Embryonen von Höheren Krebsen (Malacostraca) zeigen ein stereotypes Zellteilungsmuster im Ektoderm des Rumpfes, im Verlaufe dessen paarige seitliche Reihen von Zellen und eine unpaare mittlere Reihe von Zellen gebildet werden. Das Muster der seitlichen Zellen ist von Dohle (1970, 1976) und Mitarbeitern geklärt worden. Die vorliegende Arbeit untersucht die cell lineage und Zelldifferenzierung der Mittellinienzellen im Thorax. Diese Zellen sind von besonderem Interesse, weil sie bei Insekten bereits intensiv erforscht wurden. (i) Die DiI Markierungen von Mittellinienzellen von Orchestia cavimana zeigen: Die Bildung der Mittellinie beginnt mit einer Zelle, die sich zweimal in Längsrichtung teilt. Die resultierenden vier Zellen werden mit a0, b0, c0 und d0 bezeichtet. Aus den Zellen a0, b0 und c0 gehen Paare von Gliazellen hervor. Die Tochterzellen von a0 und c0 umhüllen die Kommissuren. Die Zelle d0 ist ein medianer Neuroblast, aus dem mehrere Neurone hervorgehen, unter anderem ein unpaares Neuron im medianen Fasertrakt, interneurone und ein Motoneuron. (ii)BrdU Markierungen von Porcellio scaber zeigen: In den Ganglienanlagen liegt in der Mittellinie je eine Zelle, die größer ist als die benachbarten, schneller proliferiert und deshalb vermutlich ein medianer Neuroblast ist. (iii) Die Expression von engrailed setzt bei Orchestia und Porcellio ein in der Zelle a0 und wird in den zwei Tochterzellen fortgesetzt. Für Orchestia wird gezeigt, daß diese Expression zurückgeht und die Tochterzellen der Zelle d0 de novo mit einer Expression von engrailed beginnen.Aus den Ergebnissen kann abgeleitet werden, daß der gemeinsame Vorfahr von Insekten und Höheren Krebsen eine Mittellinie differenziert, die Vorläufer für Glia der Kommissuren und einen medianen Neuroblasten umfaßt und eine Expression von engrailed in den Tochterzellen des Neuroblasten zeigt. / Embryos of higher crustaceans (Malacostraca) show a highly stereotypic cell division pattern in the ectoderm of the trunk region while forming paired rows of lateral cells and an unpaired median row of midline cells. By using nuclear dyes, the pattern of the lateral cells has been determined by Dohle (1970, 1976) an co-workers. This study addresses the cell lineage and cell differentiation of the midline cells in the thorax. These kind of cells are of particular interest as they have been investigated extensively in insects. (i) The DiI labelling of midline cells in Orchestia cavimana reveals: Formation of the midline starts with a single midline cell that divides twice in longitudinal direction. The resulting four cells are termed a0, b0, c0, and d0. The cells a0, b0, and c0 give rise to pairs of glial cells. The progeny of a0 and c0 enwrap the commissures. The cell d0 is a median neuroblast that gives rise to several neurons, among them an unpaired neuron in the median fibre tract, interneurons and probably a single motoneuron. (ii) BrdU labelling in Porcellio scaber shows: there is a single larger and faster dividing cell in the midline in each segmental ganglion anlage that is a putative median neuroblast. (iii)The expression of engrailed starts in Orchestia and Porcellio the cell a0 and continues in the two daughter cells during segmentation. In Orchestia it can be shown that this expression ceases and progenies of the cell d0 start de novo with the expression of engrailed. From the results can be concluded that the common ancestor of insects and higher crustaceans differentiated an unpaired midline comprising precursors for glial cells enwrapping the commissures and a single median neuroblast whose derivatives express engrailed.

Programmierter Zelltod (PCD) oder Apoptose ist ein universeller biologischer Prozess, der in multizellulären Organismen essentiell ist für die Differenzierung und Homöostase von Geweben. Bei der Entwicklung eines funktionsfähigen zellulären Immunsystems können autoreaktive Zellen entstehen. Die negative Selektion von unreifen, autoreaktiven B-Zellen erfolgt durch IgM-vermittelte Apoptose und ist von de novo Transkription abhängig. Die genauen Mechanismen der IgM-vermittelten Apoptose und die involvierten Genprodukte sind nur unzureichend charakterisiert. Zur Identifikation Apoptose-assoziierter Gene in B-Zellen wurden die Differential Display-Analyse durchgeführt und die Expressionsmuster apoptotischer und nicht-apoptotischer BL60-Zellen untersucht. Es wurden 38 differentielle Fragmente identifiziert und kloniert. Sequenzanalysen ergaben Homologien eines Fragments mit LAPTM5, einem lysosomal-assoziierten Transmembran-Protein mit vorwiegender Expression in hämatopoetischem Gewebe. Northern Blot-Analysen zeigten 2 Stunden nach Inkubation von BL-60-Zellen mit anti-IgM einen Anstieg der Genexpression von LAPTM5. Das LAPTM5-Gen liegt auf Chromosom 1 (1p34), ist evolutionär konserviert und besitzt keine Homologien zu bekannten Genen. Die Untersuchung der gewebespezifischen Expression von LAPTM5 ergab neben der hohen Expressionsrate in hämatopoetischem Gewebe eine sehr starke Expression in Skelett- und Herzmuskelgewebe. Elektronenmikroskopisch zeigte sich eine Lokalisation des Proteins in späten Endosomen und Lysosomen. Daneben konnte LAPTM5 auch auf der Oberfläche von BL60-Zellen detektiert werden. Während des apoptotischen Prozesses bleibt die Menge an LAPTM5 auf der Zelloberfläche konstant. Zur weiteren Charakterisierung von LAPTM5 und anderen Kandidaten-Genen wurde ein episomales Expressions- und Selektionssystem entwickelt. Cotransfektionsanalysen unter Verwendung eines GFP (green fluorescent protein)- Konstrukts zeigten, dass die aufgereinigten Zellen zu 80% das interessierende Gen exprimieren und die Expression länger als vier Wochen anhält. / Programmed cell death (PCD) or apoptosis is a key feature of normal development and tissue homeostasis. In the development of a functional immunesystem the occurence of autoreactive cells is tightly controlled and prevented by apoptosis. The negative selection of autoreactive immature B cells after encountering self antigen occures via surface IgM (sIgM) mediated apoptosis and depends on de novo gene transcription. The precise mechanism of this process and the possible involvement of different genes in the regulation of sIgM-mediated cell death is not understood so far. In order to identify genes associated with B cell apoptosis Differential Display RT-PCR (DD) was performed to analyze sIgM-mediated apoptosis in the human Burkitt lymphoma line BL60. The expression patterns of apoptotic and non-apoptotic cells were investigated and 38 differentially expressed gene fragments were found. Subsequent northern blot analysis showed that LAPTM5, a lysosomal associated membrane protein preferential ly expressed in adult hematopoietic tissue, is up-regulated 2 hours after induction of apoptosis. LAPTM5 is a protein with five transmembrane domains, it is conserved during evolution and the gene, mapping to chromosome 1p34, has no homology to known genes. In contrast to earlier data a very high expression of the protein was detected not only in hematopoietic tissue but also in skeletal muscle and heart muscle. Electronmicroscopy was performed to investigate the subcellular localization in detail and showed that LAPTM5 is mainly present in late endosomes and lysosomes. FACS analysis revealed a surface expression of LAPTM5 and a constant amount of LAPTM5 at the surface during IgM mediated apoptosis. To further investigate the functional role of candidate genes during apoptosis an episomal expression and selection system was established. Cotransfection analysis with GFP (green fluorescent protein) showed that 80% of the separeted cells express the gene of interest for at least four weeks.

Direkte Zellreprogrammierung basiert auf Transkriptionsfaktoren (TFs), die die Identität bestimmter Zelltypen induzieren.Diese TF vermittelte Zellreprogrammierung ist in den meisten Zelltypen häufig durch hemmende Mechanismen limitiert.Um solche Barrieren in C. elegans zu identifizieren, verwendeten wir den zuvor charakterisierten Zinkfinger-TF CHE-1, der erforderlich ist, um glutamaterge ASE-Neuronen zu induzieren.In dieser Studie haben wir eine mögliche Barriere für die Reprogrammierung von Keimzellen zu Neuronen identifiziert und charakterisiert:die NAD+ abhängige mitochondriale Isocitratdehydrogenase 3 (IDH3).Der RNAi-Knockdown ergab in Kombination mit ektopischer Expression von CHE-1 einen konsistenten Phänotyp hinsichtlich der Expression des neuronalen ASE- Reporters in der Keimbahn. Wir konnten feststellen,dass IDH3-Knockdowns zu globalen Veränderungen der repressiven Histonmodifikationen führen.Mittels genetischer Untersuchungen identifizierten wir Mitglieder der Jumonji-Proteine sowie die a-KG-abhängigen Histon-Demethylasen, die an diesem Reprogammierungsphänotyp beteiligt sind. Durch Massenspektrometrie und weiterführenden genetische Untersuchungen haben wir festgestellt, dass Zellen bei IDH3-Mangel eine sogenannte Glutamin-Anaplerose verwenden, um den a-KG-Spiegel wieder aufzufüllen und somit einen teilweise aktiven Zitronensäurezyklus beizubehalten.Des Weiteren sind diese Prozesse erforderlich, damit die TF vermittelte Zellreprogrammierung stattfinden kann.Wir haben außerdem festgestellt, dass Signale von Zellen der somatischen Gonade diesen durch IDH3-Mangel vermittelten Zellreprogrammierungsprozess von Keimzellen ermöglichen.Daher ist anzunehmen, dass der Reprogrammierungsphänotyp in der Keimbahn nicht gewebsautonom ist. Zusammengefasst identifiziert diese Studie die Rolle der evolutionär konservierten Isocitrat-Dehydrogenase 3 (IDH3) bei der Aufrechterhaltung der Zellidentität und damit auch als Barriere für die Zellreprogrammierung. / Direct reprogramming makes use of transcription factors (TFs) that induce the identity of specific cell types. These TFs often are restricted in most cell types by inhibitory mechanisms. In order to identify these barriers in C. elegans, we used the previously described zinc-finger TF CHE-1 that is required to induce the glutamatergic ASE neuron fate. In this study, we identified and characterized a candidate barrier for reprogramming germ cells into neurons, the NAD+ dependent mitochondrial isocitrate dehydrogenase 3 (IDH3). RNAi knockdown of alpha (IDHA-1) or gamma (IDHG-1) subunit of this complex gave a consistent and reliable phenotype of the expression of ASE reporter in the germ line upon ectopic expression of CHE- 1. This study shows that idha-1 depletion-mediated reprogramming of germ cells to neurons is partially repressed in animals that lack the hypoxia-induced factor, TF HIF-1. It has been shown that mitochondrial dynamics change during differentiation. This suggests that disturbing mitochondrial function may feed-back to chromatin thus altering gene expression and allowing reprogramming. We were able to identify that knock down of idha-1 leads to global histone modification changes; and by performing a genetic screen we identified members of the Jumonji proteins, the a-KG dependent histone demethylases, involved in this conversion phenotype. By performing Mass Spectrometry and genetic screens, we have identified that cells utilize glutamine anaplerosis to replenish a-KG levels and display a partially active citric acid cycle upon IDH3 depletion; and these processes are required for the TF- mediated reprogramming to occur. Furthermore, the IDH3 depletion-mediated germ cell reprogramming is not tissue autonomous. We identified that signals from the somatic gonad enable the reprogramming process. Overall, this study identifies the role of the conserved Isocitrate Dehydrogenase 3 in cell fate safeguarding and thus as a barrier to reprogramming.

Die embryonale Neurogenese in Drosophila ist eine hochgradig koordinierte Abfolge von Zellschicksalsentscheidungen, die viele Ähnlichkeiten mit der Entwicklung des Nervensystems in Wirbeltieren aufweist. Diese Zellschicksalsentscheidungen sind räumlich und zeitlich koordiniert. Diese Zellen entstehen an stereotypen Positionen in jedem Segment und sind entlang zweier räumlicher Achsen angeordnet: der dorsoventralen und der anteroposterioren Achse. Neuroblasten teilen sich, um stereotype Zelllinien zu bilden, und die Zellen weisen charakteristische Zellmorphologien und -ziele auf, wobei die molekularen Mechanismen, die diese Merkmale bestimmen, noch weitgehend unbekannt sind. Jahrzehnte der Genetik haben einige Faktoren aufgedeckt, die für viele dieser Entscheidungen notwendig sind, aber ein Verständnis der einzelnen neurogenen Linien auf Genomebene war bis vor kurzem in vivo unmöglich. Ich habe mRNA aus Einzelzellen verwendet, um die Transkriptomdynamik von Schicksalsentscheidungen in der frühen Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Mein Ziel ist es, zu entschlüsseln, wie sich Zellen unterscheiden, wenn Entscheidungen getroffen werden, die für die Entwicklung des Nervensystems wesentlich sind. Ich habe Transkriptomdaten von einzelnen Zellen aus Zehntausenden von Neuroblasten während der gesamten embryonalen Neurogenese erstellt. Es gelang mir, spezifische neurogene Populationen und ihre Genexpressionsprofile entlang ihrer Differenzierungswege zu identifizieren. Ich konnte die komplizierten zeitlichen Achsen, die das sich entwickelnde embryonale Nervensystem formen, teilweise entschlüsseln - ein Prozess, der von der Fliege bis zum Menschen konserviert ist. Diese Arbeit hat die Identifizierung lokalisierter Marker und sogar spezifischer Neuroblasten ermöglicht. Dieses Verständnis kann nun mit Informationen über die einzelnen Zellschicksale kombiniert werden, aus denen diese Neuroblasten hervorgehen, wie z. B. ihre spezifischen neuronalen und glialen Schicksale. / Embryonic neurogenesis in Drosophila is a highly coordinated sequence of cell fate decisions that bears many similarities to the development of the nervous system in vertebrates. These cell fate decisions are spatially and temporally coordinated. These cells arise at stereotypic positions in each segment and are arranged along two spatial axes: the dorsoventral axis and the anteroposterior axis. Neuroblasts divide to give rise to stereotypic lineages and the cells exhibit characteristic cell morphologies, branching patterns, and targets, the molecular mechanisms that determine these characteristics are still largely unknown. Decades of genetics have uncovered some factors necessary for many of these decisions, but understanding individual neurogenic lineages at the genome level has been impossible in vivo until recently. I have used Single cell mRNA to study the transcriptome dynamics that accompany important fate decisions in early nervous system development. My goal is to decipher how cells differ when decisions are made that are essential for nervous system development. This knowledge is invaluable for developing models for the in vivo mechanisms that allow individual cells in the nervous system to specify and differentiate. I have generated transcriptome data of single cells from tens of thousands of neuroblasts throughout embryonic neurogenesis. I was able to identify specific neurogenic populations and their gene expression profiles along their differentiation pathways. I was able to partially decipher the intricate temporal axes that shape the developing embryonic nervous system, a process that is conserved from fly to human. Single-cell transcriptomics has enabled the identification of localized markers and even specific neuroblasts. This understanding can now be combined with information about the individual cell fates that give rise to these neuroblasts, such as their specific neuronal and glial fates.

DNS-Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, der essentiell für die Differenzierung embryonaler Stammzellen ist, über dessen Funktion in somatischen Zellen allerdings wenig bekannt ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Mausmodelle analysiert, um die Rolle der durch DNS Methyltransferase 1 (DNMT1) hergestellten DNS-Methylierung im adulten hämatopoetischen System zu untersuchen. Als erstes wurde ein „Knockout“-Modell gewählt, um DNMT1 im hämatopoetischen System zu eliminieren. Des Weiteren wurde eine Mausmutante mit reduzierter DNMT1 Expression analysiert. Die vollständige Entfernung von DNMT1 aus dem hämatopoetischen System adulter Mäuse resultierte in Zytopenie und Anämie, gefolgt vom raschen Tod aller Tiere. Die Analyse des Knochenmarks dieser Mäuse zeigte einen fast vollständigen Verlust von hämatopoetischen Stamm- sowie Vorläuferzellen. Dies zeigt, dass die durch DNMT1 erzeugte DNS-Methylierung essentiell für Homöostase und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen ist. Mäuse mit reduzierter DNMT1 Expression hingegen sind lebensfähig und zeigen einen niedrigen Grad an DNS-Methylierung in verschiedensten Geweben, einschließlich des hämatopoetischen Systems. Durch eine detaillierte phänotypische und funktionelle Analyse der hämatopoetischen Stammzellen zeigte sich, dass der veränderte DNS-Methylierungsgrad ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial zur Folge hat. Interessanterweise fehlen DNMT1 hypomorphen Mäusen lymphoide Vorläuferzellen sowie reife lymphoide Zellen, wohingegen myeloide und erythroide Zellpopulationen keine Veränderungen zeigten. Genomweite Expressionsanalysen von Stammzellen sowie myeloiden Vorläuferzellen zeigten, dass hypomethylierte Stammzellen eine verfrühte myeloerythroide Entwicklung vollziehen und liefern damit eine Erklärung für den Verlust des Selbsterneurungspotenzials und der lymphoiden Entwicklung. Diese Resultate identifizieren eine bis hierhin unbekannte Funktion von spezifischen DNS-Methylierungsgraden für die Steuerung von funktionellen Programmen wie Selbsterneuerung und Differenzierung in hämatopoetischen Stammzellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic mechanisms which is known to play a role in embryonic stem cell fate, but its function in somatic stem cells is not well understood. In this thesis two different genetic mouse models were chosen to address the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) controlled DNA methylation in adult hematopoiesis. First, a conditional knockout approach was used to delete DNMT1 in the adult hematopoietic system. Second, DNMT1 hypomorphic mice with reduced DNMT1 expression were analyzed. Complete DNMT1 deletion in hematopoietic cells led to severe cytopenia and anemia causing rapid lethality of all animals. Bone marrow analysis revealed an almost complete absence of hematopoietic stem and progenitor cells in DNMT1 ablated primary mice as well as in secondary chimeric mice. These results indicated that DNMT1 controlled maintenance of DNA methylation is indispensable for HSCs preservation and differentiation. In contrast to complete DNMT1 deletion, mice with hypomorphic DNMT1 expression were viable, but showed low methylation levels in multiple tissues including the hematopoietic system. Detailed phenotypical and functional analysis of the hypomethylated hematopoietic stem cell (HSCs) compartment revealed an impaired homeostasis and self-renewal capacity. Intriguingly, mutant animals had profoundly reduced lymphoid cell compartments, whereas myeloid and erythroid compartments were unchanged. Expression profiling of stem and myeloid progenitor cells unexpectedly demonstrated that reduced DNA methylation forces the HSC to adopt a myeloid lineage identity. These results, showing the inability of hypomethylated HSCs to maintain an undifferentiated state, provided an explanation for their disturbed capability to self-renew and produce lymphocytes. Taken together, these findings suggest that distinct levels of DNA methylation are required to control different functional programs such as self-renewal and alternative lineage choices in HSCs, thus uncovering a previously unrecognized function for DNMT1 activity.

Der CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) Transkriptionsfaktor reguliert die Differenzierung, Proliferation und Funktion vieler Zelltypen, einschließlich verschiedener Zellen des Immunsystems. Eine detaillierte molekulare Analyse des Mechanismus, wie C/EBPβ alternative Zellschicksale steuert, wurde jedoch bisher noch nicht unternommen. Es wurde gezeigt, dass die ektopische Expression von C/EBPβ in determinierten B- Vorläuferzellen diese zu inflammatorischen Makrophagen reprogrammieren kann. Wir haben dieses Reprogrammierungsystem verwendet, um die Strukturelemente in C/EBPβ, die für die Regulation der (Trans)Differenzierung durch C/EBPβ wichtig sind, zu untersuchen. Um die maßgeblichen C/EBPβ Proteinmodule für die Reprogrammierung zu bestimmen, wurden entweder C/EBPβ Wildtyp Isoformen oder Mutanten in primären murinen B-Vorläuferzellen ektopisch exprimiert. Die Analysen ergaben, dass die translational regulierten langen Isoformen LAP* and LAP, jedoch nicht die kurze Isoform LIP lymphoide Zellen zu myeloischen Zellen reprogrammieren können. Des weiteren haben wir gezeigt, dass die konservierten Regionen 2, 3 und 4 der C/EBPβ Transaktivierungsdomäne essentiell und ausreichend für die Konvertierung von B Zellen zu myeloischen Zellen sind. Die reprogrammierten myeloischen Zellen setzten sich aus einer heterogenen Population verschiedener myeloischer Zelltypen zusammen. Detaillierte Analysen von CD11b+ reprogrammierten Zellen zeigten, dass diskrete konservierte Regionen von C/EBPβ verschiedene pro- und anti-inflammatorische Gene und divergente Entwicklungsprogramme aktivierten. Des Weiteren führten nicht nur strukturelle C/EBPβ Mutanten sondern auch Puktmutationen an Stellen, die posttranslationalen Modifikationen (PTM) unterliegen, zu verschiedenen Reprogrammierungsergebnissen. Diese Daten zeigen, dass die C/EBPβ abhängige myeloische Diversifikation durch die Integration von strukturellen C/EBPβ Proteinmodulen und deren signalabhängigen PTMs erreicht wird. / The CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPβ) transcription factor regulates differentiation, proliferation, and functionality of many cell types, including various cells of the immune system. A detailed molecular understanding of how C/EBPβ directs alternative cell fates remains largely elusive. Ectopic expression of C/EBPβ has been previously shown to reprogram committed B cell progenitors into inflammatory macrophages. We took advantage of this reprogramming system in order to examine how C/EBPβ regulates (trans)differentiation. To determine which C/EBPβ protein modules are important for reprogramming, C/EBPβ wild type isoforms and mutants were ectopically expressed in primary mouse B cell progenitors. The data showed that the translationally regulated long isoforms LAP* and LAP, but not the N-terminally truncated isoform LIP can reprogram lymphoid cells into myeloid cells. Furthermore, we found that conserved regions 2,3 and 4 in the C/EBPβ protein transactivation domain are necessary and sufficient for B-to-myeloid cell conversion. Interestingly, the reprogrammed myeloid cells were found to represent a heterogeneous mixture of different myeloid cell types. Detailed analyses of the reprogrammed CD11b+ cells revealed that discrete conserved regions in C/EBPβ activated distinct pro- and anti-inflammatory genes and triggered divergent differentiation programs. Moreover, not only structural C/EBPβ mutants, but also post-translational modification (PTM) site mutations led to different reprogramming outcomes. These data suggest that C/EBPβ orchestrates myeloid diversification by integrating PTMs with structural plasticity as signal dependent adaptable modular properties to determine cell fate.

Die in der vorliegenden Habilitationsschrift zusammengefaßten Publikationen stellen Untersuchungen zu zwei Themenschwerpunkten dar: 1. Verankerungsmechanismen von Membranproteinen der basolateralen und der apikalen Plasmamembrandomäne der Parietalzellen mit dem Membranzytoskelett und 2. die regulierte Fusion von zytoplasmatischen Vesikeln mit der apikalen Plasmamembran dieser Zellen. Die strukturell und molekular sehr unterschiedlich gestaltete apikale und basolaterale Membrandomäne der Parietalzellen sollte funktionell charakterisiert und die Mechanismen der Membranumbauvorgänge aufgeklärt werden, die nach Aktivierung der Zellen im apikalen Membrankompartiment ablaufen. Für die strukturelle Stabilität der basolateralen Domäne spielt wahrscheinlich die Verankerung von AE2 über das Verknüpfungsprotein Ankyrin mit dem Membranzytoskelett eine wichtige Rolle. Die apikale Membrandomäne der Parietalzellen kann in drei Kompartimente unterteilt werden. Die freie apikale Membran, die canalikuläre Membran und die Membranen der tubulären Vesikel. Entlang der freien apikalen und der canaliculären Plasmamembran kommen wie auf der basolateralen Seite die Zytoskelett-Proteine Actin und Spectrin vor. Nach unseren Untersuchungen könnte es während der Sekretionsphase zu einer temporären Verbindung von H+,K+-ATPase Molekülen mit dem Membranzytoskelett kommen. Diese Verbindung wird wahrscheinlich durch das Verknüpfungsprotein Ezrin vermittelt. Der Mechanismus des Fusionsvorgangs der tubulären Vesikel mit der canaliculären Membran war bisher nicht bekannt. In Parietalzellen konnten die neuronalen SNARE-Proteine Synaptobrevin 2, Syntaxin 1 und SNAP25 sowie das zur Familie der kleinen G-Proteine gehörende Protein Rab3A und die Regulatorproteine NSF und alpha/beta SNAP nachgewiesen werden. Das in Parietalzellen gefundene Verteilungsmuster der SNARE-Proteine entspricht nicht der klassischen Vorstellung einer heterotypischen Membranfusion, vielmehr entspricht diese Verteilung einer homotypischen Fusion, wie sie für Vakuolen in Hefezellen beschrieben wurde. Die Bedeutung der SNARE-Proteine für die Fusion der tubulären Vesikel mit der canaliculären Membran und damit für die Steigerung der HCl-Sekretion konnte durch Inkubation der Zellen mit Tetanus Neurotoxin (TeNt) gezeigt werden. Die Behandlung der Parietalzellen mit TeNt führte zum vollständigen Ausbleiben der, nach Stimulation mit cAMP bei Kontrollzellen beobachteten Erhöhung, der Säuresekretion / The publications summarized here cover two topics: 1. the anchorage mechanism of membrane proteins of the basolateral and the apical plasma membrane with the membrane cytoskeleton of parietal cells and 2. the regulated fusion of cytoplasmic vesicles with the apical plasma membrane of these cells. It was the aim of these studies to characterize the structural and molecular differences between the apical and basolateral membrane domains in parietal cells. Moreover the mechanisms involved in membrane traffic within the apical membrane compartment following stimulation were investigated. We found that anchorage of AE2 with the membrane cytoskeleton through the linkage protein ankyrin seems to be important for the stability of the basolateral membrane. The apical membrane domain of parietal cells can be subdivided into three compartments. The free apical membrane, the canalicular membrane and the tubulovesicular membrane. The cytoskeletal proteins spectrin and actin can be found at the basolateral, the free apical and the canalicular membrane. We have shown that the H+K+-ATPase molecules appear to be temporary linked to the membrane cytoskeleton during acid-secretion. This contact is most likely mediated by the linker-protein ezrin. Until now the mechanism of fusion of the tubulovesicles with the canalicular membrane was unknown. In parietal cells the neuronal SNARE-proteins synaptobrevin 2, Syntaxin 1, SNAP25, the small G-protein rab3A, and the regulatory proteins NSF and alpha/beta-SNAP were detected. The subcellular distribution of these proteins does not support the notion of a neuron-like heterotypic fusion. Instead it shows similarity with the homotypic fusion process of vacuoles in yeast. The importance of SNARE-proteins for the fusion of tubulovesicles with the canalicular membrane and, by consequence also for the increase of acid-secretion was shown by incubation of the cells with tetanus neurotoxin (TeNt). The measurable increase of acid secretion by parietal cells after stimulation with c-AMP was inhibited completely through an incubation with TeNt.

Mein Ziel war es, genetische Faktoren in C. elegans zu identifizieren, die eine Rolle bei induzierter Transdifferenzierung durch Missexpression des Transkriptionsfaktors (TF) HLH-1, welcher das Wurmhomolog des myogenen bHLH TF MyoD ist, spielen. Ich entwickelte hierzu einen semiautomatischen Hochdurchsatz-Vorwärtsgenetik-Screen, indem ich EMS Mutagenese mit dem Biosorter-System (Union Biometrica) kombinierte. Mit diesem Ansatz ist es mir gelungen, die Mutante bar18 zu isolieren, die eine Anhäufung an Muskelzellkernen um den posterioren Teil des Pharynx zeigt. Ich identifizierte den mutierten Lokus, indem ich das gesamte Genom sequenzierte und charakterisierte den mutanten Phänotyp im Detail. Zusätzlich war ich bei der Charakterisierung von Faktoren, die das Umprogrammieren zu neuronalen Zellen in C. elegans verhindern, beteiligt. Dabei stand der sogenannte FACT-Komplex im Focus, welcher mittels eines genom-weiten RNAi-Screen in unserer Arbeitsgruppe identifiziert wurde. Interessanterweise ist eine der FACT-Komplex-Untereinheiten, spt-16, das parentale Gen zu dem bislang nicht charakterisierten Pseudogen F55A3.7. Eine putative Null-Mutante von F55A3.7, in Kombination mit ubiquitärer Überexpression von CHE-1, zeigte einen Keimzellen-zu-Neuronen Transdifferenzierungsphänotyp ähnlich dem Phänotypen, der nach dem Knock-down der FACT-Komponente hmg-3 beobachtet wird. Unseres Wissens nach ist dies das erste Beispiel einen Pseudogens, dessen Knock-down dazu führt, dass ein bestimmtes Gewebe durch einen terminalen Selektor-TF reprogrammiert werden kann, dessen Expression unter normalen Konditionen dies nicht zur Folge hätte. Aufgrund dieser Einzigartigkeit, habe ich das Pseudogen F55A3.7 charakterisiert und außerdem versucht, einen Mechanismus zu finden, wie F55A3.7 die Keimbahnidentität schützt. / My aim was to identify and characterize genetic factors in C. elegans that play a role in induced transdifferentiation by mis-expressing the transcription factor (TF) HLH-1, which is the worm homolog of the myogenic bHLH TF MyoD. For this, I developed a semi-automated high-throughput forward genetic screen combining EMS mutagenesis with the Biosorter system (Union Biometrica). When mis-expressed, HLH-1 induces muscle fate in early embryonic cells, but terminally differentiated cells are resistant to HLH-1-induced direct reprogramming. In order to identify mechanisms that antagonize HLH-1-induced reprogramming, I used a transgenic line allowing ectopic expression of hlh-1 in combination with a reporter for muscle fate. Using this approach, I isolated the mutant bar18, showing an accumulation of muscle cell nuclei around the posterior pharyngeal bulb. I identified the mutated locus using whole genome sequencing and characterized the identified gene and the mutant phenotype further. Additionally, I was also involved in characterizing the FACT complex, which was identified through a whole-genome RNAi screen conducted by my colleague Ena Kolundžić. This reverse genetic screen aimed at identifying factors that play a role in induced transdifferentiation by mis-expressing the TF CHE-1, a Zn-finger TF essential for terminal differentiation of glutamatergic ASE neurons. Interestingly, one of the FACT complex members, spt-16, is the parental gene of a previously uncharacterized pseudogene named F55A3.7. A putative null mutant of F55A3.7, combined with broad overexpression of CHE-1, showed a germ cells to neurons transdifferentiation phenotype. To our knowledge, this is the first example of a pseudogene whose depletion leads to the permissiveness of a certain tissue to be reprogrammed when challenged by a terminal selector TF. Due to this uniqueness, I characterized the pseudogene F55A3.7 and tried to find a potential mechanism for how F55A3.7 safeguards germline identity.

Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.

RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.