Die embryonale Neurogenese in Drosophila ist eine hochgradig koordinierte Abfolge von Zellschicksalsentscheidungen, die viele Ähnlichkeiten mit der Entwicklung des Nervensystems in Wirbeltieren aufweist. Diese Zellschicksalsentscheidungen sind räumlich und zeitlich koordiniert. Diese Zellen entstehen an stereotypen Positionen in jedem Segment und sind entlang zweier räumlicher Achsen angeordnet: der dorsoventralen und der anteroposterioren Achse. Neuroblasten teilen sich, um stereotype Zelllinien zu bilden, und die Zellen weisen charakteristische Zellmorphologien und -ziele auf, wobei die molekularen Mechanismen, die diese Merkmale bestimmen, noch weitgehend unbekannt sind. Jahrzehnte der Genetik haben einige Faktoren aufgedeckt, die für viele dieser Entscheidungen notwendig sind, aber ein Verständnis der einzelnen neurogenen Linien auf Genomebene war bis vor kurzem in vivo unmöglich. Ich habe mRNA aus Einzelzellen verwendet, um die Transkriptomdynamik von Schicksalsentscheidungen in der frühen Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Mein Ziel ist es, zu entschlüsseln, wie sich Zellen unterscheiden, wenn Entscheidungen getroffen werden, die für die Entwicklung des Nervensystems wesentlich sind. Ich habe Transkriptomdaten von einzelnen Zellen aus Zehntausenden von Neuroblasten während der gesamten embryonalen Neurogenese erstellt. Es gelang mir, spezifische neurogene Populationen und ihre Genexpressionsprofile entlang ihrer Differenzierungswege zu identifizieren. Ich konnte die komplizierten zeitlichen Achsen, die das sich entwickelnde embryonale Nervensystem formen, teilweise entschlüsseln - ein Prozess, der von der Fliege bis zum Menschen konserviert ist. Diese Arbeit hat die Identifizierung lokalisierter Marker und sogar spezifischer Neuroblasten ermöglicht. Dieses Verständnis kann nun mit Informationen über die einzelnen Zellschicksale kombiniert werden, aus denen diese Neuroblasten hervorgehen, wie z. B. ihre spezifischen neuronalen und glialen Schicksale. / Embryonic neurogenesis in Drosophila is a highly coordinated sequence of cell fate decisions that bears many similarities to the development of the nervous system in vertebrates. These cell fate decisions are spatially and temporally coordinated. These cells arise at stereotypic positions in each segment and are arranged along two spatial axes: the dorsoventral axis and the anteroposterior axis. Neuroblasts divide to give rise to stereotypic lineages and the cells exhibit characteristic cell morphologies, branching patterns, and targets, the molecular mechanisms that determine these characteristics are still largely unknown. Decades of genetics have uncovered some factors necessary for many of these decisions, but understanding individual neurogenic lineages at the genome level has been impossible in vivo until recently. I have used Single cell mRNA to study the transcriptome dynamics that accompany important fate decisions in early nervous system development. My goal is to decipher how cells differ when decisions are made that are essential for nervous system development. This knowledge is invaluable for developing models for the in vivo mechanisms that allow individual cells in the nervous system to specify and differentiate. I have generated transcriptome data of single cells from tens of thousands of neuroblasts throughout embryonic neurogenesis. I was able to identify specific neurogenic populations and their gene expression profiles along their differentiation pathways. I was able to partially decipher the intricate temporal axes that shape the developing embryonic nervous system, a process that is conserved from fly to human. Single-cell transcriptomics has enabled the identification of localized markers and even specific neuroblasts. This understanding can now be combined with information about the individual cell fates that give rise to these neuroblasts, such as their specific neuronal and glial fates.

Zirkuläre RNAs sind eine Klasse endogener, tierischer RNAs. Obwohl sie hoch abundant sind, ist weder ihre Funktion noch ihre Expression im Nervensystem bekannt. Es wurde ein Katalog zirkulärer RNAs in neuralen Proben erstellt. Es konnten tausende zirkuläre RNAs von Mensch und Maus entdeckt und analysiert werden. Zirkuläre RNAs sind außerordentlich angereichert im Säugetiergehirn, ihre Sequenz ist gut konserviert und sie sind häufig gemeinsam in Mensch und Maus exprimiert. Zirkuläre RNAs waren generell höher exprimiert im Verlauf der neuronalen Differenzierung, sind stark angereichert an Synapsen und oft differentiell exprimiert. circSLC45A4 ist die Hauptisoform, die in humanem präfrontalem, embryonalen Cortex von diesem genomischen Lokus exprimiert wird und eine der am höchsten exprimierten zirkulären RNAs in diesem System. Induzierte Verminderung der Expression von circSLC45A4 ist ausreichend, um die spontane neuronale Differenzierung einer humanen Neuroblastomzelllinie zu induzieren. Dies kann durch die verstärkte Expression neuronaler Markergene belegt werden. Verminderung der Expression von circSLC45A4 im embryonalen Mauscortex verursacht eine signifikante Reduktion von basalen Progenitoren. Außerdem wurde eine signifikante Reduktion von Zellen in der kortikalen Platte nach Depletion von circSLC45A4 gemessen. Weiterhin konnten die Ergebnisse im Mauscortex dekonvoliert werden. Dies zeigte die Zunahme von Cajal-Retzius Zellen. Es wird eine Methode vorgestellt, die RNA-Sequenzierung von Einzelzellen mit räumlicher Auflösung zulässt, ohne vorherige Kenntnisse des Systems zu benötigen. 3D-seq vereint die Applikation eines physischen Gitters mit kombinatorischem Indizieren, so dass Einzelzellen individuell und räumlich markiert werden können. 3D-seq wurde an koronalen Schnitten von adultem Mausgehirn etabliert. Die Daten wurden zur Reproduktion des Gewebes in silico genutzt. 3D-seq ein leicht zu adaptierendes Protokoll, das an jedem Gewebe angewendet werden kann. / Circular RNAs (circRNAs) are an endogenous class of animal RNAs. Despite their abundance, their function and expression in the nervous system are unknown. Therefore, a circRNA catalogue comprising RNA-seq samples from different brain regions, primary neurons, synaptoneurosomes, as well as during neuronal differentiation was created. Using these and other available data, thousands of neuronal human and mouse circRNAs were discovered and analyzed. CircRNAs were extraordinarily enriched in the mammalian brain, well conserved in sequence, often expressed as circRNAs in both human and mouse, and sometimes even detected in Drosophila brains. CircRNAs were overall upregulated during neuronal differentiation, highly enriched in synapses, and often differentially expressed compared to their corresponding mRNA isoforms. CircRNA expression correlated negatively with expression of the RNA-editing enzyme ADAR1. Knockdown of ADAR1 induced elevated circRNA expression. Together, a circRNA brain expression atlas and evidence for important circRNA functions is provided. Starting from this catalogue a circRNA, circSLC45A4 was identified. It is the main RNA isoform produced from its genetic locus in the developing human frontal cortex and one of the highest expressed circRNAs in that system. Knockdown of this conserved circular RNA in a human neuroblastoma cell line was sufficient to induce spontaneous neuronal differentiation, measurable by increased expression of neuronal marker genes and neurite outgrowth. Depletion of circSlc45a4 in the developing mouse cortex caused a significant reduction of the basal progenitor pool and increased the expression of neurogenic regulators like Notch2, Foxp2, and Unc5b. Furthermore, a significant depletion of cells in the cortical plate after knockdown of circSlc45a4 was observed. In addition, deconvolution of the bulk RNA-seq data with the help of single cell RNA-seq data validates the depletion of basal progenitors after knockdown of circSlc45a4 in the mouse cortex and reveals an increase in Cajal-Retzius cells. Taken together, a detailed study of a conserved circular RNA that is necessary to maintain the pool of neural progenitors in vitro and in vivo is presented. The developing mouse cortex is a good illustration for a highly spatially organized tissue and why knowledge of spatial information for each cell can be of great importance. However, obtaining transcriptome-wide and spatially resolved information from single-cells has been proven to be a challenging task. Current state-of-the-art experimental methods are either limited by the number of genes that can be detected simultaneously within a single-cell or require preexisting spatial information. Here, 3D-seq, a new experimental technique that allows unbiased, high-throughput single-cell spatial transcriptomics is introduced. 3D-seq combines a physical grid with combinatorial indexing to label single cells of any tissue in a unique way and thereby preserving the approximate spatial localization of any given cell. 3D-seq was applied to coronal slices of adult mouse brain, more than 70 cell types were identified and the 3D-seq data was used to reproduce the tissue in silico with single-cell resolution. Furthermore, 3D-seq is easy to adapt, can be applied to any tissue and can be combined with other technologies.

HOX-Gene sind essentielle Transkriptionsfaktoren (TFs), die den Körperplan, die Struktur und die Organbildung während der Entwicklung bestimmen. Diese komplexen Prozesse werden präzise von in verschachtelter Weise exprimierten HOX-Genen reguliert. In vitro Experimente zeigten jedoch, dass die HOX-DNA-Bindungsdomäne stark konserviert ist und oft ähnliche DNA-Sequenzen bindet. Die niedrige biochemische Bindungsspezifität und die hochspezifischen Funktionen stehen oft im Widerspruch und bilden das Schlussthema des so genannten Hox-Paradoxons. Das Paradox besteht aufgrund der folgenden Hindernisse: hohe Proteinhomologie, unspezifischen Antikörper sowie die verschachtelte HOX-Expressionsmuster. Das Ziel dieser Arbeit war, diese Probleme zu überwinden, die HOX-DNA-Bindung in kontrollierten und physiologischen Umstände zu untersuchen und die Bindung von neun Gliedmaßen-spezifischen posterioren HOXA und -D-TFs zu vergleichen. Zu diesem Zweck wurden neun Hühner-HOX-Gene (HOXA- und HOXD9-13) mit dem FLAG markiert und mittels Viren in Gliedmaßen-mesenchymalen Zellen exprimiert. Somit wurde der Vergleich unter identischen und kontrollierten Bedingungen ermöglicht. Im Einklang mit in vivo Funktionsdaten zeigten die HOX-Bindungsprofile, dass zwei direkte Paraloge (z. B. HOXA10 und D10) häufiger dieselben Regionen binden als zwei Nicht-Paraloge (z. B. HOXA9 und A13). Außerdem, die hier beschriebene HOX-DNA-Bindung unterscheidet sich von in vitro Bindung, was darauf hinweist, dass Kofaktoren für deren biologische Funktion wichtig sind. Zusätzlich ergab sich aus dem Bindungsvergleich, dass es zuvor unbekannte Unterschiede zwischen Bindungsweise von HOX-TFs gibt, die zumindest teilweise auf der Häufigkeit von direkter Bindung und Ko-Bindung mit anderen TFs beruhen. Schließlich wurde mit der Kombination von Genetik, Genomik und Biochemie einen neuen HOX-Kofaktor entdeckt, CTCF, der auf ein mögliches Wechselspiel zwischen der HOX-Zielregulation und der Chromatinarchitektur hindeutet. / HOX genes are essential developmental transcription factors (TFs) that pattern the animal body plan, their structures and organs. To precisely control these very diverse processes HOX genes are expressed in a nested fashion and regulate their targets in a context specific way. However, in vitro experiments indicated that HOX DNA binding domain (Homeodomain) is remarkably rigid and often binds very similar DNA sequences. This discrepancy between high functional specificity and low in vitro biochemical specificity is at the core of a problem termed Hox paradox. This paradox persists due to several biological and technical obstacles; namely high HOX protein homology and lack of sufficiently specific antibodies as well as nested HOX expression pattern. The aim of this study was to address these problems, study HOX-DNA binding in a controlled, Hox-native environment and to compare HOX-DNA binding of nine posterior vertebrate HOXA and HOXD TFs. To do this, nine chicken HOX genes (HOXA9-13 and HOXD9-13) were FLAG-tagged and virally expressed in chicken mesenchymal limb-derived cells enabling comparison of their binding in an identical setup and controlled conditions. HOX binding profiles uncovered two direct paralogues (i.e. HOXA10 and D10) bind more often same regions than two non-paralogues (i.e. HOXA9 and A13) reminiscent of in vivo functional data. Moreover, the here described in vivo HOX-DNA binding differs from in vitro binding, indicating the importance of cofactors and biological context for HOX binding and functional outcome. Additionally, binding comparison uncovered previously unknown differences between binding modes of HOX-TFs that at least partially rely on the abundance of direct binding and co-binding with other TFs. Finally, with combination of genetics, genomics and biochemistry a novel HOX cofactor, CCCTC binding factor (CTCF), was discovered suggesting potential interplay between HOX target regulation and chromatin architecture.

Angeborene lymphoide Zellen (ILCs) bilden eine Familie von Effektorzellen des angeborenen Immunsystems, denen somatisch rekombinierte Antigenrezeptoren fehlen und die in drei Hauptgruppen eingeteilt werden. In der Embryonalentwicklung spielen Typ 3 ILCs, sogenannte LTi (Lymphoid Tissue inducer) Zellen, eine zentrale Rolle in der Entwicklung von Lymphknoten. ILC3, einschließlich LTi Zellen sind abhängig von dem Master-Transkriptionsfaktor RORgt, was sich in RORgt-defizienten Mäuse durch die Abwesenheit aller ILC3, und auch durch fehlende Lymphknoten äußert. Während postnatale Ko-expression der Transkriptionsfaktoren T-bet und RORgt in ILC3-Subpopulationen fest etabliert ist, ist der Einfluss von T-bet in fötalen ILC3 und auf die Generation von Lymphknoten noch unbekannt. Um diese Mechanismen genau zu untersuchen, wurden fötale ILCs mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung charakterisiert, wodurch eine unerwartete Heterogenität innerhalb der ILC3 mit T-bet-exprimierenden Zellen aufgedeckt wurde. Außerdem wurden PLZF+ ILC-Vorläufer (ILCP) im sich entwickelnden Darm nachgewiesen. Weiterhin, bestätigen diverse Mausmodelle eine Schlüsselrolle für T bet in der Regulation der ILC-Differenzierung und der Entstehung von Lymphknoten. Die zusätzliche genetische Ablation von T-bet in RORgt-defizienten Mäusen beeinflusste Differenzierungsentscheidungen in fötalen ILCP und ermöglichte die Akkumulation von ILCP mit LTi-Aktivität, wodurch die Organogenese von Lymphknoten, unabhängig von RORgt wiederhergestellt wurde. PLZF+ ILCP von RORgt/T-bet-Doppeldefizienten Mäusen bestanden bis ins Erwachsenenalter, wo diese Zellen die Darmbarrierefunktionen durch Produktion von IL-22 wiederherstellten. Darüber hinaus erwies sich RORa als entscheidend für die Entwicklung von PLZF+ ILCP und die damit verbundene Bildung von Lymphknoten. / Innate lymphoid cells (ILCs) represent a family of innate effector cells lacking rearranged antigen receptors, which are classified into three main groups based on their lineage-specifying transcription factors (TF) and effector functions. During embryonic development, the formation of lymphoid organs critically relies on a specific member of group 3 innate lymphoid cells (ILC3), expressing the master transcription factor RORgt and exhibiting lymphoid tissue inducer (LTi) functions. Accordingly, RORgt-deficient mice lack ILC3 and do not generate lymph nodes (LN). While it is established that T-bet is co-expressed with RORgt in a subset of ILC3 emerging postnatally and influencing their differentiation, phenotype and functions, the effect of T-bet on fetal ILC3 biology and its impact on LN generation remains completely unknown. In order to study the role of T-bet in fetal ILC3 differentiation and functions as well as in LN formation, single-cell RNA sequencing and flow cytometry were applied to characterize fetal ILC subsets revealing an unanticipated heterogeneity within embryonic ILC3 and identifying T-bet+ ILC3 subsets within the fetal intestine and mesenteric LN anlage for the first time. Furthermore, PLZF+ ILC progenitors (ILCP) were exposed in the developing mouse intestine. Importantly, using multiple mouse models, a key role for T-bet in regulating ILC differentiation and LN formation was discovered. Specifically, additional deficiency of T-bet in RORgt-deficient mice skewed lineage fate decisions in differentiating fetal ILCP and allowed accumulation of ILCP with LTi activity, thereby rescuing LN organogenesis in a RORgt-independent fashion. PLZF+ ILCP of RORgt/T-bet double deficient mice persisted into adulthood where these cells restored intestinal barrier functions through reinstalled IL-22 production. Moreover, RORa was found to be critical for the development of PLZF+ ILCP and associated LN formation.