Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Frage nach Eignung der Technik, des Aufwands, der Schulung und der Vor- und Nachteile eines Einsatzes der Telepathologie in der Schnellschnitt-Diagnostik zu analysieren. Weltweit wurden verschiedene Telepathologiesysteme entwickelt, die zum Teil für den Schnellschnitt verwendet werden können. Auch an der Charité entstanden mit dem 1.ATM-System, 2.dem TPS-System und 3.dem TELEMIC-System, drei technisch völlig unterschiedliche Systeme. Diese Systeme wurden anhand einer retrospektiven Studie hinsichtlich ihrer Einsatzfähigkeit in der telepathologische Schnellschnitt-Diagnostik untersucht. Um die Systeme untereinander vergleichen zu können, wurden 124 histologische Schnellschnittpräparate aus dem Jahr 1999 herausgesucht (ausschließlich Brustgewebe), die von vier erfahrenen Pathologen mit jedem System erneut bearbeitet wurden. Qualitativ wurden mit dem ATM- und dem TPS-System gleichwertige Ergebnisse wie in der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik erreicht. Das TELEMIC-System war qualitativ aufgrund der hohen Rate von Rückweisungen den anderen Systemen und dem konventionellen Schnellschnitt deutlich unterlegen. Bei den Diagnosezeiten zeigte sich eine leichte Unterlegenheit des TPS-Systems gegenüber dem konventionellen Schnellschnitt. Da es jedoch insbesondere als Möglichkeit der Ferndiagnose eingesetzt wird, fallen die bei der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik nötigen Transportzeiten durch einen Kurier weg. Das ATM-System und das TELEMIC-System sind auch ohne Zurechnung der Transportzeiten zeitlich zum konventionellen Schnellschnitt vergleichbare Systeme. / Target of the available work is it, the question about suitability of the technique, the expenditure, to analyze the training and the pro and cons of an application of the Telepathologie on fresh frozen diagnostics. World-wide different Systems for telepathology were developed, which can be used partially for the fresh frozen diagnostics. At the Charité were developed three technically completely different systems: 1.ATM-System, 2.TPS system and 3.TELEMIC system, These systems were examined on the basis a retrospective study regarding their serviceability on telepathologische fresh frozen diagnostics. In order to be able to compare the systems among themselves, 124 histological fresh frozen preparations were picked out from the year 1999 (excluding chest tissues), which were again processed by four experienced pathologists with each system. Qualitatively with ATM and TPS system equivalent results as on were achieved conventional fresh frozen diagnostics. The TELEMIC system was qualitatively inferior for the other systems and the conventional fresh frozen diagnostics due to the high rate of rejections. With the diagnostic times an easy inferiority of the TPS system showed up in relation to the conventional fresh frozen diagnostics. Since it is used however in particular as possibility of the remote diagnostics, the feed times necessary with the conventional fresh frozen diagnostics are omitted by a courier. The ATM system and the TELEMIC system are also without addition of the feed times temporally to the conventional fresh frozen diagnostics comparable systems.

QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.

Dynamische zelluläre Prozesse wie Zellzyklus, Signaltransduktion oder Transkription zu analysieren wird Live-cell-imaging mittels Zeitraffermikroskopie verwendet. Um nun aber Zellabstammungsbäume aus einem Zeitraffervideo zu extrahieren, müssen die Zellen segmentiert und verfolgt werden können. Besonders hier, wo lebende Zellen über einen langen Zeitraum betrachtet werden, sind Fehler in der Analyse fatal: Selbst eine extrem niedrige Fehlerrate kann sich amplifizieren, wenn viele Zeitpunkte aufgenommen werden, und damit den gesamten Datensatz unbrauchbar machen. In dieser Arbeit verwenden wir einen einfachen aber praktischen Ansatz, der die Vorzüge der manuellen und automatischen Ansätze kombiniert. Das von uns entwickelte Live-cell-Imaging Datenanalysetool ‘eDetect’ ergänzt die automatische Zellsegmentierung und -verfolgung durch Nachbearbeitung. Das Besondere an dieser Arbeit ist, dass sie mehrere interaktive Datenvisualisierungsmodule verwendet, um den Benutzer zu führen und zu unterstützen. Dies erlaubt den gesamten manuellen Eingriffsprozess zu rational und effizient zu gestalten. Insbesondere werden zwei Streudiagramme und eine Heatmap verwendet, um die Merkmale einzelner Zellen interaktiv zu visualisieren. Die Streudiagramme positionieren ähnliche Objekte in unmittelbarer Nähe. So kann eine große Gruppe ähnlicher Fehler mit wenigen Mausklicks erkannt und korrigiert werden, und damit die manuellen Eingriffe auf ein Minimum reduziert werden. Die Heatmap ist darauf ausgerichtet, alle übersehenen Fehler aufzudecken und den Benutzern dabei zu helfen, bei der Zellabstammungsrekonstruktion schrittweise die perfekte Genauigkeit zu erreichen. Die quantitative Auswertung zeigt, dass eDetect die Genauigkeit der Nachverfolgung innerhalb eines akzeptablen Zeitfensters erheblich verbessern kann. Beurteilt nach biologisch relevanten Metriken, übertrifft die Leistung von eDetect die derer Tools, die den Wettbewerb ‘Cell Tracking Challenge’ gewonnen haben. / Live cell imaging based on time-lapse microscopy has been used to study dynamic cellular behaviors, such as cell cycle, cell signaling and transcription. Extracting cell lineage trees out of a time-lapse video requires cell segmentation and cell tracking. For long term live cell imaging, data analysis errors are particularly fatal. Even an extremely low error rate could potentially be amplified by the large number of sampled time points and render the entire video useless. In this work, we adopt a straightforward but practical design that combines the merits of manual and automatic approaches. We present a live cell imaging data analysis tool `eDetect', which uses post-editing to complement automatic segmentation and tracking. What makes this work special is that eDetect employs multiple interactive data visualization modules to guide and assist users, making the error detection and correction procedure rational and efficient. Specifically, two scatter plots and a heat map are used to interactively visualize single cells' visual features. The scatter plots position similar results in close vicinity, making it easy to spot and correct a large group of similar errors with a few mouse clicks, minimizing repetitive human interventions. The heat map is aimed at exposing all overlooked errors and helping users progressively approach perfect accuracy in cell lineage reconstruction. Quantitative evaluation proves that eDetect is able to largely improve accuracy within an acceptable time frame, and its performance surpasses the winners of most tasks in the `Cell Tracking Challenge', as measured by biologically relevant metrics.

Im Rahmen einer experimentellen Vergleichsstudie zweier bildwandlergestützter Navigationssysteme wurde die 3D-bildwandlergestützte Navigation mit der 2D-bildwandlergestützten Navigation zur Pedikelschraubenplatzierung am Modell getestet. Neben der Präzision der Bohrungen in einem postoperativen CT wurden Bildqualität, Genauigkeit des 3D-Scans, Planbarkeit und Umsetzung der Bohrungen bewertet und verglichen. Mit der 3D- Bildwandler- Navigation wurden 38 der 40 Bohrungen exakt platziert (95%). Eine Planung wurde durch einen Softwarefehler der Alpha-Version auf dem Monitor falsch wiedergegeben. Bei einer weiteren Bohrung wurde der Bohrer verkantet, wodurch Bildschirmdarstellung und Realität voneinander abwichen. Daher kam es in einem Fall zu einer lateralen Perforation der Kortikalis im Bereich des Pedikels, im anderen zu einer kaudalen Perforation. Mit der 2D- Bildwandler- Navigation konnten alle 40 Schrauben ohne Pedikelperforation platziert werden. Zwei dieser Schrauben wurden durch die ventrale Kortikalis gebohrt. Beide Verfahren überzeugten durch hohe Präzision und Zuverlässigkeit. 3 der 4 Fehlplatzierungen waren Anwender einer Software bedingt. Eine optimierte Software und verbesserte Instrumente werden diese Fehlerquote weiter reduzieren. Voraussetzung für die 2D-bildwandlergestützten Navigation sind eine gute Bildqualität sowie normale anatomische Gegebenheiten für standardisierte Projektionen. Die neue 3D-bildwandlergestützter Navigation kombiniert die Vorteile der 2D-bildwandlergestützter Navigation und der CT- basierten Navigation mit einer Verringerung der Strahlenbelastung durch den Wegfall des präoperativen CT`s und somit der Einsatzmöglichkeit im akuten Notfall sowie nach intraoperativen Repositionsmanövern. Da kein Matching erforderlich ist, wird insbesondere bei traumatischer Verletzung oder tumorbedingter Veränderung der dorsalen Wirbelstrukturen ein großer Vorteil zur CT- basierten Navigation erwartet. Aufgrund der universellen Einsatzmöglichkeiten eines Bildwandlers wird für diese neue Technologie ein breites Indikationsspektrum angenommen. / An experimental study to compare 2D- and 3D- Computer-Assisted Fluoroscopic Navigation for pedicle screw placement. Each system was evaluated by a post-operative CT and included the comparison of the palpation of the pedicular canal, the image quality and the accuracy of planning and performance. For this purpose 40 screws have been set to 9 models of lumbar spine. Using the 3D-flouroscopy based navigation 38 from 40 (95%) drillings were placed correctly. One mistake was caused by an error of the navigation-software. The second mistake was due to a drilling mistake, the drill was not shown correctly on the monitor because the drill has been canted. Using the 2D-flouroscopy based navigation all screws could be placed correctly at the pedicle, but two times the corpus has been perforated to ventral. Both techniques are precise and reliable. 3 out of 4 mistakes were caused by incorrect handling the instrument. The other mistake happened because of a software-error. If the software and the instruments will be optimised, the amount of mistakes will be reduced in the future. In case of the 2D-flouroscopy based navigation sufficient image quality, normal anatomical structures and defined projections are required. The new 3D-flouroscopy based navigation combines the benefit of 2D-flouroscopy based navigation and CT-based navigation by reducing the radiation exposure and the preoperative planning time. Therefore, this technique is suitable for use in an emergency or intraoperative repositions. Because no matching-procedure is necessary for CT-based navigation, we expect advantages especially in therapy of traumatic injuries or changes at the dorsal structures of spine caused by tumour. Furthermore, the use of fluoroscopic based navigation extends the range of applications/the spectrum of indication for this new technology.