Optogenetics is a method to control the cell activity with light by expression of a natural or engineered photoreceptor via genetic modification technology. Optogenetics early success came with the light-gated cation channel "Channelrhodopsin-2" in neurons and expanded from neuroscience to other research fields such as cardiac research and cell signaling, also due to the enrichment by new photoreceptors. In this study, I focus on searching and characterizing new photoreceptors to expand the optogenetic tool box. In this work I characterize three newly discovered microbial rhodopsins and some engineered mutants of them. The first rhodopsin is a proton pump from the diatom Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis Rhodopsin or abbreviated: FR. I cloned the full-length FR and proved it to be a light-activated proton pump with high efficacy in comparison to Bacteriorhodopsin (BR). During this study, I also developed a new method to improve the plasma membrane targeting of several microbial rhodopsins. I also obtained a FR mutant (channel-like FR or chFR) which behaves like a light-gated proton channel. FR can be used for optogenetic hyperpolarization or alkalization of a cell while the chFR could be used for depolarization or lowering of the cellular pH. The induction of FR expression under iron-limited conditions in the diatom indicated an alternative energy generation mechanism of F. cylindrus when iron-containing enzymes are scarce. I then characterized a new microbial rhodopsin with novel light-regulated Guanylyl Cyclase (GC) activity. This rhodopsin guanylyl cyclase from the fungus Blastocladiella emersonii (B.e. CyclaseOpsin or BeCyclOp) has been proven by me to be an efficient light-gated GC with high specificity and fast kinetics. BeCyclOp also has a novel structure with eight transmembrane helices, containing a long cytosolic N-terminus which participates in the tight regulation of the GC activity. In collaboration with Prof. Alexander Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.), BeCyclOp has been tested in muscle cells and sensory neurons of Caenorhabditis elegans and proven to be a powerful optogenetic tool in a living animal. I also generated a BeCyclOp mutant with enhanced light sensitivity. Already more than ten years ago, guanylyl cyclase rhodopsins were suggested to exist in Chlamydomonas reinhardtii by analyzing genomic sequence data. But until now no functional proof existed. By further cloning and sequencing I discovered such a rhodopsin with light-regulated guanylyl cyclase activity. This functional Cyclaseopsin (COP6c) is quite different to BeCyclOp, as it was proven to be a light-inhibited GC. Cop6c is much larger than BeCyclOp with a His-Kinase and a response regulator domain between the rhodopsin and the cyclase domain. I also introduced a new strategy for generating optogenetic tools by fusing the photoactivated adenylyl cyclase bPAC to two different CNG channels. These new tools function via light-gated cAMP production and subsequent CNG channel activation. These tools combined the properties of bPAC (highly sensitive to blue light) and CNG channels (high single-channel conductance and high Ca2+ permeability), as demonstrated by expression in Xenopus oocytes. As a further benefit the fusing of bPAC to CNG channels leads to a bPAC with a more than tenfold reduced dark activity which is a valuable improvement for bPAC itself as an optogenetic tool. / Als Optogenetik wird die Technik bezeichnet, durch genetische Veränderung Photorezeptoren in Zellen einzubringen, um die Zellaktivität mit Licht zu steuern. Frühe Erfolge der Optogenetik wurden mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal "Channelrhodopsin-2" in Neuronen von lebenden Tieren erzielt. Die Anwendung erweiterte sich von den Neurowissenschaften zu anderen Forschungsfeldern, wie Herzforschung und Zellbiologie, auch durch die Bereicherung mit neuen Photorezeptoren. Hier konzentriere ich mich auf die Suche und Charakterisierung neuer Photorezeptoren. In dieser Arbeit werden drei neu entdeckte, natürliche mikrobielle Rhodopsine, sowie ausgewählte Mutanten, charakterisiert. Das erste Rhodopsin ist eine Protonenpumpe aus der Kieselalge (Diatomee) Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis-Rhodopsin, abgekürzt FR. Ich klonierte FR und bewies, dass FR eine Licht-aktivierte Protonenpumpe mit hoher Wirksamkeit ist. In dieser Studie zeige ich auch eine Methode, um die Plasmamembran-Lokalisation von FR und mehreren anderen Rhodopsinen zu verbessern. Ich identifizierte eine FR-Mutante (chFR), die sich wie ein Licht-gesteuerter Protonenkanal verhält. FR kann für die Licht-gesteuerte Hyperpolarisation oder Alkalisierung der Zelle verwendet werden, während chFR möglicherweise verwendet werden könnte, um den zellulären pH Licht-gesteuert abzusenken. Die Induktion der FR-Expression unter Eisenmangel-Bedingungen legt einen neuen Energieerzeugungsmechanismus von F. cylindrus nahe, wenn Eisen-haltige Enzyme in den Chloroplasten fehlen. Ich habe dann ein neues mikrobielles Rhodopsin mit Licht-geregelter Guanylylcyclase (GC) Aktivität untersucht. Für dieses Cyclaseopsin aus dem Pilz Blastocladiella emersonii (BeCyclOp) konnte ich zeigen, dass es sich um eine effiziente lichtgesteuerte GC mit hoher Spezifität und schneller Kinetik handelt. BeCyclOp hat eine für ein Opsin neuartige Struktur mit acht Transmembranhelices. Für den langen cytosolischen N-Terminus zeigte ich eine Beteiligung an der Regulierung der GC-Aktivität. BeCyclOp wurde im Labor von Prof. A. Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.) in den Muskelzellen und sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans getestet und erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in optogenetisch veränderten, lebenden Tieren. Ich habe dann auch eine BeCyclOp Mutante mit verbesserter Lichtempfindlichkeit hergestellt. Bereits vor über zehn Jahren wurden anhand genomischer Daten Guanylylcyclase-Rhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii postuliert, konnten aber funktionell bisher nicht nachgewiesen werden. Durch Klonieren von verschiedenen Chlamydomonas reinhardtii Stämmen gelang es mir, solch ein Opsin (Cop6c) zu entdecken, dessen Guanylylcyclase-Aktivität eindeutig Licht-reguliert ist. COP6c ist ganz anders als BeCyclOp, nicht nur weil die GC-Aktivität durch Licht inhibiert wird. Außerdem ist Cop6c ein viel größeres Protein mit einer zusätzlichen His-Kinase-, sowie einer Transducer-Domäne zwischen der Rhodopsin- und der Cyclase-Domäne. Schlussendlich zeige ich auch eine neue Strategie zur Erzeugung von optogenetischen Werkzeugen durch Fusion der Licht-aktivierten Adenylyl-Cyclase (AC) bPAC mit CNG-Kanälen. Diese neuen "Werkzeuge" funktionieren über Licht-gesteuerte cAMP-Produktion und die anschließende Aktivierung eines cAMP-sensitiven Kationen-(CNG-) Kanals. Hierbei werden die positiven Eigenschaften von bPAC (sehr empfindlich auf blaues Licht) und CNG-Kanälen (hohe Leitfähigkeit bei hoher Ca2+-Durchlässigkeit) kombiniert. Darüber hinaus konnte ich demonstrieren, dass die Fusion der bPAC an den CNG-Kanal zu einer bPAC mit stark reduzierter AC-Aktivität im Dunkeln führte, was allein schon eine gute Verbesserung der bPAC als optogenetische Werkzeug ist.

The technique to manipulate cells or living animals by illumination after gene transfer of light-sensitive proteins is called optogenetics. Successful optogenetics started with the use of the light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2). After early demonstrations of the power of ChR2, further light-sensitive ion channels and ion pumps were recruited to the optogenetic toolbox. Furthermore, mutations and chimera of ChR2 improved its versatility. However, there is still a need for improved optogenetic tools, e.g. with higher permeability for calcium or better expression in the plasma membrane. In this thesis, my work focuses on the design of highly functional channelrhodopsins with enhanced Na+ and Ca2+ conductance. First, I tested different N-terminal signal peptides to improve the plasma membrane targeting of Channelrhodopsins. We found that a N-terminal peptide, named LR, could improve the plasma membrane targeting of many rhodopsins. Modification with LR contributed to three to ten-fold larger photocurrents (than that of the original version) of multiple channelrhodopsins, like ChR2 from C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs, and the light-activated pump rhodopsins KR2, Jaw, HR. Second, by introducing point mutation, I could further improve the light sensitivity and photocurrent of different channelrhodopsins. For instance, ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 and PsChR D139H 2.0 exhibited hundred times larger photocurrents than wild type ChR2 and they show high light sensitivity. Also, the Ca2+ permeable channelrhodopsins PsCatCh 2.0f and PsCatCh 2.0e show very large photocurrents and fast kinetics. In addition, I also characterized a novel bi-stable CeChR (from the acidophilic green alga Chlamydomonas eustigma) with a much longer closing time. Third, I analysed the ion selectivity of different ChRs, which provides a basis for rational selection of channelrhodopsins for different experimental purposes. I demonstrate that ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff and CeChR are highly proton conductive, compared with wild type PsChR. Interestingly, Chronos has the lowest potassium conductance among these channelrhodopsins. Furthermore, I found that mutation of an aspartate in TM4 of ChR2 (D156) and PsChR (D139) to histidine obviously increased both the sodium and calcium permeability while proton conductance was reduced. PsChR D139H 2.0 has the largest sodium conductance of any published channelrhodopsin variants. Additionally, I generated PsCatCh 2.0e which exhibits a ten-fold larger calcium current than the previously reported Ca2+ transporting CrChR2 mutant CatCh. In summary, my research work 1.) described strategies for improving plasma membrane trafficking efficiency of opsins; 2.) yielded channelrhodopsins with fast kinetics or high light sensitivity; 3.) provided optogenetic tools with improved calcium and sodium conductance. We could also improve the performance of channelrhodopsins with distinct action spectra, which will facilitate two-color neural excitation, both in-vitro and in-vivo. / Die Technik, Zellen oder lebende Tiere nach dem Gentransfer lichtempfindlicher Proteine durch Belichtung zu manipulieren, wird als Optogenetik bezeichnet. Erfolgreiche Optogenetik begann mit der Verwendung des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2). Nach frühen erfolgreichen Versuchen mit ChR2 wurden weitere lichtempfindliche Ionenkanäle und Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge etabliert. Darüber hinaus verbesserten Mutationen und Chimären von ChR2 seine Vielseitigkeit. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an verbesserten optogenetischen Werkzeugen, z. mit höherer Permeabilität für Calcium oder besserer Expression in der Plasmamembran. In dieser Arbeit beschäftige ich mich mit dem Design hochfunktioneller Channelrhodopsine mit verbesserter Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit. Zuerst habe ich verschiedene N-terminale Signalpeptide getestet, um die Anreicherung von Channelrhodopsinen in der Plasmamembran (“Plasmamembran-Targeting”) zu verbessern. Wir fanden heraus, dass ein N-terminales Peptid namens LR das Plasmamembran-Targeting vieler Rhodopsine verbessern kann. Die Modifikation mit LR trug zu drei- bis zehnfach größeren Photoströmen (als die der Originalversion) von mehreren Channelrhodopsinen bei, wie ChR2 von C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs und der lichtaktivierten Pump-Rhodopsine KR2, Jaw, HR. Zweitens konnte ich durch Mutagenese die Lichtempfindlichkeit und/oder den Photostrom verschiedener Channelrhodopsine weiter verbessern. Beispielsweise zeigten ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 und PsChR D139H 2.0 hundertmal größere Photoströme als Wildtyp-ChR2 und sie zeigen eine hohe Lichtempfindlichkeit. Auch die Ca2+-permeablen Kanalrhodopsine PsCatCh 2.0f und PsCatCh 2.0e zeigen sehr große Photoströme und eine schnelle Kinetik. Außerdem habe ich ein neues bistabiles CeChR (aus der azidophilen Grünalge Chlamydomonas eustigma) mit einer viel längeren Schließzeit charakterisiert. Drittens analysierte ich die Ionenselektivität verschiedener ChRs, die eine Grundlage für die rationale Selektion von Channelrhodopsinen für verschiedene experimentelle Zwecke bietet. Ich zeige, dass ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff und CeChR im Vergleich zu Wildtyp-PsChR eine hohe Protonenleitfähigkeit aufweisen. Interessanterweise weist Chronos die niedrigste Kaliumleitfähigkeit unter diesen Channelrhodopsinen auf. Außerdem fand ich, dass die Mutation eines Aspartats in TM4 von ChR2 (D156) und PsChR (D139) zu Histidin offensichtlich sowohl die Natrium- als auch die Calciumpermeabilität erhöht, während die Protonenleitfähigkeit verringert ist. PsChR D139H 2.0 weist die größte Natriumleitfähigkeit aller veröffentlichten Channelrhodopsin-Varianten auf. Zusätzlich erzeugte ich PsCatCh 2.0e, das einen zehnmal größeren Calciumstrom als die zuvor berichtete Ca2+-transportierende CrChR2-Mutante CatCh aufweist. Zusammenfassend ergab meine Dissertationsarbeit: 1.) Strategien zur Verbesserung der Expression von Opsinen in der Plasmamembran; 2.) Gut exprimierende Channelrhodopsine mit schneller Kinetik oder hoher Lichtempfindlichkeit; 3.) Neue optogenetische Werkzeuge mit verbesserter Calcium- und Natriumleitfähigkeit. Auch konnte ich die Leistung von Channelrhodopsinen mit unterschiedlichen Aktionsspektren verbessern, was die zweifarbige neuronale Anregung sowohl in vitro als auch in vivo erleichtern sollte.

Platelets play an essential role in haemostasis. Through granule secretion of second wave mediators and aggregation, they secure vascular integrity. Due to incorrect activation, platelet aggregation and subsequent thrombus formation can cause blood vessel occlusion, leading to ischemia. Patients with defects in platelet production have a low platelet count (thrombocytopenia), which can cause an increased bleeding risk. In vitro platelet generation is still in its development phase. So far, no convincing results have been obtained. For this reason, the health care system still depends on blood donors. Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes (MKs), which extend long cytoplasmic protrusions, designated proplatelets, into sinusoidal blood vessels. Due to shear forces, platelets are then released into the bloodstream. The molecular mechanisms underlying platelet production are still not fully understood. However, a more detailed insight of this biological process is necessary to improve the in vitro generation of platelets and to optimise treatment regimens of patients. Optogenetics is defined as “light-modulation of cellular activity or of animal behaviour by gene transfer of photo-sensitive proteins”. Optogenetics has had a big impact on neuroscience over the last decade. The use of channelrhodopsin 2 (ChR2), a light-sensitive cation channel, made it possible to stimulate neurons precisely and minimally invasive for the first time. Recent developments in the field of optogenetics intend to address a broader scope of cellular and molecular biology. The aim of this thesis is to establish optogenetics in the field of MK research in order to precisely control and manipulate MK differentiation. An existing “optogenetic toolbox“ was used, which made it possible to light-modulate the cellular concentration of specific signalling molecules and ion conductance in MKs. Expression of the bacterial photoactivated adenylyl cyclase (bPAC) resulted in a significant increase in cAMP concentration after 5 minutes of illumination. Similarly, intracellular cGMP concentrations in MKs expressing photoactivated guanylyl cyclase (BeCyclop) were elevated. Furthermore, proplatelet formation of MKs expressing the light-sensitive ion channels ChR2 and anion channelrhodopsin (ACR) was altered in a light-dependent manner. These results show that MK physiology can be modified by optogenetic approaches. This might help shed new light on the underlying mechanisms of thrombopoiesis. / Thrombozyten sind für die primäre Hämostase verantwortlich und unterstützen die Blutgerinnung. Durch ihre Aggregation und die Synthese bzw. Freisetzung von in Granula gespeicherten second wave Mediatoren, sichern sie die Integrität der Blutgefäße. Werden Thrombozyten fälschlicherweise aktiviert, kann es zu einem Gefäßverschluss durch Thrombusbildung mit daraus resultierender Ischämie kommen. Patienten mit einer defekten Thrombozytopoese weisen eine reduzierte Thrombozytenzahl (Thrombozytopenie) auf, die mit einer erhöhten Blutungsneigung assoziiert ist. Bisher gibt es keine überzeugenden Ansätze, die eine Thrombozytenproduktion in vitro ermöglichen. Aus diesem Grund ist das Gesundheitswesen, in der Versorgung der bedürftigen Patienten mit Thrombozytenkonzentraten, auf Blutspender angewiesen. Thrombozyten werden im Knochenmark von ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs) produziert. Diese bilden lange zytoplasmatische Fortsätze aus, die Proplättchen genannt werden. Durch die Scherkräfte des Blutstroms in den sinuosoidalen Blutgefäßen, schnüren sich Thrombozyten von den Proplättchen ab. Bisher sind die molekularen Prozesse der Thrombozytenproduktion noch weitgehend unverstanden. Ein besseres Verständnis des Vorgangs ist die Voraussetzung für eine Weiterentwicklung der in vitro Thrombozytengenerierung und einer optimierten Patientenbehandlung. Unter Optogenetik versteht man die Übertragung lichtempfindlicher Proteine in zuvor nicht lichtempfindliche Zellen. Dadurch wird eine nicht-invasive Beeinflussung von Zellvorgängen oder des Verhaltens von Tieren durch Licht ermöglicht. Das Feld der Optogenetik, besonders der lichtempfindliche Kanal Channelrhodopsin 2 (ChR2), hatte einen großen Einfluss auf die neuronale Forschung. Durch ihn war es möglich, Neuronen gezielt nicht-invasiv zu aktivieren und Kreisläufe zu untersuchen. Mittlerweile wurde das Spektrum auf eine Vielzahl von Forschungsgebieten und Zelltypen ausgeweitet. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Methoden der Optogenetik in MKs zu etablieren. Dadurch soll ein Weg gefunden werden, die Megakaryozytenreifung gezielt zu kontrollieren bzw. zu manipulieren. Die bereits vorhandene „optogenetische Toolbox“ wurde verwendet, um die intrazellulären Konzentrationen bestimmter Signalmoleküle und Ionen in MKs zu verändern. Durch die Expression der bakteriellen fotoaktivierbaren Adenylatzyklase (bPAC), wurde die cAMP Konzentration nach 5 min Lichtgabe signifikant erhöht. Ebenfalls ist es durch die Expression der fotoaktivierbaren Guanylatzyklase (BeCyclop) gelungen, die intrazelluläre cGMP Konzentration in MKs durch Belichtung zu erhöhen. Darüber hinaus konnte der Vorgang der Proplättchenformierung in MKs, welche die lichtempfindlichen Ionenkanäle ChR2 und Anion Channelrhodopsin (ACR) exprimierten, durch Licht beeinflusst werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Beeinflussung der Megakaryozytenphysiologie durch Optogenetik möglich ist. Die Erkenntnisse können dazu beitragen, die Vorgänge der Thrombozytopoese in Zukunft besser zu verstehen.

This study solved the limitations for apply rhodopsin-based optogenetics in plant science. The lack of the essential cofactor retinal, required for the functional expression of rhodopsin, was introduced into plant system by using a β-carotene 15, 15’-Dioxygenase (MbDio). Another big step toward rhodopsin-based plant optogenetics was to enhance the cellular shuttling of the rhodopsin to the plasma membrane by fusing several targeting peptides to the protein. The role of anion fluxes in regulating pollen tube growth was verified by rhodopsins application. ACR1 2.0 was used to trigger anion efflux-based depolarizations. The growth of the pollen tubes was suppressed upon ACR1 stimulation but recovered when ACR1 2.0 was deactivated. Local laser light application on one side of the apex of the ACR1-expressing pollen tubes resulted in the guidance of pollen tubes away from the site of ACR1 2.0 activation. Local anion efflux or voltage depolarization control pollen tube growth and/or guidance. [Ca2+]cyt functions as a second messenger to control plant processes and thus we used XXM 2.0 to trigger non-invasively a [Ca2+]cyt increase. Only the anion efflux by ACR1 2.0 stimulation triggered drought stress responses. In contrast to ACR1 2.0, the stimulation of XXM 2.0 triggered a pathogen defense response. Taken together, this novel rhodopsin-based optogenetic approach represents a perfect non-invasive research method to study complex signaling networks in plant science. / In dieser Studie wurden die Beschränkungen für die Anwendung der rhodopsinbasierten Optogenetik in der Pflanzenwissenschaft gelöst. Das Fehlen des essentiellen Cofaktors Retinal, der für die funktionelle Expression von Rhodopsin erforderlich ist, wurde durch die Verwendung einer β-Carotin 15, 15'-Dioxygenase (MbDio) in das Pflanzensystem eingeführt. Ein weiterer großer Schritt auf dem Weg zu einer auf Rhodopsin basierenden pflanzlichen Optogenetik war die Verbesserung des zellulären Shuttles des Rhodopsins zur Plasmamembran durch die Fixierung mehrerer Targeting-Peptide an das Protein. Die Rolle der Anionenflüsse bei der Regulierung des Wachstums der Pollenschläuche wurde durch die Anwendung von Rhodopsinen verifiziert. ACR1 2.0 wurde verwendet, um Depolarisationen auf der Basis von Anionen-Efflux auszulösen. Das Wachstum der Pollenschläuche wurde durch die ACR1-Stimulation unterdrückt, erholte sich aber wieder, wenn ACR1 2.0 deaktiviert wurde. Lokale Laserlichtapplikation auf einer Seite des Apex der ACR1-exprimierenden Pollenschläuche führte dazu, dass die Pollenschläuche von der Stelle der ACR1 2.0-Aktivierung weggelenkt wurden. Lokaler Anionen-Efflux oder Spannungsdepolarisation steuern das Wachstum und/oder die Führung der Pollenschläuche. [Ca2+]cyt fungiert als zweiter Botenstoff zur Steuerung pflanzlicher Prozesse, weshalb wir XXM 2.0 verwendeten, um nicht-invasiv einen [Ca2+]cyt-Anstieg auszulösen. Nur der Anionen-Efflux durch die ACR1 2.0-Stimulation löste Trockenstress-Reaktionen aus. Im Gegensatz zu ACR1 2.0 löste die Stimulierung von XXM 2.0 eine Pathogenabwehrreaktion aus. Insgesamt stellt dieser neuartige optogenetische Ansatz auf Rhodopsin-Basis eine perfekte nicht-invasive Forschungsmethode zur Untersuchung komplexer Signalnetzwerke in der Pflanzenwissenschaft dar.

Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s. The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network. The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all. / Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken. Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen.

Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions. / Seit dem Channelrhodopsine das erste Mal beschrieben und erfolgreich in lebende Tiere eingebracht wurden (Nagel et al., 2003 und 2005), kam es zu einem beträchtlichen Fortschritt in diesem interessanten Gebiet der Neurowissenschaften. In der nachfolgenden Zeit wurden viele verschiedene optogenetische Werkzeuge beschrieben und zur Bearbeitung neurowissenschaftlicher Fragestellungen angewandt. Des Weiteren haben neben dem „klassischen“ Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein im Wesentlichen Kation selektiver Kanal, auch modifizierte ChR2 Abkömmlinge, Anion selektive Kanäle und Licht sensitive metabotrope Proteine, die opotogenetische Werkzeugkiste erweitert. Dennoch greifen die meisten Wissenschaftler trotz der Vielfalt an optogenetischen Werkzeugen meist noch zu Channelrhodopsin-2, da seine Wirkungseigenschaften sehr gut erforscht sind. In der nachfolgenden Arbeit wird ein weiterentwickeltes Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), beschrieben. Aufgrund seiner vielfältigen Eigenschaften stellt es ein vielversprechendes Werkzeug dar, vor allem für zukünftige neurowissenschaftliche Forschungsarbeiten. Hierbei wurde ChR2XXM eingesetzt, um zu untersuchen welche Auswirkungen das Fehlen von Latrophilin im Chordotonal Organ von Drosophilalarven hat. Schließlich wurde noch die Funktionalität von GtACR an der neuromuskulären Endplatte der Drosophila überprüft. Für die umfassende Charakterisierung wurden elektrophysiologische und verhaltensbasierte Experimente an Larven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ChR2XXM aufgrund einer erhöhten Affinität zu dem Chromophore Retinal, im Vergleich zu ChR2 ein besseres zelluläres Expressionsmuster, eine bessere zeitliche Auflösung und eine erheblich höhere Lichtsensitiviät aufweist. Durch den Einsatz von ChR2XXM konnte, aufgrund der hohen Lichtsensitiviät, mit nur minimalen Nebeneffekten, wie z.B. mögliche Wärmeaktivierung des Chordotonalorgans, der Einfluss von Latrophilin (dCIRL) auf die Signaltransmission im Chordotonalorgan, aufgeklärt werden. Ferner führte eine optogenetische, in vivo, Aktivierung des Chordotonalorgans zu Verhaltensänderungen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass GtACR1 zwar effektiv motoneuronale Erregung inhibieren kann, dies aber von unerwarteten Nebeneffekten begleitet wird. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass weitere Forschung und Verbesserungen im Bereich der optogenetischen Werkzeuge sehr wertvoll und notwendig ist, um Wissenschaftlern zu erlauben das am besten geeignetste optogenetische Werkzeug für ihre wissenschaftlichen Fragestellungen auswählen zu können.

The mammalian central clock, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, controls circadian rhythms in behaviour such as the sleep-wake cycle. It is made up of approximately 20,000 heterogeneous neurons that can be classified by their expression of neuropeptides. There are three major populations: AVP neurons (arginine vasopressin), VIP neurons (vasoactive intestinal peptide), and GRP neurons (gastrin releasing peptide). How these neuronal clusters form functional units to govern various aspects of rhythmic behavior is poorly understood. At a molecular level, biological clocks are represented by transcriptional-posttranslational feedback loops that induce circadian oscillations in the electrical activity of the SCN and hence correlate with behavioral circadian rhythms. In mammals, the sleep wake cycle can be accurately predicted by measuring electrical muscle and brain activity. To investigate the link between the electrical activity of heterogeneous neurons of the SCN and the sleep wake cycle, we optogenetically manipulated AVP neurons in vivo with SSFO (stabilized step function opsin) and simultaneously recorded an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely moving mice. SSFO-mediated stimulation of AVP positive neurons in the anterior hypothalamus increased the total amount of wakefulness during the hour of stimulation. Interestingly, this effect led to a rebound in sleep in the hour after stimulation. Markov chain sleep-stage transition analysis showed that the depolarization of AVP neurons through SSFO promotes the transition from all states to wakefulness. After the end of stimulation, a compensatory increase in transitions to NREM sleep was observed. Ex vivo, SSFO activation in AVP neurons causes depolarization and modifies the activity of AVP neurons. Therefore, the results of this thesis project suggest an essential role of AVP neurons as mediators between circadian rhythmicity and sleep-wake behaviour. / Die zentrale Uhr von Säugetieren, die sich im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des vorderen Hypothalamus befindet, steuert zirkadiane Verhaltensrhythmen wie den Schlaf-Wach-Rhythmus. Sie besteht aus etwa 20.000 heterogenen Neuronen, die nach ihrer Expression von Neuropeptiden klassifiziert werden können. Es gibt drei große Populationen: AVP-Neuronen, VIP-Neuronen und GRP-Neuronen. Wie diese Neuronengruppen funktionelle Einheiten bilden, um verschiedene Aspekte des rhythmischen Verhaltens zu steuern, ist nur unzureichend bekannt. Bei Säugetieren kann der Schlaf-Wach-Zyklus durch Messung der elektrischen Muskel- und Gehirnaktivität genau vorhergesagt werden. Um den Zusammenhang zwischen der elektrischen Aktivität heterogener Neuronen des SCN und dem Schlaf-Wach-Zyklus zu untersuchen, wurden AVP-Neuronen in vivo mit SSFO optogenetisch manipuliert und gleichzeitig ein Elektroenzephalogramm (EEG) und ein Elektromyogramm (EMG) bei frei beweglichen Mäusen aufgezeichnet. Die SSFO-vermittelte Stimulation von AVP-positiven Neuronen im vorderen Hypothalamus erhöhte den Gesamtanteil der Wachheit während der Stunde der Stimulation. Interessanterweise führte dieser Effekt zu einem Ansteigen des Schlafes in der Stunde nach der Stimulation. Eine Markov-Ketten-Analyse der Schlafphasenübergänge zeigte, dass die Depolarisierung der AVP-Neuronen durch SSFO den Übergang von allen Zuständen zum Wachsein fördert. Nach dem Ende der Stimulation wurde ein kompensatorischer Anstieg der Schlafphasenübergänge zum NREM-Schlaf beobachtet. Ex vivo verursachte die SSFO-Aktivierung in AVP-Neuronen eine Depolarisation und veränderte die Aktivität der AVP-Neuronen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit könnten auf die Rolle der AVP-Neuronen als Vermittler zwischen zirkadianer Rhythmik und Schlaf-Wach-Verhalten hinweisen.

Blood platelets are produced by bone marrow megakaryocytes (MKs). To produce platelets, mature MKs adjacent to sinusoidal blood vessels need to polarize and extend proplatelets into the vessel lumen, where platelet-like fragments are released. However, the comprehensive understanding regarding the molecular mechanisms underlying MK differentiation, maturation and polarization is still very limited, partly attributable to the lack of appropriate research tools. Optogenetics is a method used for spatiotemporal manipulation of cellular activity or animal behavior, which involves expressing light-sensitive proteins into cells of interest and activating them with light. In this thesis, optogenetics was established in MKs for the first time to investigate the spatiotemporal role of Ca2+ as well as phosphodiesterases (PDE) within bone marrow-derived MKs. In the first part of the work, a novel, photo-activatable, high-calcium permeable cation channel channelrhodopsin, ChR2 XXM2.0, was utilized to investigate the spatiotemporal role of Ca2+ in MK function. After transduction, ChR2 XXM2.0 expression was observed in the demarcation membrane system and the plasma membrane of MKs. Its functionality was validated by whole-cell patch-clamp and Ca2+ imaging. Localized illumination of the peripheral region of ChR2 XXM2.0 expressing MKs triggered MK polarized movement, which was dependent on local calcium influx, integrin αIIbβ3-fibrinogen binding, Cdc42, and myosin IIA activity. This finding hints at a previously unknown mechanism underlying MK polarization at sinusoidal blood vessels. In addition, the successful application of ChR2 XXM2.0 in MKs makes ChR2 XXM2.0 a promising optogenetic tool to manipulate subcellular calcium dynamics not only in MKs but also in other cell types. In the second part of the work, bone marrow-derived MKs were transduced with either the photo-activated guanylyl cyclase, known as Blastocladiella emersonii Cyclase opsin (BeCyclOp), or the bacterial photoactivated adenylyl cyclase (bPAC) to enable precise light-modulation of cGMP or cAMP levels, respectively. After 5 min illumination, BeCyclOp-MKs showed a significantly increased cGMP concentration, but it decreased quickly to the basal line within 3 min after illumination. By using phosphodiesterase (PDE) 5 inhibitors, cGMP level was further increased within 5 min illumination and the decrease was inhibited within 3 min after illumination. These data strongly suggests that PDE5 is the major cGMP hydrolyzing PDE in MKs. Similarly, bPAC-MKs exhibited a notable rise in cAMP concentration after illumination, which was partially dependent on PDE3 activity. Interestingly, PDE5 inhibitors partially prevented rapid cAMP hydrolysis after illumination of bPAC expressing MKs. The treatment of MKs with riociguat not only increased cGMP level, but also significantly elevated the cAMP level, pointing to a cAMP and cGMP crosstalk signaling in MKs. This thesis demonstrates the successful temporal manipulation of cAMP and cGMP levels in bone marrow-derived MKs by optogenetic tools, opening a new avenue for investigating the spatiotemporal functions of cAMP and cGMP in MK biology, platelet biogenesis, and platelet function. / Thrombozyten werden von Knochenmark-Megakaryozyten (MKs) produziert. Um Thrombozyten zu erzeugen, müssen reife MKs, die sich neben den sinusoidalen Blutgefäßen befinden, polarisieren und Proplättchen in das Gefäßlumen ausbilden, wo Thrombozyten-ähnliche Fragmente freigesetzt werden. Das umfassende Verständnis der molekularen Mechanismen, die der MK-Differenzierung, Reifung und Polarisierung zugrunde liegen, ist jedoch immer noch sehr begrenzt, teilweise aufgrund des Fehlens geeigneter Forschungswerkzeuge. Optogenetik ist eine Methode zur räumlich-zeitlichen Manipulation der zellulären Aktivität oder des Verhaltens von Tieren, die darin besteht lichtempfindliche Proteine in Zellen einzubringen und sie mit Licht zu aktivieren. In dieser Arbeit wurde erstmals Optogenetik in MKs etabliert, um die räumlich-zeitliche Rolle von Ca2+ sowie von Phosphodiesterasen (PDE) in MKs zu untersuchen. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein neuartiger Kationenkanal namens Channelrhodopsin ChR2 XXM2.0 verwendet, der durch Licht aktiviert wird und eine hohe Durchlässigkeit für Ca2+ Ionen aufweist, um die räumlich-zeitliche Rolle von Ca2+ in der MK-Funktion zu untersuchen. Nach der Transduktion wurde die Expression von ChR2 XXM2.0 in dem Demarkationsmembransystem und der Plasmamembran von MKs beobachtet. Die Funktionalität wurde mittels whole-cell patch-clamp und Ca2+ -Bildgebung validiert. Die gezielte Beleuchtung des peripheren Bereichs von ChR2 XXM2.0-expressierenden MKs löste eine polarisierte Bewegung der MKs aus, die von einem lokalen Kalziumeinstrom, der Bindung von Integrin αIIbβ3 an Fibrinogen, und der Cdc42 sowie der Myosin-IIA Aktivität abhängig war. Dieser Befund deutet auf einen bisher unbekannten Mechanismus hin, der der Polarisierung von MKs an den sinusoidalen Blutgefäßen zugrunde liegt. Darüber hinaus macht die erfolgreiche Anwendung von ChR2 XXM2.0 in MKs es zu einem vielversprechenden optogenetischen Werkzeug, um die subzelluläre Dynamik von Ca2+ nicht nur in MKs, sondern auch in anderen Zelltypen zu manipulieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Knochenmark-kultivierte MKs mit entweder einer photoaktivierbaren Guanylylcyclase, bekannt als Blastocladiella emersonii Cyclase Opsin (BeCyclOp), oder einer photoaktivierbaren Adenylylcyclase (bPAC) transduziert, um eine präzise Lichtmodulation der cGMP- oder cAMP-Spiegel zu ermöglichen. Nach einer 5- minütigen Beleuchtung zeigten BeCyclOp-MKs eine signifikant erhöhte cGMP Konzentration, die jedoch innerhalb von 3 Minuten nach der Beleuchtung schnell auf den Basalwert abfiel. Durch die Verwendung von PDE5 Inhibitoren wurde der cGMP-Spiegel innerhalb von 5 Minuten nach der Beleuchtung weiter erhöht und der Abfall innerhalb von 3 Minuten nach der Beleuchtung gehemmt. Diese Daten legen nahe, dass PDE5 die cGMP-hydrolysierende PDE in MKs ist. Ähnlich zeigten bPAC-MKs nach der Beleuchtung einen bemerkenswerten Anstieg der cAMP-Konzentration, der teilweise von der PDE3- Aktivität abhängig war. Interessanterweise, verhinderten PDE5 Inhibitoren teilweise den schnellen Abbau von cAMP nach Beleuchtung von bPAC exprimierenden MKs. Die Behandlung von Riociguat in MKs führte nicht nur zu einem Anstieg des cGMP-Spiegels, sondern auch zu einer signifikanten Erhöhung des cAMP-Spiegels, was auf eine Wechselwirkung zwischen cAMP und cGMP in MKs hindeutet. Diese Arbeit zeigt die erfolgreiche zeitliche Manipulation von cAMP und cGMP in MKs mithilfe von optogenetischen Werkzeugen und eröffnet einen neuen Weg zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Funktionen von cAMP und cGMP in der MK-Biologie, der Thrombozytenbiogenese und der Thrombozytenfunktion.

In vielen Anwendungsgebieten der Lasermesstechnik kann eine adaptive örtliche und zeitliche Lichtfeldformung völlig neue Perspektiven eröffnen. In der Optogenetik sind beispielsweise sowohl schnell in drei Dimensionen adressierbare Einzelpunkte mit einem maximalen Durchmesser von 10 μm für die Stimulation einzelner Zellen als auch komplexe Muster für die Aktivierung oder Inhibierung ganzer Zellgruppen notwendig, um fortgeschrittene Analysen neuronaler Netzwerke durchzuführen. Computergenerierte Hologramme (CGH) sind durch die vielseitigen Möglichkeiten der Amplituden- und Phasenmodulation für die Mustererzeugung am besten geeignet. Zur Darstellung von CGH weit verbreitete Flüssigkristall-Flächenlichtmodulatoren besitzen oft eine Megapixelauflösung aber eine Bildrate von nur wenigen Hertz. Durch Innovationen im Consumer-Bereich stehen mit mikroelektromechanischen Scannerspiegeln und ferroelektrischen binären Phasenmodulatoren neuartige Bauelemente zur Verfügung, die gleichzeitig hohe Orts- und Zeitauflösung vereinen. Aufbauend auf solchen Geräten mit 250 Hz bzw. 1,7 kHz Bildrate wurden in dieser Arbeit computergestützte adaptive optische Systeme für den Bereich des lasergenerierten Ultraschalls sowie für die Optogenetik entwickelt und angewendet. Anhand von Computersimulationen wurden Methoden zur schnellen Erzeugung binärer Phasenhologramme verglichen. Für Fresnelhologramme führt eine Fehlerdiffusionsmethode zu rekonstruierten Bildern ähnlicher der gewünschten Intensitätsverteilung und ist dabei mehr als 10× schneller als die zweitbeste Methode, welche auf dem Gerchberg-Saxton-Algorithmus beruht. Im Bereich des lasergenerierten Ultraschalls konnten durch einen mikroelektromechanischen Senkspiegel-Modulator ringförmige Beleuchtungsmuster unterschiedlichen Durchmessers generiert werden, die eine Fokussierung von Scherwellen in verschiedenen Tiefen in einem Aluminiumwerkstück bewirkten. So können potenziell Materialeigenschaften kontaktfrei mit hoher Bandbreite erfasst werden. Für die optogenetische Netzwerkanalyse wurden zwei Systeme zur zellulären und subzellulären dreidimensionalen Stimulation und Inhibierung entwickelt. Durch ein iteratives Korrekturverfahren mit Zernike-Polynomen konnte durch die Korrektur systeminhärenter Aberrationen eine nahezu beugungsbegrenzte laterale Ortsauflösung erreicht werden. Abschließend wurde die zeitliche Entwicklung der Konnektivität neuronaler Netze mit diesen Systemen beobachtet. Durch die gezielte Einzelzellstimulation konnten dabei allein mit elektrischer Stimulation nicht sichtbare Effekte wie distanzabhängige Signalgeschwindigkeiten und Verknüpfungen zwischen nicht anhand elektrischer Signale erfassbaren Neuronen beobachtet werden. Dies eröffnet neue Wege z.B. für pharmakologische Untersuchungen und die Analyse neurodegenerativer Krankheiten.:Abkürzungsverzeichnis V Symbolverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis XI Tabellenverzeichnis XV 1 Motivation/Einleitung 1 2 Grundlagen der Strahlformung 5 2.1 Physikalisch-mathematische Grundlagen 5 2.1.1 Von den Maxwellgleichungen zur Helmholtzgleichung 5 2.1.2 Die Winkelspektrumsmethode zur Beschreibung der Lichtausbreitung 6 2.1.3 Phasen-Beschreibung einer Linse 8 2.1.4 Zernike-Polynome 10 2.2 Computergenerierte Hologramme 10 2.2.1 Direkte Berechnung 11 2.2.2 Fourier- und Fresnelhologramme 12 2.2.3 Simulated Annealing 16 2.2.4 Phase retrieval mittels Gerchberg-Saxton-Algorithmus 19 3 Binäre Phasenhologramme 21 3.1 Gerchberg-Saxton 23 3.2 Thresholding 23 3.3 Error Diffusion 24 3.4 Methodenvergleich - Fresnelhologramme 28 3.5 Methodenvergleich - Fourierhologramme 31 3.6 Zusammenfassung 33 4 Anwendung I: Laserultraschall 35 4.1 Einleitung 35 4.2 Problemstellung 35 4.3 Strahlformung beliebiger Wellenfronten mit Phase Retrieval 37 4.4 Versuchsaufbau 40 4.5 Durchgeführte Messungen 42 4.6 Zusammenfassung 45 5 Anwendung II: Optogenetik 47 5.1 Problemstellung und Stand der Technik 47 5.2 Versuchsaufbau für Fresnelhologramme 53 5.2.1 Versuchsaufbau für die Verwendung von Fresnelhologrammen 53 5.2.2 Ferroelektrischer binärer räumlicher Phasenmodulator 54 5.2.3 Berechnung computergenerierter Fresnelhologramme 56 5.2.4 Verwendete Zellkultur 57 5.2.5 Minimale Ortsauflösung 58 5.2.6 Framerate des Modulators 60 5.2.7 Erzeugung mehrerer Fokusse 61 5.2.8 Beispielhafte Einzelzellstimulation 63 5.3 Versuchsaufbau für die Verwendung von Fourierhologrammen 65 5.3.1 Experimenteller Aufbau 66 5.3.2 Abschätzung der Ortsauflösung 68 5.3.3 Erzeugung von Lichtmustern und Aberrationskorrektur 69 5.3.4 Erzeugung mehrerer Fokusse 72 5.3.5 Testmessungen mit Fluoreszenzpartikeln in 2d/3d 73 5.3.6 Zusammenfassung 77 5.4 Untersuchung der Konnektivität neuronaler Netze 78 5.4.1 Zellkultur 80 5.4.2 Lokalisierung einzelner Neuronen 80 5.4.3 Experimentelles Vorgehen 81 5.4.4 Ergänzungen zum holographischen Stimulationsaufbau 83 5.4.5 Spike-Sorting 84 5.4.6 Vergleich von Aktivitätsprofilen von Weitfeld- und holographischer Stimulation 85 5.4.7 Peri-Event-Raster und -Zeithistogramme 86 5.4.8 Post-Stimulus-Zeit-Histogramm (PSTH) der holographischen Stimulation 86 5.4.9 Entfernungsabhängige Reaktionen der Neuronen auf holographische Stimulation 86 5.4.10 Funktionellen Konnektivität der Spontanaktivität (Baseline) 87 5.4.11 Kartierung funktioneller Konnektivität durch Einzelzellstimulation 88 5.4.12 Holographische Einzelzellstimulation 90 5.4.13 Zeitliche Dynamik der Konnektivität 95 5.4.14 Diskussion 99 5.4.15 Zusammenfassung 101 6 Zusammenfassung 103 Literaturverzeichnis 107 / In many application areas of laser measurement technology, adaptive local and temporal light field shaping can open up completely new perspectives. In optogenetics, for example, single foci with a maximum diameter of 10 μm, addressable in three dimensions, as well as complex light patterns are necessary for the the activation or inhibition of single cells or whole cell groups, respectively, to perform in-depth analyses of neuronal networks. Computer-generated holograms (CGH) are best suited for this purpose due to their versatile possibilities of amplitude and phase modulation. To display these, fast spatial light modulators (SLM) with a large number of pixels are required. Widely used liquid crystal SLMs, however, often have a megapixel resolution but a frame rate of only a few Hertz. Due to innovations in the consumer sector, microelectromechanical scanner mirrors and ferroelectric binary phase modulators are available, which offer high spatial and temporal resolution at the same time. Building on such devices with 250 Hz and 1.7 kHz frame rate, respectively, this work presents the development and application of computer-aided adaptive optical systems for laser-generated ultrasound and optogenetics. Based on computer simulations, methods for the fast generation of binary phase holograms were compared. For Fresnel holograms, an error diffusion method led to reconstructed images with highest similarity to the desired intensity distributions and was more than 10× faster than the second best method, which was based on the Gerchberg-Saxton algorithm. In the field of laser-generated ultrasound, a microelectromechanical modulator was used to generate ring-shaped illumination patterns of different diameters, which allow a focussing of shear waves in varying depths in an aluminium workpiece. This way, material properties can potentially be detected without contact and with a high bandwidth. For optogenetic network analysis, two systems for cellular and subcellular three-dimensional stimulation and inhibition were developed. Using ferroelectric liquid crystal modulators, frame rates up to the kilohertz range can be achieved. An iterative correction procedure with Zernike polynomials was able to correct system-inherent aberrations to achieve almost diffraction-limited lateral spatial resolution. Applying these systems, the temporal evolution of neural network connectivity was observed. Through targeted single-cell stimulation, effects not visible with electrical stimulation alone, such as distance-dependent signal velocities and connections between neurons undetectable by electrical recording, were observed. This opens up new ways for pharmacological investigations and the analysis of neurodegenerative diseases.:Abkürzungsverzeichnis V Symbolverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis XI Tabellenverzeichnis XV 1 Motivation/Einleitung 1 2 Grundlagen der Strahlformung 5 2.1 Physikalisch-mathematische Grundlagen 5 2.1.1 Von den Maxwellgleichungen zur Helmholtzgleichung 5 2.1.2 Die Winkelspektrumsmethode zur Beschreibung der Lichtausbreitung 6 2.1.3 Phasen-Beschreibung einer Linse 8 2.1.4 Zernike-Polynome 10 2.2 Computergenerierte Hologramme 10 2.2.1 Direkte Berechnung 11 2.2.2 Fourier- und Fresnelhologramme 12 2.2.3 Simulated Annealing 16 2.2.4 Phase retrieval mittels Gerchberg-Saxton-Algorithmus 19 3 Binäre Phasenhologramme 21 3.1 Gerchberg-Saxton 23 3.2 Thresholding 23 3.3 Error Diffusion 24 3.4 Methodenvergleich - Fresnelhologramme 28 3.5 Methodenvergleich - Fourierhologramme 31 3.6 Zusammenfassung 33 4 Anwendung I: Laserultraschall 35 4.1 Einleitung 35 4.2 Problemstellung 35 4.3 Strahlformung beliebiger Wellenfronten mit Phase Retrieval 37 4.4 Versuchsaufbau 40 4.5 Durchgeführte Messungen 42 4.6 Zusammenfassung 45 5 Anwendung II: Optogenetik 47 5.1 Problemstellung und Stand der Technik 47 5.2 Versuchsaufbau für Fresnelhologramme 53 5.2.1 Versuchsaufbau für die Verwendung von Fresnelhologrammen 53 5.2.2 Ferroelektrischer binärer räumlicher Phasenmodulator 54 5.2.3 Berechnung computergenerierter Fresnelhologramme 56 5.2.4 Verwendete Zellkultur 57 5.2.5 Minimale Ortsauflösung 58 5.2.6 Framerate des Modulators 60 5.2.7 Erzeugung mehrerer Fokusse 61 5.2.8 Beispielhafte Einzelzellstimulation 63 5.3 Versuchsaufbau für die Verwendung von Fourierhologrammen 65 5.3.1 Experimenteller Aufbau 66 5.3.2 Abschätzung der Ortsauflösung 68 5.3.3 Erzeugung von Lichtmustern und Aberrationskorrektur 69 5.3.4 Erzeugung mehrerer Fokusse 72 5.3.5 Testmessungen mit Fluoreszenzpartikeln in 2d/3d 73 5.3.6 Zusammenfassung 77 5.4 Untersuchung der Konnektivität neuronaler Netze 78 5.4.1 Zellkultur 80 5.4.2 Lokalisierung einzelner Neuronen 80 5.4.3 Experimentelles Vorgehen 81 5.4.4 Ergänzungen zum holographischen Stimulationsaufbau 83 5.4.5 Spike-Sorting 84 5.4.6 Vergleich von Aktivitätsprofilen von Weitfeld- und holographischer Stimulation 85 5.4.7 Peri-Event-Raster und -Zeithistogramme 86 5.4.8 Post-Stimulus-Zeit-Histogramm (PSTH) der holographischen Stimulation 86 5.4.9 Entfernungsabhängige Reaktionen der Neuronen auf holographische Stimulation 86 5.4.10 Funktionellen Konnektivität der Spontanaktivität (Baseline) 87 5.4.11 Kartierung funktioneller Konnektivität durch Einzelzellstimulation 88 5.4.12 Holographische Einzelzellstimulation 90 5.4.13 Zeitliche Dynamik der Konnektivität 95 5.4.14 Diskussion 99 5.4.15 Zusammenfassung 101 6 Zusammenfassung 103 Literaturverzeichnis 107

Channelrhodopsin-2 ist ein lichtaktivierter Kationenkanal, der zur nichtinvasiven Steuerung neuronaler Aktivität verwendet wird. Einige grundlegende Eigenschaften dieses Proteins sind bereits bekannt, aber die molekularen Mechanismen des Ionentransports und der Aktivierung liegen noch weitgehend im Dunkeln. Ziel dieser Studie war es, anhand von Mutationsstudien die Funktion einzelner Aminosäuren zu bestimmen. Dazu habe ich gezielt potentiell wichtige Reste substituiert und die Channelrhodopsin-2-Varianten elektrophysiologisch untersucht. Um die aufgetretenen Änderungen beim Ionentransport und den Kanalkinetiken zu erklären, habe ich verschiedene mathematische Modelle an die experimentellen Daten angepasst. Dabei stellte sich heraus, dass die Reste H134 und E90 Schlüsselpositionen für den Protonentransport sind. Außerdem haben auch die Reste E235 und D253 einen großen Einfluss auf den Ladungstransport. Dagegen wird die Kanalöffnung von C128 und D156 kontrolliert. Des Weiteren kontrolliert E123 die Übergänge zwischen leitenden und nichtleitenden Zuständen von Channelrhodopsin-2. Aus der zielgerichteten Mutation von Aminosäuren resultierten Varianten, die langsamere oder schnellere Kinetiken hatten oder eine bessere Expression zeigten als der Wildtyp. Das Anwendungspotential der modifizierten Kanäle wurde in Kooperationen mit neurophysiologischen Arbeitsgruppen untersucht. Dadurch konnten drei neue Typen von Channelrhodopsinen in die Neurophysiologie eingeführt werden. Die step-functions opsins führen zu einer anhaltenden Membrandepolarisation, die die Erregbarkeit von Neuronen gegenüber synaptischen Inputs erhöht. ChETA erlaubt das zeitlich präzise Auslösen von Aktionspotentialen auch bei sehr hohen Anregungsfrequenzen. T159C und E123T/T159C ermöglichen durch ihre großen Photoströme und optimierten Kinetiken eine hohe Zuverlässigkeit bei der optischen Steuerung neuronaler Aktivität. Dadurch wird das Anwendungsspektrum von Channelrhodopsin-2 erheblich erweitert. / Channelrhodopsin-2 is a light-activated cation channel which has become a very useful tool in neurophysiology, since it allows the noninvasive control of neural activity. Some of the basic features of this channel are known from previous studies, but the molecular mechanisms of ion translocation and activation are largely unknown. The aim of my thesis is to elucidate the function of single amino acids by mutational studies. I replaced potentially important residues and probed the constructs by electrophysiological measurements under various conditions. Additionally, I fitted the experimental data to several mathematical models in order to explain changes in ion permeabilities and channel kinetics and I assigned particular functions to the mutated residues. Apparently, H134 and E90 are key positions for the proton transportation. Mutations at E235 and D253 also strongly influence ion translocation, whereas C128 and D156 obviously control the channel opening. Moreover, I found that E123 is a key element for the channel activation which controls the transitions between conducting and non-conducting states of Channelrhodopsin-2. The genetically modified Channelrhodopsin-2-variants provide several favorable features, such as, a slower or faster channel opening and closing or an optimized expression. Therefore, we tested the potential of promising constructs for applications in collaboration with neurophysiology laboratories. Finally, we introduced three new tools. First, step-function opsins induce a sustained membrane depolarization which sensitizes neurons to native synaptic inputs. Second, the ChETA variant allows the temporally precise generation of action potentials even at high stimulation frequencies. Third, T159C and E123T/T159C provide large photocurrents and optimized kinetics resulting in an improved performance in the noninvasive control of neural activity. In summary, this significantly broadens the range of application for channelrhodopsin-2.