaktionsenthalpie der Hydrolyse von ATP zu ADP (- 4.9 kcal/Mol; Gajewski et al., 1986 [22 ]). Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus Die Teilreaktionen des G-Protein-Zyklus waren nicht direkt durch Titrationsexperimente zugänglich. Durch Variation der Konzentrationen der einzelnen Reaktionspartner konnten jedoch die unterschiedlichen Phasen des Wärmesignals zu Teilschritten des Zyklus zugeordnet und deren Reaktionsenthalpien bestimmt werden. Die R*G-Komplexbildung Der Bindung von R* an GGDP sind mehrere Reaktionen untrennbar überlagert. Die gemessene Enthalpieänderung von + 2.0 kcal/Mol ist die Summe der Wärmeänderungen durch Abgabe des an G[alpha] gebundenen GDP, Bindung von R* an Transducin und die Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen den Rhodopsin Intermediaten MI- und MII-Rhodopsin bei dieser Bindung.Die Komplexdissoziation Unter Verwendung von GTP[gamma]S wurde für die Komplexdissoziation eine Enthalpieänderung von - 4.4 kcal/Mol ermittelt. Es ist zu beachten, daß dieser Teilschritt sich aus mehreren Reaktionen zusammensetzt. Dies sind die Bindung des zugegebenen GTPgS an den R*G-Komplex, die Dissoziation von R* und Transducin, die Trennung der Untereinheiten des G-Proteins und die Einstellung des MI-MII-Gleichgewichtes nach Freiwerden des Rhodopsins. Da die Wärmeänderung der genannten Reaktionen nicht separat bestimmt werden konnte, entspricht die im Kalorimeter gemessene Wärme der Summe der Enthalpieänderungen dieser Reaktionen.Die Hydrolysereaktion von GGTP zu GGDP Die Enthalpieänderung durch Hydrolyse des an Transducin gebundenen GTP zu GDP wurde aus der Gesamtwärme des Zyklus zu - 2.2 kcal/Mol errechnet. Die Reaktionsenthalpie des gesamten Zyklus wird nur von der Energieabgabe des GTP bestimmt, dabei wird die Energie des GTP jedoch nicht vollständig bei der Hydrolyse des Transducin-gebundenen GTP zu GDP frei. Die Differenz zwischen der Gesamtenthalpieänderung und der Wärme, die bei Hydrolyse von Gt-gebundenem GTP frei wird, liegt in einer höheren inneren Energie von Transducin in der GTP-bindenden Konformation als im GDP-bindenden Zustand.

Kanalrhodpsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkanäle, welche als primäre Fotorezeptoren in Grünalgen dienen. In der Optogenetik werden ChRs verwendet um neuronale Membranen zu depolarisieren und mit Licht Aktionspotentiale auszulösen. Das mit blauem Licht aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodopsin 2 (C2) und effiziente Mutanten wie C2 H134R stellen die am häufigsten genutzten depolarisierenden, optogenetischen Werkzeuge dar. Komplementär zu ChRs werden Protonen- und Chloridpumpen aus Archaebakterien zur neuronalen Inhibierung durch lichtinduzierte Hyperpolarisation verwendet. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die ChR-Chimäre C1V1, ein grünlichtaktiviertes ChR, das sich durch hervorragende Membranlokalisierung und hohe Fotoströme in HEK-Zellen auszeichnet. C1V1 und C1V1-Mutanten mit feinabgestimmten spektralen und kinetischen Eigenschaften ermöglichen die neuronale Aktivierung mit Wellenlängen bis 620 nm sowie die unabhängige Aktivierung zweier Zellpopulationen in Kombination mit C2. Um die strukturelle Basis von Kanalöffnung und Ionentransport in ChRs zu verstehen, wurden gezielt Mutationen in C2 und C1V1 eingeführt. Die Fotoströme der entsprechenden Mutanten wurden auf Kationenselektivität und kinetische Veränderungen untersucht. Während Aminosäuren, die den Kanal an der zytosolischen Seite begrenzen, die Kationenfreisetzung und Einwärtsgleichrichtung der ChRs bestimmen, spielen zentral im Kanal gelegende Aminosäuren ein entscheidende Rolle für Kationenselektivität und -kompetition. Ein enzymkinetisches Modell ermöglichte außerdem die Zerlegung der Fotoströme in Beiträge der verschiedenen, konkurrierenden Kationen. Im letzten Teil der Arbeit wurde pHoenix, ein optogenetisches Werkzeug zur Ansäuerung synaptischer Vesikel, entwickelt. In Neuronen des Hippocampus wurde pHoenix verwendet, um die treibenden Kräfte für die vesikuläre Neurotransmitteraufnahme sowie den Zusammenhang zwischen Vesikelfüllstand und Freisetzungswahrscheinlichkeit zu analysieren. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-activated cation channels functioning as primary photoreceptors in green algae. In the emerging field of optogenetics, ChRs are used to depolarize neuronal membranes, thus allowing for light-induced action-potential firing. The blue light-activated Chlamydomonas channelrhodopsin 2 (C2) and high-efficiency mutants such as C2 H134R represent the most commonly used depolarizing optogenetic tools. Complementary to ChRs, green to yellow light-activated proton and chloride pumps originating from archea enable neuronal inhibition by membrane hyperpolarization. In the present work, we developed the chimeric ChR C1V1, a green-light activated ChR with excellent membrane targeting and high photocurrents in HEK cells. Action spectrum and kinetic properties of C1V1 were further fine-tuned by site-directed mutagenesis. The ensemble of C1V1 variants allows for neuronal activation with wavelengths up to 620 nm and can be used in two-color optogenetic experiments in combination with C2 derivatives. In order to understand the structural motifs involved in channel gating and ion transport, conserved residues in C2 and C1V1 were mutated and photocurrents of the respective mutants were analyzed for kinetic characteristics and cation selectivity. In these experiments, residues of the inner gate region were shown to alter cytosolic cation release and inward rectification, whereas central gate residues determine cation competition and selectivity, as well as the equilibrium between the two open channel conformations. Moreover, an enzyme-kinetic model was used to quantitatively dissect ChR photocurrents into the contribution of different competing cations. Finally, we designed pHoenix, an optogenetic tool enabling green-light induced acidification of synaptic vesicles. In hippocampal neurons, pHoenix was used to study both the energetics of vesicular neurotransmitter uptake and the impact of the vesicular contents on synaptic vesicle release.

Ionotrope Glutamatrezeptoren steuern exzitatorische Prozesse im Gehirn. Der AMPA-Rezeptor ist der schnellste Glutamatrezeptor und reguliert die Signaltransduktion in hochfrequenten Bereichen. Um die Konformationen des Rezeptors für die Aktivierung aufzuschlüsseln, wurden die Ligandenbindedomänen (LBD), mit künstlichen Metallbrücken verlinkt. Die tetramerische LBD-Schicht hat mehrere Freiheitsgrade. Sie reichen vom Schließen der LBD durch Ligandenbindung, bis hin zu den verschiedenen Konformationsmöglichkeiten innerhalb des Tetramers. Die bereits publizierte T1-Mutante wurde verlinkt und auf Einzelkanalebene elektrophysiologisch untersucht. Anschließend wurde T1 mit einer Mutante (DKD-3H) verglichen die durch molekulardynamische Simulationen identifiziert wurde. Die Eigenschaften von T1 und DKD-3H wurden mit einem natürlich vorkommenden AMPAR-Linker, namens Con ikot ikot, verglichen. Meeresschnecken der Gattung Conus setzen das Polypeptid zur Fischjagd ein. Zur Analyse wurde eine Software entwickelt, speziell für Ströme von ligandengesteuerten Ionenkanälen mit multiplen Leitfähigkeiten (www.github.com/AGPlested/ASCAM). Durch Verlinkung in T1 konnten drei präaktive Konformationen aufgeschlüsselt werden und die schnelle Aktivierung im sub-Millisekundenbereich verschwindet ganz. Obwohl die Metall-koordinierenden Residuen von T1 und DKD-3H nah beieinander liegen, konnte für DKD-3H nur eine einzelne präaktive Konformation gefunden werden. Es deutet darauf hin, dass die LBD-Schicht von AMPA-Rezeptoren hochdynamisch ist da die geringe Abweichung große Auswirkungen auf den Phänotypen des Rezeptors hat. LBD-Verlinkung mit Con-ikot-ikot ergab einen EC50 von ~5 nM. Alle drei Verlinkungsarten resultierten in einer reduzierten Offenwahrscheinlichkeit. Einzelkanalanalysen von T1 und Con-ikot-ikot-gebundenen AMPA-Rezeptoren unterstützen die Hypothese, dass die veränderten Phänotypen aus dem Wechselspiel der LBDs innerhalb der LBD-Schicht resultieren. / Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) mediate excitatory neurotransmission in the mammalian brain. The AMPA-type receptor is the fastest iGluR member, activating at the sub-millisecond time scale. In this study, ligand-binding domains (LBDs), where AMPAR activation is initialised, were cross-linked with artificially introduced metal bridges to trap and investigate conformational states of the receptor before- and during activation. The tetrameric LBD layer has multiple degrees of freedom, from closure of individual clamshells and their conformational arrangement within the dimers and the tetramer. The previously studied T1 mutant was cross-linked at the single-channel level and compared to a second cross-linking mutant (DKD 3H) that was predicted on a molecular dynamics approach. T1 and DKD 3H were to the effects of a naturally occurring AMPAR-specific LBD cross-linker (Con ikot ikot) from a fish-hunting snail of the genus Conus. Single-channel recordings were analysed with a newly developed software dedicated to ligand-gated ion channels with conductances in the low pA range and multiple subconductance levels (www.github.com/AGPlested/ASCAM). Trapping of the T1 mutant revealed three pre-active conformational states that were not described for AMPARs before. Fast activation in the sub-millisecond range disappears fully indicating that these conformations proceed too fast in non-restricted wild-type receptors to be resolved. Although the metal-coordinating residues of T1 and DKD 3H are in close proximity, DKD 3H yielded one single pre-active state. A slightly distinct register of the bridge results in largely different phenotypes. Cross-linking with con ikot ikot identified an EC50 of ~5 nM. All three cross-linking approaches reduced open probability. The results support the hypothesis that the altered phenotypes are not a result of singly restricted LBDs but the dynamics of the tetrameric LBD-layer as one unit.

QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

Der zerstörungsfreien Charakterisierung und Analyse von lebenden humanen Zellen über längere Zeiträume kommt zukünftig in Medizin und Biotechnologie eine zentrale Rolle zu. Für eine therapeutische Nutzung müssen die Zellen nach der Analyse unverändert und vital vorliegen. Ein Ansatz beruht auf der Analyse von nanoskopischen Zellrückständen, die von Zellen während der Migration hinterlassen werden, den Zellspuren. Diese spiegeln in repräsentativer Weise die Merkmale der Erzeugerzelle wider. Für die technische Nutzung muss der Entstehungsprozess reproduzierbar kontrolliert werden können. Im Zusammenhang wurde ein Versuchsaufbau zur Beobachtung der dynamischen Prozesse Adhäsion, Migration und substratnahe Organisation des Zytoskeletts von lebenden Zellen entwicklet, der hochauflösende Langzeitbeobachtungen mittels Totaler Interner Reflexions Fluoreszenz (TIRF-) Mikroskopie ermöglicht. Zur Auswertung wurde eine auf Falschfarben beruhende Darstellungsweise der dynamischen Prozesse entwickelt. Es konnte eine Korrelation der Eigenschaften der Zellspuren mit dem Adhäsions- und Migrationsverhalten, sowie dem Aufbau der substratnahen Bereiche des Zytoskeletts der Erzeugerzellen nachgewiesen werden. Ebenso wurde der Einfluss der oberflächenspezifischen Substrateigenschaften (Beschichtung oder topografische Strukturierung) auf die Zellspurablage gezeigt. / Nondestructive characterisation and analysis of human living cells over a long period will be an important issue for medicin and biotechnology in the near future. In order to use the cells after analysis for therapeutical applications, the cells have to be unmodified and still alive after the analytical procedure. The analysis of nanoscopic cell residues, called cell traces, which are left behind during cell migration represent an appropriate approach. Attributes of the donor cell are shown by the cell trace characteristically. In order to use cell traces for biotechnological applications the formation and deposition of cell traces has to be repeatable. Thus, an experimental set up using Total Internal Fluorescence Microscopy (TIRF) has been established to observe the dynamic processes of cell adhesion, cell migration and the organisation of the cytoskeleton used therein. Using miscolours a new embodiment has been developed to evaluate dynamic processes. Cell adhesion, cell migration and the organisation of the actin cytoskeleton of the donor cells have been found to influence the attributes of cell traces. Further specific modified surfaces have been used to influence the deposition of cell traces. Effects have been shown for coated surfaces or surfaces with a topographic structure.

In der vorliegenden Arbeit sind unterschiedliche Kopplungsstrategien des natürlichen Photosystems I (PSI) aus Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus mit verschiedenen Elektrodenoberflächen sowie Interaktion mit Nanomaterialien und Enzymen bearbeitet worden. Zum einen wurde gezeigt, dass die Immobilisierung des PSI auf modifizierten mehr-wandigen Kohlenstoffnanoröhrchen zur funktionalen Photobiohybridelektrode führt. Dabei wurde das PSI mit der Elektrode elektrisch mit Hilfe eines Redoxproteins, Cytochrom c (cyt c), verknüpft. Das System (PSI-cyt c) wurde auch auf eine dreidimensionale Elektrodenoberfläche des Metaloxids Indiumzinnoxid (eng. ITO) übertragen. Hierbei wurde zusätzlich die TransparenzEigenschaft solcher Oberflächen ausgenutzt. Die Präparation solcher transparenter Elektroden wurde optimiert, um höhere Photoströme zu generieren. Weiterhin wurde eine neue Methode der elektrischen Kontaktierung des PSI mit der Elektrode etabliert. Hierfür wurden Fullerene eingesetzt. Durch erhöhte molekulare Effizienz wurde gezeigt, dass Fullerene effektivere Elektronvermittler zwischen PSI und der Elektrode sind als das cyt c. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die photokatalytischen Eigenschaften von PSI mit den biokatalytischen Eigenschaften des Enzyms humane Sulphit Oxidase (hSOx) kombiniert. Hierbei wurde das Enzym als ein alternativer und effizienter Elektronzulieferer für PSI eingesetzt. Ein drittes Protein, das cyt c, fungierte als elektrisches Bindeglied und sicherte die elektrische Kommunikation zwischen den katalytischen Proteinen im System und der Elektrode. Die Komplexität des PSI sowie seine Kommunikation mit anorganischen Nanomaterialien und anderen komplexen Biomolekülen, wie z.B. Enzymen, zeigt ein großes Potential des Einsatzes von PSI-basierter Biohybriden in den Biotechnologien der Zukunft. / In this thesis, different strategies for coupling of the natural complex photosystem I from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus with different electrode surfaces, and the interaction of PSI with nanomaterials and enzymes has been investigated. First, it was shown that immobilization of PSI on modified multi-walled carbon nanotubes (MWNT) leads to a functional photobiohybrid electrode. Here, PSI has been electrically wired to the electrode via a redox-active protein, cytochrome c (cyt c). The system (PSI-cyt c) has been scaled up to the three-dimensional surface of a metal-oxide, indium tin oxide (ITO). Here, additionally the high transparency property of this material has been exploited. The new preparation procedure of such transparent electrodes has been optimized in order to achieve high pohotocurrents. Furthermore, a new method of electric wiring of the PSI with the electrode has been established. Here, fullerenes have been employed. The high molecular efficiency of such a system proves that fullerenes are more effective wiring agents between the PSI and the electrode as compared to the cyt c. Additionally, in this thesis the photocatalytic property of the PSI has been combined with the biocatalytic property of the enzyme human sulphite oxidase, hSOx. Here, the enzyme has been employed as an alternative electron supplier for PSI. The third protein, cyt c, acted as an electric wiring agent and ensured electric communication between both catalytic proteins of the system and the electrode. The versatility of the PSI as well as its communication with anorganic nanomaterials and biological molecules, e.g. such as enzymes, shows a great potential for use of PSI-based biohybrids in the future biotechnological applications.

Die phosphorylierungsabhängige Bindung von Arrestin an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) ist ein weit verbreiteter Mechanismus, um aktive Rezeptoren zu inhibieren. Für die Bindung von Arrestin an lichtaktiviertes, phosphoryliertes Rhodopsin (pRho), einem GPCR, der sich in der Diskmembran der Stäbchenzellen der Netzhaut befindet, ist in Lipidmembranen die Phosphorylierung von 2 der insgesamt 7 Phosphorylierungsstellen im Rezeptor-C-Terminus nötig, wohingegen 3 Phosphate das Arrestin quantitativ aktivieren. Welchen Einfluss höhere Phosphorylierungsniveaus auf die Rezeptor-Arrestin-Interaktion haben, ist bisher ungeklärt. In dieser Arbeit wurde daher eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Rhodopsin-Phosphorylierung etabliert, die unterschiedlich pRho-Spezies präparativ getrennt und mit den isolierten pRho-Spezies verschiedene Parameter der Rezeptor-Arrestin-Interaktion, wie z.B. die Bindungsstöchiometrie der resultierenden pRho-Arrestin-Komplexe, untersucht. Für die Charakterisierung der Arrestinbindung wurden Titrationen mit 3 verschiedenen fluoreszenzmarkierten Arrestinmutanten und pRho in gemischten Phospholidipd/Detergens-Mizellen durchgeführt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass der Phosphorylierungsgrad von Rhodopsin neben der Affinität von Arrestin auch die Bindungsstöchiometrie beeinflusst. So haben die Komplexe bei geringem Phosphorylierungsgrad eine 2 : 1 (pRho : Arrestin) Stöchiometrie, während bei einem sehr hohen Phosphorylierungsgrad bevorzugt 1 : 1 pRho-Arrestin-Komplexe gebildet werden. Zudem weisen ein unterschiedliches Elutionsverhalten bei der säulenchromatographischen Trennung und Abweichungen in der pRho-Arrestin-Stöchiometrie verschiedener pRho-Präparationen mit ähnlicher Gesamtanzahl an Phosphaten auf einen zusätzlichen Einfluss unterschiedlicher Phosphorylierungsmuster hin. Insgesamt deuten die Daten auf eine komplexe Beziehung zwischen dem Phosphorylierungsgrad der Rezeptoren und dem Arrestin-Bindungsmodus hin. / The phosphorylation-dependent binding of arrestin to G protein-coupled receptors (GPCRs) is a widely used mechanism to inhibit active receptors. In lipid membranes, the binding of arrestin to light-activated, phosphorylated rhodopsin (pRho), a GPCR located in the disc membranes of retinal rod cells, requires the phosphorylation of 2 of the 7 phosphorylation sites in the receptor C-terminus, whereas 3 phosphates are required to completely activate arrestin. The influence of higher phosphorylation levels on the receptor/arrestin interaction is still unclear. In this thesis, a method for the quantitative determination of rhodopsin phosphorylation was established, rhodopsin species with varying degrees of phosphorylation were separated preparatively and different parameters of the receptor/arrestin interaction, such as the binding stoichiometry of the resulting pRho/arrestin complexes, were investigated for each isolated pRho species. For the characterization of arrestin binding, titrations with 3 different fluorescently labeled arrestin mutants and pRho in mixed phospholipid/detergent micelles were performed. The data obtained in this work show that the phosphorylation level of rhodopsin influences the binding stoichiometry in addition to the affinity of arrestin binding to rhodopsin. Thus, complexes with a low level of phosphorylation have a 2 : 1 (pRho : arrestin) stoichiometry, whereas 1 : 1 pRho/arrestin complexes are preferably formed at a very high degree of phosphorylation. In addition, a different elution behaviour during chromatographic separation and variances in the pRho/arrestin stoichiometry of different pRho preparations with similar overall number of phosphates indicate an additional influence of distinct phosphorylation patterns. Overall, the data indicate a complex relationship between receptor phosphorylation level and arrestin binding mode.

Rhodopsin ist als Sehpigment der Photorezeptorzellen einer der am aktivsten untersuchten GPCRs. Es besteht aus dem Apoprotein Opsin und dem inversen Agonisten 11-cis-Retinal. Der inaktivierende Ligand ist in der sieben Transmembran- Helix (TM)-Struktur des Rezeptors kovalent gebunden und muss durch Licht cis/trans-isomerisiert werden, um den Rezeptor zu aktivieren. Der aktivierte Rezep-tor katalysiert den Nukleotidaustausch im G-Protein und zerfällt innerhalb von Minuten in Opsin und all-trans-Retinal. Das visuelle Pigment wird dann durch erneute Beladung des Opsins mit 11-cis-Retinal wieder hergestellt. In der vorliegenden Arbeit wird die erfolgreiche Kristallisation des nativen Opsins aus der Stäbchenzelle der Rinderretina und die Bestimmung der Proteinstruktur bei 2.9 Å Auf-lösung dargestellt. Im Vergleich zur bekannten Struktur des inaktiven Rhodopsins zeigt Opsin deutliche Strukturänderungen in den konservierten E(D)RY und NPxxY(x)5,6F Regionen und in TM5-TM7. Auf der intrazellulären Seite ist TM6 ca. 6-7 Å nach außen gekippt, während die TM5 Helix verlängert und näher zu TM6 verschoben ist. Durch die strukturellen Änderungen, von denen einige einem aktiven GPCR Zustand zugeschrieben werden können, wird die leere Retinalbindungstasche reorganisiert, um zwei Öffnungen für Aus- und Eintritt von Retinal bereitzustellen. Die Struktur von Opsin liefert neue Erkenntnisse zur Bindung von hydrophoben Liganden an GPCRs, zur GPCR-Aktivierung und zur Signalübertragung auf das G-Protein. / Rhodopsin as the visual pigment in photoreceptor cells is one of the most actively studied GPCRs. It consists of the apoprotein opsin and the inverse agonist, 11-cis-retinal. The inactivating ligand is bound in the seven-transmembrane helix (TM) bundle and cis/trans-isomerized by light to activate the receptor. The active receptor state is capable of catalyzing nucleotide exchange in the G protein and decays within minutes into opsin and all-trans-retinal. The visual pigment is then restored by reloading opsin with new 11-cis-retinal. In the present work, the successful crystallization of native opsin from bovine retinal rod cells and determination of the protein structure to 2.9 Å resolution is presented. Compared with the known structure of inactive rhodopsin, opsin displays prominent structural changes in the conserved E(D)RY and NPxxY(x)5,6F regions and TM5-TM7. At the cytoplasmic side, TM6 is tilted outwards by 6-7 Å, whereas the helix structure of TM5 is more elongated and close to TM6. These structural changes, of which some are attributed to an active GPCR state, reorganize the empty retinal binding pocket to disclose two openings for exit and entry of retinal. The opsin structure thus sheds new light on binding of hydrophobic ligands to GPCRs, GPCR activation and signal transfer to the G protein.

Die Metaphasenspindel ist eine selbstorganisierende molekulare Maschine, die die entscheidende Funktion erfüllt, das Genom während der Zellteilung gleichmäßig zu trennen. Spindellänge und -form sind emergente Eigenschaften, die durch komplexe Wechselwirkungsnetzwerke zwischen Molekülen hervorgerufen werden. Obwohl erhebliche Fortschritte beim Verständnis der einzelnen molekularen Akteure erzielt wurden, die ihre Länge und Form beeinflussen, haben wir erst kürzlich damit begonnen, die Zusammenhänge zwischen Spindelmorphologie, Dynamik und Materialeigenschaften zu untersuchen. In dieser Arbeit untersuchte ich zunächst quantitativ die Rolle zweier molekularer Kraftgeneratoren - Kinesin-5 und Dynein - bei der Regulierung der Spindelform von Xenopus-Eiextrakt. Eine Störung ihrer Aktivität veränderte die Spindelmorphologie, ohne die Gesamtmasse der Mikrotubuli zu beeinflussen. Um die Spindelform physikalisch zu stören, wurde ein Optical Stretcher (OS) -Aufbau entwickelt. Obwohl das OS Vesikel in Extrakten verformen könnte, konnte keine Kraft auf Spindeln ausgeübt werden. Die Untersuchung des Brechungsindex der Struktur mittels optischer Beugungstomographie (ODT) ergab, dass es keinen Unterschied zwischen Spindel und Zytoplasma gab. Korrelative Fluoreszenz- und ODT-Bildgebung zeigten, wie sich die Materialeigenschaften innerhalb verschiedener Biomoleküle räumlich unterschieden. Die Gesamttrockenmasse der Spindel skalierte mit der Länge, während die Gesamtdichte konstant blieb. Interessanterweise waren die Spindeln in HeLa-Zellen dichter als das Zytoplasma. Schließlich deckte eine störende Mikrotubulusdichte auf, wie die Gesamttubulinkonzentration die Spindelgröße, die Gesamtmasse und die Materialeigenschaften regulierte. Insgesamt bietet diese Studie eine grundlegende Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Spindel und hilft dabei, Zusammenhänge zwischen der Biochemie und der Biophysik einer aktiven Form weicher Materie zu beleuchten. / The metaphase spindle is a self-organising molecular machine that performs the critical function of segregating the genome equally during cell division. Spindle length and shape are emergent properties brought about by complex networks of interactions between molecules. Although significant progress has been made in understanding the individual molecular players influencing its length and shape, we have only recently started exploring the links between spindle morphology, dynamics, and material properties. A thorough analysis of spindle material properties is essential if we are to comprehend how such a dynamic structure responds to forces, and maintains its steady-state length and shape. In this work, I first quantitatively investigated the role of two molecular force generators– Kinesin-5 and Dynein in regulating Xenopus egg extract spindle shape. Perturbing their activity altered spindle morphology without impacting total microtubule mass. To physically perturb spindle shape, an Optical Stretcher (OS) setup was developed. Although the OS could deform vesicles in extracts, force could not be exerted on spindles. Investigating the structure’s refractive index using Optical Diffraction Tomography (ODT) revealed that there was no difference between the spindle and cytoplasm. Correlative fluorescence and ODT imaging revealed how material properties varied spatially within different biomolecules. Additionally, spindle mass density and the microtubule density were correlated. The total dry mass of the spindle scaled with length while overall density remained constant. Interestingly, spindles in HeLa cells were denser than the cytoplasm. Finally, perturbing microtubule density uncovered how total tubulin concentration regulated spindle size, overall mass and material properties. Overall, this study provides a fundamental characterisation of the spindle’s physical properties and helps illuminate links between the biochemistry and biophysics of an active form of soft matter.