Ionotrope Glutamatrezeptoren steuern exzitatorische Prozesse im Gehirn. Der AMPA-Rezeptor ist der schnellste Glutamatrezeptor und reguliert die Signaltransduktion in hochfrequenten Bereichen.
Um die Konformationen des Rezeptors für die Aktivierung aufzuschlüsseln, wurden die Ligandenbindedomänen (LBD), mit künstlichen Metallbrücken verlinkt. Die tetramerische LBD-Schicht hat mehrere Freiheitsgrade. Sie reichen vom Schließen der LBD durch Ligandenbindung, bis hin zu den verschiedenen Konformationsmöglichkeiten innerhalb des Tetramers. Die bereits publizierte T1-Mutante wurde verlinkt und auf Einzelkanalebene elektrophysiologisch untersucht. Anschließend wurde T1 mit einer Mutante (DKD-3H) verglichen die durch molekulardynamische Simulationen identifiziert wurde. Die Eigenschaften von T1 und DKD-3H wurden mit einem natürlich vorkommenden AMPAR-Linker, namens Con ikot ikot, verglichen. Meeresschnecken der Gattung Conus setzen das Polypeptid zur Fischjagd ein. Zur Analyse wurde eine Software entwickelt, speziell für Ströme von ligandengesteuerten Ionenkanälen mit multiplen Leitfähigkeiten (www.github.com/AGPlested/ASCAM).
Durch Verlinkung in T1 konnten drei präaktive Konformationen aufgeschlüsselt werden und die schnelle Aktivierung im sub-Millisekundenbereich verschwindet ganz. Obwohl die Metall-koordinierenden Residuen von T1 und DKD-3H nah beieinander liegen, konnte für DKD-3H nur eine einzelne präaktive Konformation gefunden werden. Es deutet darauf hin, dass die LBD-Schicht von AMPA-Rezeptoren hochdynamisch ist da die geringe Abweichung große Auswirkungen auf den Phänotypen des Rezeptors hat. LBD-Verlinkung mit Con-ikot-ikot ergab einen EC50 von ~5 nM. Alle drei Verlinkungsarten resultierten in einer reduzierten Offenwahrscheinlichkeit. Einzelkanalanalysen von T1 und Con-ikot-ikot-gebundenen AMPA-Rezeptoren unterstützen die Hypothese, dass die veränderten Phänotypen aus dem Wechselspiel der LBDs innerhalb der LBD-Schicht resultieren. / Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) mediate excitatory neurotransmission in the mammalian brain. The AMPA-type receptor is the fastest iGluR member, activating at the sub-millisecond time scale.
In this study, ligand-binding domains (LBDs), where AMPAR activation is initialised, were cross-linked with artificially introduced metal bridges to trap and investigate conformational states of the receptor before- and during activation. The tetrameric LBD layer has multiple degrees of freedom, from closure of individual clamshells and their conformational arrangement within the dimers and the tetramer. The previously studied T1 mutant was cross-linked at the single-channel level and compared to a second cross-linking mutant (DKD 3H) that was predicted on a molecular dynamics approach. T1 and DKD 3H were to the effects of a naturally occurring AMPAR-specific LBD cross-linker (Con ikot ikot) from a fish-hunting snail of the genus Conus. Single-channel recordings were analysed with a newly developed software dedicated to ligand-gated ion channels with conductances in the low pA range and multiple subconductance levels (www.github.com/AGPlested/ASCAM).
Trapping of the T1 mutant revealed three pre-active conformational states that were not described for AMPARs before. Fast activation in the sub-millisecond range disappears fully indicating that these conformations proceed too fast in non-restricted wild-type receptors to be resolved. Although the metal-coordinating residues of T1 and DKD 3H are in close proximity, DKD 3H yielded one single pre-active state. A slightly distinct register of the bridge results in largely different phenotypes. Cross-linking with con ikot ikot identified an EC50 of ~5 nM. All three cross-linking approaches reduced open probability. The results support the hypothesis that the altered phenotypes are not a result of singly restricted LBDs but the dynamics of the tetrameric LBD-layer as one unit.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/24868 |
| Date | 23 February 2022 |
| Creators | Braunbeck, Sebastian |
| Contributors | Plested, Andrew, Hegemann, Peter, Walter, Alexander |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC 4.0) Attribution-NonCommercial 4.0 International, https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ |
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