Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan des Menschen. Sie besitzt eine hohe Regenerationsfähigkeit nach Leberschädigung, die auf der Teilung der Hepatozyten beruht. Im Endstadium akuter oder chronischer Lebererkrankungen, wie z.B. dem akuten Leberversagen nach Pilzvergiftung oder bei Leberzirrhose, ist die Teilungsfähigkeit der Hepatozyten und somit das Regenerationspotential der Leber jedoch stark eingeschränkt, so dass eine Lebertransplantation die einzige Therapieoption ist. Allerdings erhalten ca. 30 % der Patienten auf der Warteliste für die Lebertransplantation keine Spenderleber. Eine Alter-native zur Behandlung von akuten und chronischen Lebererkrankungen wären mesenchymale Stammzellen. Sie können aus vielen Geweben z.B. Knochenmark, Fettgewebe, Leber u.a. isoliert werden. Durch die Sekretion von parakrinen Botenstoffen, wie Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren sowie dem direkten Zell-Zell Kontakt mit dem umliegenden Gewebe wirken mesenchymale Stammzellen immunmodulatorisch, anti-inflammatorisch, anti-apoptotisch und pro-proliferativ. Eine Subpopulation mesenchymaler Stammzellen aus der humanen Haut stellen ABCB5+ Stammzellen dar. In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass ABCB5+ Stammzellen für die Erneuerungsfähigkeit der humanen Haut mitverantwortlich sind und die Regeneration der Hornhaut des Auges positiv beeinflussen. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Frage, inwieweit ABCB5+ Stammzellen auch für die Therapie bei Lebererkrankungen geeignet sein könnten. Dazu wurde ihre hepatozytäre Differenzierungsfähigkeit in vitro sowie ihre Wirkung in vivo nach hepatischer Applikation getestet. Im Vordergrund standen hierbei die Fragen nach der Unbedenklichkeit der Applikation sowie die Wirkung auf leberspezifische Funktionen in einem xenogenen Transplantationsmodell in der Maus. Analysiert wurden adulte mesenchymale Ausgangsstammzellpräparationen (Parentalstammzellen) der humanen Haut und die daraus selektionierten ABCB5+ Stammzellen, die von der Firma RHEACELL GmbH & Co. KG zur Verfügung gestellt wurden. Bei den Parentalstammzellen handelt es sich um eine Mischpopulation, aus denen die ABCB5+ Stammzellen selektioniert wurden. Die undifferenzierten Parentalstammzellen und ABCB5+ Stammzellen wurden nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll zur hepatozytären Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen behandelt. In vitro wurden die Morphologie und Expression von hepatozytenspezifischen Markern, funktionelle Merkmale, wie der Fremdstoffmetabolismus und die Einlagerung von Glykogen, untersucht. Zur Analyse der von undifferenzierten und differenzierten ABCB5+ Stammzellen sezernierten Zytokine wurde eine Sekretomanalyse durchgeführt. In vivo wurden in immundefizienten Pfp/Rag2-/- Mäusen 7,5 x 105 undifferenzierte oder hepatogen differenzierte ABCB5+ Stammzellen nach einer 30 %igen Hepatektomie über die Milz injiziert. Der Einfluss der Zellen auf die Leber wurde u.a. anhand der Leberzellschädigung (AST/ALT-Bestimmung im Serum), der Proliferationsrate (Ki67-Immunhistochemie), Lipidakkumulation (Sudan III-Nachweis) und der Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1β, IL-6) 2 Tage und 7 Wochen nach der Transplantation analysiert. Die biochemische und zellbiologische Analyse zusammenfassend, zeigte sich, dass nach dem vorliegenden Protokoll keine der humanen Leber vergleichbare hepatogene Differenzierung der humanen Stammzellen erreicht wurde. Es wurde nur ein marginaler, aber signifikanter Anstieg leberspezifischer funktioneller Merkmale, wie der des Fremdstoffmetabolismus, beobachtet. Die Expression einiger leberspezifischer Gene nahm auf RNA-Ebene tendenziell, aber nicht signifikant zu. Nach hepatischer Applikation konnten die transplantierten Zellen in der Empfängerleber nicht nachgewiesen werden. Hervorzuheben ist jedoch, dass nach der Transplantation der differenzierten ABCB5+ Stammzellen keine auffälligen Veränderungen im Wirtslebergewebe nachgewiesen wurden. Es zeigten sich im Beobachtungszeitraum keine Nekrosen, Tumore oder eine Zunahme fibrotischer Veränderungen. Transaminasen waren nicht erhöht. Auch die Expression der untersuchten Gene war nicht verändert. Nach den vorliegenden Ergebnissen kann man davon ausgehen, dass die hier untersuchten Zellen kein ausgeprägtes hepatogenes Differenzierungspotential aufwiesen. Auch führte die hepatische Applikation nicht zur Integration und Proliferation der Zellen ins gesunde Wirtslebergewebe, so dass die Zellen wahrscheinlich keinen nennenswerten funktionellen Gewebeersatz liefern können. Allerdings zeigten sie auch keine leberschädigende Wirkung. Daher bleibt zu klären, ob die Zellen, beruhend auf ihrer parakrinen Wirkung, zur Regeneration der erkrankten Leber beitragen. Erste Hinweise darauf wurden in einem parallelen Projekt erbracht. Hier verbesserten die ABCB5+ Stammzellen die Fibrose in einem Zirrhosemodell in der Maus.

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RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren. / RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.