Intrazelluläre Protein- und RNA-Lokalisation ist ein lebenswichtiger molekularer Mechanismus. Ihm unterliegen sowohl die äußere Gestaltung der Zellform, Zellagilität, zelluläre Differenzierung sowie die intra- sowie interzelluläre Kommunikation. Diverse Krankheiten werden mit Fehlfunktionen des intrazellulären Molekültransportes assoziiert und es existieren unzählige Beispiele für bekannte Wege des intrazellulären Protein- und RNA-Transportes. Allerdings ist die globale Komposition lokaler Protein- und RNA-Reservoirs bisher kaum wissenschaftlich erforscht worden. In dieser Studie beschreibe ich die Protein- sowie RNA-Kompositionen subzellulärer Fraktionen zweier neuronaler Zelltypen. Die Neuriten und Somata von Neuroblastoma-Zellen (N1E-115) und Ascl1 induzierten Neuronen (beides Mauszellen) wurden mechanisch voneinander separiert und mittels RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie auf ihre Bestandteile untersucht. Die Verteilung von mRNAs korreliert signifikant mit der Verteilung der entsprechenden Proteine in Ascl1-iNs während in der Neuroblastoma Zelllinie N1E-115 kein solcher Trend nachgewiesen werden konnte. Der Vergleich zu Datensätzen von anderen Zellsystemen und Methoden zeigt, dass das lokale Proteom sowie das lokale Transkriptome und Translatome stark Zelltyp spezifisch ist. Um den Einfluss lokaler Proteinbiosynthese auf die Komposition subzellulärer Proteinpools zu erheben, habe ich die Lokalisation neu synthetisierter Proteine untersucht. Es scheint, als sei die RNA-Lokalisation und lokale Translation von hoher Relevanz für die Protein-Lokalisation in diesen stark polarisierten Zellsystemen. Des Weiteren stelle ich eine Methode vor, um de novo „zip codes“ in diesen neuronalen Zellsystemen zu identifizieren. Diese könnte ein elementar wichtiger Schritt sein, um Fehlfunktionen im interzellulären Molekültransport zu verstehen. / Intracellular protein and RNA localization is one of the mayor players in the formation of cell shape, enabling cell agility, cellular differentiation and cell signaling. Various diseases are associated with malfunctions of intracellular molecule transport. There are many known pathways of how and why proteins and RNAs are transported within the cell and where they are located, though there is not much known about the global distribution of proteins and RNAs within the cell. In this study I apply a subcellular fractionation method coupled to multiple omics approaches to investigate the global distribution of mRNAs, noncoding RNAs and proteins in neuronal cells. Neurites and soma from mouse neuroblastoma cells (N1E-115) as well as from Ascl1 induced neurons (Ascl1-iNs) were isolated and the composition of the spatial proteome and transcriptome was examined. The localization of mRNAs correlates significantly with the localization of their corresponding protein products in Ascl1-iNs whereas it does not in the mouse neuroblastoma cell line N1E-115. Comparing these datasets with recently published data of other cell lines and methods it is clear, that the local proteome, transcriptome and translatome of neuronal cells is highly cell type specific. To investigate how spatial protein pools are established I analyzed local pools of newly synthesized proteins revealing that many proteins are synthesized on the spot. RNA localization therefore plays a crucial role in generating local protein pools in these highly polarized cell systems. Additionally, I propose a method to identify on a global scale de novo “zip codes” in these cell systems which would be a great step towards understanding malfunctions in molecule transport.

Zirkuläre RNAs sind eine Klasse endogener, tierischer RNAs. Obwohl sie hoch abundant sind, ist weder ihre Funktion noch ihre Expression im Nervensystem bekannt. Es wurde ein Katalog zirkulärer RNAs in neuralen Proben erstellt. Es konnten tausende zirkuläre RNAs von Mensch und Maus entdeckt und analysiert werden. Zirkuläre RNAs sind außerordentlich angereichert im Säugetiergehirn, ihre Sequenz ist gut konserviert und sie sind häufig gemeinsam in Mensch und Maus exprimiert. Zirkuläre RNAs waren generell höher exprimiert im Verlauf der neuronalen Differenzierung, sind stark angereichert an Synapsen und oft differentiell exprimiert. circSLC45A4 ist die Hauptisoform, die in humanem präfrontalem, embryonalen Cortex von diesem genomischen Lokus exprimiert wird und eine der am höchsten exprimierten zirkulären RNAs in diesem System. Induzierte Verminderung der Expression von circSLC45A4 ist ausreichend, um die spontane neuronale Differenzierung einer humanen Neuroblastomzelllinie zu induzieren. Dies kann durch die verstärkte Expression neuronaler Markergene belegt werden. Verminderung der Expression von circSLC45A4 im embryonalen Mauscortex verursacht eine signifikante Reduktion von basalen Progenitoren. Außerdem wurde eine signifikante Reduktion von Zellen in der kortikalen Platte nach Depletion von circSLC45A4 gemessen. Weiterhin konnten die Ergebnisse im Mauscortex dekonvoliert werden. Dies zeigte die Zunahme von Cajal-Retzius Zellen. Es wird eine Methode vorgestellt, die RNA-Sequenzierung von Einzelzellen mit räumlicher Auflösung zulässt, ohne vorherige Kenntnisse des Systems zu benötigen. 3D-seq vereint die Applikation eines physischen Gitters mit kombinatorischem Indizieren, so dass Einzelzellen individuell und räumlich markiert werden können. 3D-seq wurde an koronalen Schnitten von adultem Mausgehirn etabliert. Die Daten wurden zur Reproduktion des Gewebes in silico genutzt. 3D-seq ein leicht zu adaptierendes Protokoll, das an jedem Gewebe angewendet werden kann. / Circular RNAs (circRNAs) are an endogenous class of animal RNAs. Despite their abundance, their function and expression in the nervous system are unknown. Therefore, a circRNA catalogue comprising RNA-seq samples from different brain regions, primary neurons, synaptoneurosomes, as well as during neuronal differentiation was created. Using these and other available data, thousands of neuronal human and mouse circRNAs were discovered and analyzed. CircRNAs were extraordinarily enriched in the mammalian brain, well conserved in sequence, often expressed as circRNAs in both human and mouse, and sometimes even detected in Drosophila brains. CircRNAs were overall upregulated during neuronal differentiation, highly enriched in synapses, and often differentially expressed compared to their corresponding mRNA isoforms. CircRNA expression correlated negatively with expression of the RNA-editing enzyme ADAR1. Knockdown of ADAR1 induced elevated circRNA expression. Together, a circRNA brain expression atlas and evidence for important circRNA functions is provided. Starting from this catalogue a circRNA, circSLC45A4 was identified. It is the main RNA isoform produced from its genetic locus in the developing human frontal cortex and one of the highest expressed circRNAs in that system. Knockdown of this conserved circular RNA in a human neuroblastoma cell line was sufficient to induce spontaneous neuronal differentiation, measurable by increased expression of neuronal marker genes and neurite outgrowth. Depletion of circSlc45a4 in the developing mouse cortex caused a significant reduction of the basal progenitor pool and increased the expression of neurogenic regulators like Notch2, Foxp2, and Unc5b. Furthermore, a significant depletion of cells in the cortical plate after knockdown of circSlc45a4 was observed. In addition, deconvolution of the bulk RNA-seq data with the help of single cell RNA-seq data validates the depletion of basal progenitors after knockdown of circSlc45a4 in the mouse cortex and reveals an increase in Cajal-Retzius cells. Taken together, a detailed study of a conserved circular RNA that is necessary to maintain the pool of neural progenitors in vitro and in vivo is presented. The developing mouse cortex is a good illustration for a highly spatially organized tissue and why knowledge of spatial information for each cell can be of great importance. However, obtaining transcriptome-wide and spatially resolved information from single-cells has been proven to be a challenging task. Current state-of-the-art experimental methods are either limited by the number of genes that can be detected simultaneously within a single-cell or require preexisting spatial information. Here, 3D-seq, a new experimental technique that allows unbiased, high-throughput single-cell spatial transcriptomics is introduced. 3D-seq combines a physical grid with combinatorial indexing to label single cells of any tissue in a unique way and thereby preserving the approximate spatial localization of any given cell. 3D-seq was applied to coronal slices of adult mouse brain, more than 70 cell types were identified and the 3D-seq data was used to reproduce the tissue in silico with single-cell resolution. Furthermore, 3D-seq is easy to adapt, can be applied to any tissue and can be combined with other technologies.

Die asymmetrische Verteilung von mRNA und Proteinen innerhalb einer Zelle definiert die Polarität. Dies ermöglicht eine strikte Regulierung der Genexpression in Raum und Zeit. Ich habe in dieser Arbeit untersucht, wie das Soma und die Neuriten in induzierten Neuronen sich hinsichtlich ihres Transkriptoms und Translatoms unterscheiden. Eine räumliche ribosomale Profilanalyse ergab, dass die Hälfte des lokalen Proteoms durch die mRNA-Lokalisierung und der lokalen Translation definiert wird. Dies sind Prozesse, die durch die synergistische Aktivität von trans- und cis-agierenden Elementen durchgeführt werden. In dieser Arbeit konzentrierte ich mich auf MOV10 als trans-agierendes Element und die alternativen 3′UTRs als cis-agierende Elemente, um ihre Rolle in der Asymmetrie zu untersuchen. MOV10 ist eine RNA-Helikase, welche an vielen Aspekten des RNA-Metabolismus beteiligt ist. Mit den Methoden RIP und PAR-CLIP konnte ich zeigen, dass sowohl MOV10-Ziele als auch MOV10 selbst in den Neuriten lokalisiert sind. Aus ̈erdem ist MOV10 möglicherweise an der translationalen Repression mitinvolviert. In der Tat konnte ich unter den MOV10-Protein-Interaktoren mehrere Proteine identifizieren, welche an der translationalen Repression beteiligt sind, wie z.Bsp. AGO2, FMR1, und TRIM71. Für die Identifizierung der cis-agierenden Elemente führte ich das "Mapping" von alternativen 3′UTRs durch. Diese Analyse zeigte mehrere Gene, die differentiell lokalisierte 3′UTR-Isoformen exprimieren. Insbesondere habe ich mich auf Cdc42 konzentriert. Ich konnte beweisen, dass die beiden Isoformen von Cdc42 auf mRNA-Ebene unterschiedlich lokalisiert sind und dass die 3′UTR der entscheidende Faktor für die mRNA- und Proteinlokalisierung ist. Darüber hinaus habe ich mehrere RBPs identifiziert, die an der Cdc42-Lokalisierung beteiligt sind. Diese Analyse zeigt, dass für die differenzierte Lokalisierung von funktional unterschiedlichen alternativen Protein-Isoformen die Verwendung von alternativen 3′UTR Isoformen als neu-entdeckter Mechanismus eine entscheidende Rolle spielt. / Asymmetric distribution of mRNA and proteins inside a cell defines polarity, which allow tight regulation of gene expression in space and time. In this thesis I investigated how asymmetric distribution characterizes the somatic and neuritic compartments of in induced neurons, in terms of transcriptome and translatome. Spatial ribosome profiling analysis revealed that half of the local proteome is defined by mRNA localization and local translation. These, are processes accomplished by the synergistic activity of trans- and cis-acting elements. I focused on MOV10 as trans-acting element, and on alternative 3′UTRs as cis-elements, to investigate their role in asymmetry. MOV10 is an RNA helicase which participates to many aspects of RNA metabolism. With RIP and PAR-CLIP I showed that MOV10 targets are localized to the neurites, consistently with MOV10-neuritic localization, and that MOV10 might be involved in translational repression. Indeed, among MOV10 protein interactors, I identified several proteins involved in translational repression, i.e. AGO2, FMR1, and TRIM71. On the side of cis-elements, I performed mapping of alternative 3′UTRs. This analysis identified several genes expressing differentially localized 3′UTR isoforms. In particular, I focused on Cdc42. I showed that the two isoforms of Cdc42 are differentially localized at mRNA level, and that the 3′UTR is the driver of mRNA and protein localization. Moreover, I identified several RBPs that might be involved in Cdc42 localization. This analysis points to usage of alternative 3′UTR isoforms as a novel mechanism to provide for differential localization of functionally diverse alternative protein isoforms.

Neuronen sind bei der Informationsübertragung des zentralen Nervensystems von entscheidender Bedeutung. Ihre Aktivität liegt der Signalverarbeitung und höheren kognitiven Prozessen zugrunde. Neuronen sind in den extrazellulären Raum eingebettet, der mehrere Teilchen, darunter auch Ionen, enthält. Ionenkonzentrationen sind nicht statisch. Intensive neuronale Aktivität kann intrazelluläre und extrazelluläre Ionenkonzentrationen verändern. In dieser Arbeit untersuche ich das Wechselspiel zwischen neuronaler Aktivität und der Dynamik der Ionenkonzentrationen. Dabei konzentriere ich mich hauptsächlich auf extrazelluläre Kalium- und intrazelluläre Natriumkonzentrationen. Mit Hilfe der Theorie dynamischer Systeme zeige ich, wie moderate Änderungen dieser Ionenkonzentrationen die neuronale Aktivität qualitativ verändern können, wodurch sich möglicherweise die Signalverarbeitung verändert. Dann modelliere ich ein leitfähigkeitsbasiertes neuronales Netzwerk mit Spikes. Das Modell sagt voraus, dass eine moderate Änderung der Konzentrationen, die einen Mikroschaltkreis von Neuronen umgeben, die Leistungsspektraldichte der Populationsaktivität verändern könnte. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die Bedeutung der Dynamik der Ionenkonzentrationen für das Verständnis neuronaler Aktivität auf langen Zeitskalen und liefert technische Erkenntnisse darüber, wie das Zusammenspiel zwischen ihnen modelliert und analysiert werden kann. / Neurons are essential in the information transfer mechanisms of the central nervous system. Their activity underlies both basic signal processing, and higher cognitive processes. Neurons are embedded in the extracellular space, which contains multiple particles, including ions which are vital to their functioning. Ionic concentrations are not static, intense neuronal activity alters the intracellular and extracellular ionic concentrations which in turn affect neuronal functioning. In this thesis, I study the interplay between neuronal activity and ionic concentration dynamics. I focus specifically on the extracellular potassium and intracellular sodium concentrations. Using dynamical systems theory, I illustrate how moderate changes in these ionic concentrations can qualitatively change neuronal activity, potentially altering signal processing. I then model a conductance-based spiking neural network. The model predicts that a moderate change in the concentrations surrounding a microcircuit of neurons could modify the power spectral density of the population activity. Altogether, this work highlights the need to consider ionic concentration dynamics to understand neuronal activity on long time scales and provides technical insights on how to model and analyze the interplay between them.