Zellen benutzen Signalwege ein, um auf Änderungen in ihrer unmittelbaren Umgebung zu reagieren. Der Signalweg des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung vieler zellulärer Prozesse, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung und Migration. Obwohl die Hauptkomponenten der TGFβ-Signalgebung in den letzten Jahrzehnten identifiziert und erforscht wurden, ist das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens durch das Fehlen von Methoden eingeschränkt, die die Steuerung der TGFβ-Signalgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein optogenetisches System (das optoTGFβ-System) entwickelt, bei dem Licht dazu verwendet wird, die TGFβ-Signalgebung zeitlich und räumlich präzise zu steuern. Erstens wurde die Funktionalität des optoTGFβ-Systems durch Vergleich mit dem endogenen TGFβ-Signalsystem überprüft. Zweitens wurde durch das gleichzeitige Überwachen der subzellulären Translokation der Rezeptoren und der Smad-Proteine mittels „Live Cell Imaging“ gezeigt, dass die TGFβ-Signalgebung durch Modulation der Lichtstimulationen in einzelnen Zellen spezifisch aktiviert werden kann. Drittens wurde in Kombination mit der mathematischen Modellierung die Dynamik der TGFβ-Signalgebung im optoTGFβ-System quantitativ bestimmt. Die räumliche und zeitliche Präzision der optischen Kontrolle machen das optoTGFβ-System zu einem neuartigen und leistungsfähigen Methode für die quantitative Analyse und Manipulation von TGFβ-Signalen auf Einzelzellebene. / Cells employ signaling pathways to make decisions in response to changes in their immediate environment. Transforming Growth Factor β (TGFβ) signaling pathway plays pivotal roles in regulating many cellular processes, including cell proliferation, differentiation and migrations. Although the principal components of TGFβ signaling have been identified and explored in recent decades, understanding its dynamic behavior is limited by the lack of tools that allow the control of TGFβ signaling at high spatiotemporal resolution. In this thesis, we developed an optogenetic system (the optoTGFβ system), in which light is used to control TGFβ signaling precisely in time and space. First, we validated the functionality of the optoTGFβ system by comparing it with the endogenous TGFβ signaling system. Second, by simultaneously monitoring the subcellular translocation of the receptors and Smad proteins using live cell imaging, we showed that TGFβ signaling can be specifically activated in single cells through modulating the light stimulations. Third, in combination with mathematical modeling, we quantitatively characterized the dynamics of TGFβ signaling in the optoTGFβ system. The spatial and temporal precision of optical control makes the optoTGFβ system a novel and powerful tool for quantitative analyses and manipulation of TGFβ signaling at the single cell level.

Die Telomere sind spezialisierte DNA-Protein-Komplexe, die sich an den Enden der Chromosomen der eukaryotischen Zellen befinden. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, welches für die vollständige Replikation der Telomere bei den meisten Eukaryoten verantwortlich ist. Die katalytische Untereinheit des Enzyms (hTERT beim Menschen) besitzt Reverse-Transkriptase-Aktivität, und nutzt eine integrierte RNA (hTR beim Menschen) als Template, um Telomer-Wiederholungssequenzen an den Enden der Chromosomen zu synthetisieren. Die Telomerase ist in den meisten normalen humanen somatischen Zellen unterdrückt. In den meisten Krebszellen jedoch, stellt die Reaktivierung der Telomerase zur Beibehaltung der Telomerlänge eine Voraussetzung für deren unbegrenztes Wachstumspotential dar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein neuer, einfacher und selektiver Assay für den Nachweis der humanen Telomerase entwickelt werden. In dem neuen Assay sollten die beiden Kernkomponenten des Enzyms, die Protein-Untereinheit und die RNA, die Targets sein. Der Test ist in seiner Grundstruktur wie folgt aufgebaut : 1. Immobilisierung der Telomerase über die hTERT an eine Festphase, beschichtet mit Phosphorothioat-modifizierten (PS) Oligonukleotiden oder Heparin. Zusammen mit der Telomerase werden bei diesem Schritt die Heparin-bindenden Proteine, die in der Probe enthalten sind, an die Festphase gebunden. 2. Spezifischer Nachweis der hTR. Zur Detektion der hTR wird ein Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) oder eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) eingesetzt. In der optimierten Endversion wurde zur Immobilisierung des Enzyms eine Festphase, beschichtet mit PS-Oligonukleotiden, verwendet. Die hTR wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Mit dem neuen Assay wurden erfolgreich 75 Tumorzellen detektiert. / Telomeres are specialized DNA-Protein structures located at the ends of linear eukaryotic chromosomes. Telomerase is a ribonucleoprotein, which is responsible for the complete replication of the telomeres in most eukaryotes. The catalytic reverse transcriptase protein subunit (hTERT in humans) of the nucleoprotein uses an integral RNA (hTR in humans) as a template for the addition of telomeric repeat sequences to the ends of chromosomes. Telomerase is repressed in most normal human somatic cells, while the reactivation of telomerase to maintain telomere length is necessary for the unlimited growth potential of most human cancer cells. The aim of this work was the development of a new, simple and selective assay for the detection of human telomerase. The targets of the new assay were the two core subunits of the enzyme : hTERT and hTR. The test comprises two principal steps : 1. Immobilization of the telomerase via the hTERT subunit on a solid phase, coated with heparin or phosphorothioate-modified (PS) oligonucleotides. In this step telomerase is bound together with the heparin-binding proteins of the analysed sample to the surface. 2. Specific detection of the hTR. For the detection of the hTR an oligonucleotide ligation assay (OLA) or a reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was used. In the optimized final version of the assay a PS-coated solid phase was used for the immobilization of the enzyme. Reverse transcriptase PCR was applied for detection of the hTR. 75 tumor cells were successfully detected with the new assay.

Dynamische zelluläre Prozesse wie Zellzyklus, Signaltransduktion oder Transkription zu analysieren wird Live-cell-imaging mittels Zeitraffermikroskopie verwendet. Um nun aber Zellabstammungsbäume aus einem Zeitraffervideo zu extrahieren, müssen die Zellen segmentiert und verfolgt werden können. Besonders hier, wo lebende Zellen über einen langen Zeitraum betrachtet werden, sind Fehler in der Analyse fatal: Selbst eine extrem niedrige Fehlerrate kann sich amplifizieren, wenn viele Zeitpunkte aufgenommen werden, und damit den gesamten Datensatz unbrauchbar machen. In dieser Arbeit verwenden wir einen einfachen aber praktischen Ansatz, der die Vorzüge der manuellen und automatischen Ansätze kombiniert. Das von uns entwickelte Live-cell-Imaging Datenanalysetool ‘eDetect’ ergänzt die automatische Zellsegmentierung und -verfolgung durch Nachbearbeitung. Das Besondere an dieser Arbeit ist, dass sie mehrere interaktive Datenvisualisierungsmodule verwendet, um den Benutzer zu führen und zu unterstützen. Dies erlaubt den gesamten manuellen Eingriffsprozess zu rational und effizient zu gestalten. Insbesondere werden zwei Streudiagramme und eine Heatmap verwendet, um die Merkmale einzelner Zellen interaktiv zu visualisieren. Die Streudiagramme positionieren ähnliche Objekte in unmittelbarer Nähe. So kann eine große Gruppe ähnlicher Fehler mit wenigen Mausklicks erkannt und korrigiert werden, und damit die manuellen Eingriffe auf ein Minimum reduziert werden. Die Heatmap ist darauf ausgerichtet, alle übersehenen Fehler aufzudecken und den Benutzern dabei zu helfen, bei der Zellabstammungsrekonstruktion schrittweise die perfekte Genauigkeit zu erreichen. Die quantitative Auswertung zeigt, dass eDetect die Genauigkeit der Nachverfolgung innerhalb eines akzeptablen Zeitfensters erheblich verbessern kann. Beurteilt nach biologisch relevanten Metriken, übertrifft die Leistung von eDetect die derer Tools, die den Wettbewerb ‘Cell Tracking Challenge’ gewonnen haben. / Live cell imaging based on time-lapse microscopy has been used to study dynamic cellular behaviors, such as cell cycle, cell signaling and transcription. Extracting cell lineage trees out of a time-lapse video requires cell segmentation and cell tracking. For long term live cell imaging, data analysis errors are particularly fatal. Even an extremely low error rate could potentially be amplified by the large number of sampled time points and render the entire video useless. In this work, we adopt a straightforward but practical design that combines the merits of manual and automatic approaches. We present a live cell imaging data analysis tool `eDetect', which uses post-editing to complement automatic segmentation and tracking. What makes this work special is that eDetect employs multiple interactive data visualization modules to guide and assist users, making the error detection and correction procedure rational and efficient. Specifically, two scatter plots and a heat map are used to interactively visualize single cells' visual features. The scatter plots position similar results in close vicinity, making it easy to spot and correct a large group of similar errors with a few mouse clicks, minimizing repetitive human interventions. The heat map is aimed at exposing all overlooked errors and helping users progressively approach perfect accuracy in cell lineage reconstruction. Quantitative evaluation proves that eDetect is able to largely improve accuracy within an acceptable time frame, and its performance surpasses the winners of most tasks in the `Cell Tracking Challenge', as measured by biologically relevant metrics.