Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung zirkulärer RNA. Das erste Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Erstellung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Generierung einer funktionalisierten zirkulären RNA. Hierbei konnte zunächst erfolgreich eine Vorschrift zur Herstellung unmodifizierter circRNA etabliert werden. Im zweiten Schritt gelang auch die Generierung einer zirkulären RNA mit Alkin-Funktionalisierung. Geringe Ausbeuten gaben Anlass zur Entwicklung eines alternativen Verfahrens, bei dem die Zyklisierung von Kopf-Schwanz modifizierter RNA durch CuAAC vorgenommen werden sollte. Dabei konnte zunächst eine 5‘-azidmodifizierte RNA durch in vitro Transkription gebildet werden, die anschließend am 3‘-Terminus mit einem 3‘ alkinmodifizierten Baustein mit Aminfunktionalität versehen wurde. Daraufhin konnte erfolgreich eine Zyklisierung mittels CuAAC vorgenommen werden. Ein grundlegendes Problem bei diesen Arbeiten war der Nachweis, dass die gebildete RNA tatsächlich in zirkulärer Form vorlag. Im Rahmen des zweiten Projektes dieser Arbeit wurde ein Assay zur direkten Unterscheidung von zirkulären und linearen Transkripten etabliert. Mittels reverser Transkription konnte ein rolling circle Mechanismus mit dem zirkulären Transkript durchgeführt werden, was in einer multimeren cDNA resultierte. Nach Amplifizierung über qPCR ermöglichteeine Gelanalyse den Nachweis eines spezifischen Bandenmusters für das circRNA-Transkript, wohingegen das lineare Transkript lediglich eine monomere Bande generierte. Anschließend erfolgte die Weiterentwicklung des Assays zu einer spezifischen Nachweismethode für zirkuläre RNA in biologischen Proben.Dabei kann eine abschließende Gelanalyse zur Identifizierung von falsch-positiven Ergebnissen genutzt werden. Die hier etablierte Methode ermöglicht künftig einen schnellen und einfachen Nachweis von circRNA beim Screeningvon biologischen Proben. / Circular RNAs belong to the group of long, non-coding RNAs and have gene regulating functions, comparable to miRNA. However, the field of circRNA research is proceeding slowly due to the lack of efficient analytical methods. That‘s the reason why the development of new analytical methods plays a keyrole within characterisation and identification of circRNAs. This thesis comprises two projects dealing on one hand with the creation of a protocol for the generation of functional circRNA on and the other hand, an assay to differentiate circular and linear RNA. For the generation of circRNA a non-modified circRNA was produced as positiv control by using T4 RNA ligase 2. After the addition of a modification step with T4 RNA ligase 1, it was possible to generate circRNA with alkyne functionalization. Due to limited yields of modified circRNA, the protocol was adapted and a protocol for chemical ligation was established. In this new procedure a RNA with 5‘-azido modification was generated by in vitro transcription, followed by incorporation of a 3‘-alkyne modified building block with additional amine funktionality at the RNA-3‘-end. Consecutively, it was possible to perform a cyclization with the double modified RNA by CuAAC. The second project comprises the establishment of an assay in order to differentiate circular and linear RNA. A rolling circle mechanism was utilized by reverse transcription of a circular RNA transcript, resulting in a multimeric cDNA. Following DNA amplification by qPCR, a specific fragmentation pattern for circRNA was verified by gel electrophoresis. In contrast to this, for linear RNA, a monomeric DNA pattern was seen. Subsequently the assay was advanced to a detection method for circular RNA in biological samples. A final gel electrophoresis allows the identification of false-positive results. In the future, the here developed method can be applied for fast and easy detection of circRNAs in biological samples.

Zirkuläre RNAs sind eine Klasse endogener, tierischer RNAs. Obwohl sie hoch abundant sind, ist weder ihre Funktion noch ihre Expression im Nervensystem bekannt. Es wurde ein Katalog zirkulärer RNAs in neuralen Proben erstellt. Es konnten tausende zirkuläre RNAs von Mensch und Maus entdeckt und analysiert werden. Zirkuläre RNAs sind außerordentlich angereichert im Säugetiergehirn, ihre Sequenz ist gut konserviert und sie sind häufig gemeinsam in Mensch und Maus exprimiert. Zirkuläre RNAs waren generell höher exprimiert im Verlauf der neuronalen Differenzierung, sind stark angereichert an Synapsen und oft differentiell exprimiert. circSLC45A4 ist die Hauptisoform, die in humanem präfrontalem, embryonalen Cortex von diesem genomischen Lokus exprimiert wird und eine der am höchsten exprimierten zirkulären RNAs in diesem System. Induzierte Verminderung der Expression von circSLC45A4 ist ausreichend, um die spontane neuronale Differenzierung einer humanen Neuroblastomzelllinie zu induzieren. Dies kann durch die verstärkte Expression neuronaler Markergene belegt werden. Verminderung der Expression von circSLC45A4 im embryonalen Mauscortex verursacht eine signifikante Reduktion von basalen Progenitoren. Außerdem wurde eine signifikante Reduktion von Zellen in der kortikalen Platte nach Depletion von circSLC45A4 gemessen. Weiterhin konnten die Ergebnisse im Mauscortex dekonvoliert werden. Dies zeigte die Zunahme von Cajal-Retzius Zellen. Es wird eine Methode vorgestellt, die RNA-Sequenzierung von Einzelzellen mit räumlicher Auflösung zulässt, ohne vorherige Kenntnisse des Systems zu benötigen. 3D-seq vereint die Applikation eines physischen Gitters mit kombinatorischem Indizieren, so dass Einzelzellen individuell und räumlich markiert werden können. 3D-seq wurde an koronalen Schnitten von adultem Mausgehirn etabliert. Die Daten wurden zur Reproduktion des Gewebes in silico genutzt. 3D-seq ein leicht zu adaptierendes Protokoll, das an jedem Gewebe angewendet werden kann. / Circular RNAs (circRNAs) are an endogenous class of animal RNAs. Despite their abundance, their function and expression in the nervous system are unknown. Therefore, a circRNA catalogue comprising RNA-seq samples from different brain regions, primary neurons, synaptoneurosomes, as well as during neuronal differentiation was created. Using these and other available data, thousands of neuronal human and mouse circRNAs were discovered and analyzed. CircRNAs were extraordinarily enriched in the mammalian brain, well conserved in sequence, often expressed as circRNAs in both human and mouse, and sometimes even detected in Drosophila brains. CircRNAs were overall upregulated during neuronal differentiation, highly enriched in synapses, and often differentially expressed compared to their corresponding mRNA isoforms. CircRNA expression correlated negatively with expression of the RNA-editing enzyme ADAR1. Knockdown of ADAR1 induced elevated circRNA expression. Together, a circRNA brain expression atlas and evidence for important circRNA functions is provided. Starting from this catalogue a circRNA, circSLC45A4 was identified. It is the main RNA isoform produced from its genetic locus in the developing human frontal cortex and one of the highest expressed circRNAs in that system. Knockdown of this conserved circular RNA in a human neuroblastoma cell line was sufficient to induce spontaneous neuronal differentiation, measurable by increased expression of neuronal marker genes and neurite outgrowth. Depletion of circSlc45a4 in the developing mouse cortex caused a significant reduction of the basal progenitor pool and increased the expression of neurogenic regulators like Notch2, Foxp2, and Unc5b. Furthermore, a significant depletion of cells in the cortical plate after knockdown of circSlc45a4 was observed. In addition, deconvolution of the bulk RNA-seq data with the help of single cell RNA-seq data validates the depletion of basal progenitors after knockdown of circSlc45a4 in the mouse cortex and reveals an increase in Cajal-Retzius cells. Taken together, a detailed study of a conserved circular RNA that is necessary to maintain the pool of neural progenitors in vitro and in vivo is presented. The developing mouse cortex is a good illustration for a highly spatially organized tissue and why knowledge of spatial information for each cell can be of great importance. However, obtaining transcriptome-wide and spatially resolved information from single-cells has been proven to be a challenging task. Current state-of-the-art experimental methods are either limited by the number of genes that can be detected simultaneously within a single-cell or require preexisting spatial information. Here, 3D-seq, a new experimental technique that allows unbiased, high-throughput single-cell spatial transcriptomics is introduced. 3D-seq combines a physical grid with combinatorial indexing to label single cells of any tissue in a unique way and thereby preserving the approximate spatial localization of any given cell. 3D-seq was applied to coronal slices of adult mouse brain, more than 70 cell types were identified and the 3D-seq data was used to reproduce the tissue in silico with single-cell resolution. Furthermore, 3D-seq is easy to adapt, can be applied to any tissue and can be combined with other technologies.

Circular RNAs (circRNAs) sind eine große Klasse endogener RNAs, die in Organismen vorkommen, die RNA-Transkripte durch Spleißen prozessieren. Sie sind Produkte des „backsplicing“ – einer Art des alternativen Spleißens, bei der das 3‘-Ende eines Exons mit einer vorgelagerten 5‘-„splice site“ verbunden wird. Trotz ihrer Abundanz und spezifischen Expressionsmustern sind in vivo-Funktionen von circRNAs größtenteils unbekannt. Wir haben den existierenden Kenntnisstand systematisiert und diesen in Form von circBase frei zugänglich gemacht. circBase ist eine Online-Datenbank, in der circRNA-Datensätze abgerufen und im genomischen Kontext durchsucht und visualisiert werden können. Für die Arbeit mit Hochdurchsatz-circRNA-Daten haben wir des Weiteren die Software ciRcus entwickelt. Um mehr bezüglich circRNA-Expression und möglicher Funktionen zu lernen, haben wir die Expressionsmuster im Säugetiergehirn umfassend erforscht. Mithilfe von eigenen und öffentlich zugänglichen RNA-Sequenzierungsdaten haben wir Tausende von neuralen circRNAs in Mensch und Maus entdeckt. circRNAs waren während der neuronalen Differenzierung und Reifung insgesamt hochreguliert, stark angereichert in Synapsen, und oft differentiell exprimiert im Vergleich zu ihren mRNA-Isoformen. Außerdem haben wir gezeigt, dass viele circRNAs zwischen Mensch und Maus konserviert sind. Schließlich haben wir in vivo-Funktionen von Cdr1as erforscht - einer konservierten und im Gehirn hoch exprimierten circRNA, die stark von microRNA (miRNA)-Effektor-Komplexen gebunden ist und zahlreiche miR-7-Bindestellen sowie eine Bindestelle für miR-671 aufweist. „Knockout“-Tiere, bei denen der Cdr1as-Lokus deletiert wurde, zeigten ein gestörtes sensomotorisches „gating“ und dysfunktionale synaptische Übertragung. Die Expression von miR-7 und miR-671 war in verschiedenen Hirnregionen der Tiere dereguliert. Die Expression von „immediate early“-Genen, von denen einige miR-7-Zielgene sind, war erhöht. / circular RNAs (circRNAs) are a large class of endogenous RNAs present in organisms that process RNA transcripts by splicing. They are products of backsplicing - alternative splicing reactions where the 3’ end of an exon is spliced to an upstream 5’ splice site. Despite their abundance and tissue- and developmental-stage-specific expression patterns, their in vivo functions are largely unknown. We systematized the existing knowledge on circRNAs and made it freely available by developing circBase - an online database where circRNA datasets can be accessed, downloaded and browsed within the genomic context. Another technical challenge was addressed by developing ciRcus - a software package for working with high-throughput circRNA data, which allowed us to routinely handle, explore, annotate, quantify and integrate circRNA data with the external sources of biological data. To learn more about circRNA expression and potential functions, we have explored the expression patterns of circRNAs in the mammalian brain. Using own and public RNA-seq data, we discovered thousands of neural circRNAs in human and mouse. circRNAs were upregulated during neuronal differentiation and maturation, enriched in synapses, and often differentially expressed compared to their host mRNAs. Many circRNAs were conserved between human and mouse. Finally, we explored in vivo functions of Cdr1as - a conserved circRNA known to be highly expressed in the brain, heavily bound by microRNA (miRNA) effector complexes, and harbouring many binding sites for miR-7, as well as a single binding site for miR-671. Upon deleting the Cdr1as locus, knockout animals displayed impaired sensorimotor gating and dysfunctional synaptic transmission. Expression of miR-7 and miR-671 was deregulated in different brain regions of Cdr1as knockout animals. Expression of immediate early genes, some of which are miR-7 targets, was increased, providing a possible molecular link to the behavioral phenotype.