Intrazelluläre Protein- und RNA-Lokalisation ist ein lebenswichtiger molekularer Mechanismus. Ihm unterliegen sowohl die äußere Gestaltung der Zellform, Zellagilität, zelluläre Differenzierung sowie die intra- sowie interzelluläre Kommunikation. Diverse Krankheiten werden mit Fehlfunktionen des intrazellulären Molekültransportes assoziiert und es existieren unzählige Beispiele für bekannte Wege des intrazellulären Protein- und RNA-Transportes. Allerdings ist die globale Komposition lokaler Protein- und RNA-Reservoirs bisher kaum wissenschaftlich erforscht worden. In dieser Studie beschreibe ich die Protein- sowie RNA-Kompositionen subzellulärer Fraktionen zweier neuronaler Zelltypen. Die Neuriten und Somata von Neuroblastoma-Zellen (N1E-115) und Ascl1 induzierten Neuronen (beides Mauszellen) wurden mechanisch voneinander separiert und mittels RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie auf ihre Bestandteile untersucht. Die Verteilung von mRNAs korreliert signifikant mit der Verteilung der entsprechenden Proteine in Ascl1-iNs während in der Neuroblastoma Zelllinie N1E-115 kein solcher Trend nachgewiesen werden konnte. Der Vergleich zu Datensätzen von anderen Zellsystemen und Methoden zeigt, dass das lokale Proteom sowie das lokale Transkriptome und Translatome stark Zelltyp spezifisch ist. Um den Einfluss lokaler Proteinbiosynthese auf die Komposition subzellulärer Proteinpools zu erheben, habe ich die Lokalisation neu synthetisierter Proteine untersucht. Es scheint, als sei die RNA-Lokalisation und lokale Translation von hoher Relevanz für die Protein-Lokalisation in diesen stark polarisierten Zellsystemen. Des Weiteren stelle ich eine Methode vor, um de novo „zip codes“ in diesen neuronalen Zellsystemen zu identifizieren. Diese könnte ein elementar wichtiger Schritt sein, um Fehlfunktionen im interzellulären Molekültransport zu verstehen. / Intracellular protein and RNA localization is one of the mayor players in the formation of cell shape, enabling cell agility, cellular differentiation and cell signaling. Various diseases are associated with malfunctions of intracellular molecule transport. There are many known pathways of how and why proteins and RNAs are transported within the cell and where they are located, though there is not much known about the global distribution of proteins and RNAs within the cell. In this study I apply a subcellular fractionation method coupled to multiple omics approaches to investigate the global distribution of mRNAs, noncoding RNAs and proteins in neuronal cells. Neurites and soma from mouse neuroblastoma cells (N1E-115) as well as from Ascl1 induced neurons (Ascl1-iNs) were isolated and the composition of the spatial proteome and transcriptome was examined. The localization of mRNAs correlates significantly with the localization of their corresponding protein products in Ascl1-iNs whereas it does not in the mouse neuroblastoma cell line N1E-115. Comparing these datasets with recently published data of other cell lines and methods it is clear, that the local proteome, transcriptome and translatome of neuronal cells is highly cell type specific. To investigate how spatial protein pools are established I analyzed local pools of newly synthesized proteins revealing that many proteins are synthesized on the spot. RNA localization therefore plays a crucial role in generating local protein pools in these highly polarized cell systems. Additionally, I propose a method to identify on a global scale de novo “zip codes” in these cell systems which would be a great step towards understanding malfunctions in molecule transport.

Die Beschreibung genregulatorischer Ereignisse ist entscheidend um Zelldifferenzierung und -entwicklung zu verstehen. Dynamische Vernderungen der Chromatinstruktur, Histonmodifikationen und das Binden von Transkriptionsfaktoren an Enhancer und Promotoren, koennen mit Hilfe von genomweiten Hochdurchsatz-Sequenziertechniken wie ChIP-Seq, DNase-Seq, ATACSeqund RNA-Seq untersucht werden. In dieser Arbeit entwickele ich mehrere probabilistische Modelle fuer die Analyse von genomweiten Sequenzierungsdaten. Diese umfassen 1. einen Peak-Finder fuer ChIP-/DNase-/ATAC-Seq-Daten, der sich Replikate zunutze macht und praezise Peak-Weiten berechnet, 2. eine Pipeline um das Genom in hoher Aufloesung in eindeutige Klassen von Kombinationen von Histonmodifikationen zu segmentieren, 3. ein Bayes-Netzwerk-Modell welches multiple zeitlich aufgelste Histonmodifikations-ChIP-seq-Daten kombinatorisch clustert Klassen von regulatorischen Elementen zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Modelle untersuchen wir die Promotorumgeben und zeigen einen Zusammenhang zwischen Chromatinstruktur und Promotordirektionalitaet. Darueber hinaus verwenden wir ein Modell zur direkten Reprogrammierung von Stammzellen in Motorneuronen durch die gezielte Expression von Transkriptionsfaktoren und analysieren die dadurch induzierten zeitlichen Vernderungen der Chromatinstruktur und Transkriptionsfaktorbindedynamik. Wir beobachten, dass Promotoren verschiedenen Chromatin-Dynamiken zur Aktivierung und Repression folgen, die mit den Chromatin-Dynamiken von Enhancer-Elementen korrelieren. Enhancer hingegen werden durch kooperatives Verhalten direkt induzierter Transkriptionsfaktoren und anderen Faktoren, die in den Stammzellen zu Beginn vorhanden waren oder im Verlaufe der Differenzierung aktiviert wurden, kontrolliert. Diese Arbeit zeigt wie wichtig Chromatin-Dynamik und ihre Beziehung zur Logik von Transkriptionsfaktoren ist, um die Veraenderungen der Genexpression zu verstehen. / Delineating transcription regulatory events is crucial to understand cell differentiation and development. Dynamic changes of chromatin structure, histone modifications and transcription factor binding to enhancers and promotors can be investigated with the aid of genome-wide high-throughput sequencing technologies such as ChIP-Seq, DNase-Seq, ATAC Seq and RNA Seq. In this thesis, I develop several probabilistic models for the analysis of genome-wide sequencing data. These include: 1. a peak finder for ChIP-Seq, DNase-Seq and ATAC Seq data, which exploits biological replicates and accurately demarcates peak widths, 2. a pipeline for high-resolution genome segmentation into unique classes of combinations of histone modifications and 3. a Bayesian network model that can co-cluster multiple time-course histone modification ChIP-Seq data sets into distinct classes of regulatory elements. With the aid of these models we investigate the promoter chromatin environment and show a link between chromatin state and transcription initiation directionality. In addition, we use a system for direct reprogramming of stem cells in motor neurons by the targeted expression of transcription factors to analyse changes in chromatin state and transcription factor dynamics during differentiation. We observe that promoters follow different chromatin dynamics for activation and repression that correlate with the chromatin dynamics of enhancer elements. Enhancers are controlled by cooperative behavior of directly induced transcription factors and other factors present in the stem cells initially, or activated in the course of differentiation. Overall, this work demonstrates the importance of understanding chromatin dynamics and their relationship to transcription factors logic in order to better explain changes in gene expression.

In Eukaryoten werden sekretorische Proteine an zytoplasmatischen Ribosomen synthetisiert und in das endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie ihre biologisch aktive Struktur erhalten. Defekte Proteine, die durch Fehler in diesem Reifungsprozess entstehen, werden über den Prozess der „ER-assoziierten Protein Degradation“ (ERAD) abgebaut. Eine zentrale Komponente dieses Abbauweges ist die HRD‑Ligase, ein membranständiger Proteinkomplex, der das E3‑Enzym Hrd1 enthält. Einige publizierte Arbeiten lassen eine Beteiligung der Transmembrandomäne von Hrd1 an einem neuartigen Transportsystem für den Export von fehlgefalteten Proteinen aus dem ER vermuten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die Bedeutung der Transmembranregion von Hrd1 für den Abbau von ERAD‑Substraten in dem Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae gewonnen werden. Die Substitution von zwei Aminosäuren in der dritten Transmembranhelix von Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) hemmt spezifisch den Abbau von fehlgefalteten ER-luminalen Proteinen, während die Prozessierung membrangebundener Hrd1-Substrate weitestgehend unbeeinflusst blieb. Daher zeigt die Hrd1‑Variante wahrscheinlich eine Störung im Transport von luminalen ERAD‑Substraten durch die ER Membran. Biochemische Analysen zeigen keine starken Veränderungen bei der Zusammensetzung der HRD-Ligase durch die Hrd1‑Variante. Allerdings ließen sich bei Anwendung von zielgerichtetem in vivo photocrosslinking deutliche Veränderungen in der räumlichen Orientierung der Ligaseuntereinheit Der1 zu Hrd1E84L, H101L beobachten. Da Der1 ausschließlich für den Abbau ER-luminaler ERAD-Substrate benötigt wird ist anzunehmen, dass die korrekte Ausrichtung von Der1 zu Hrd1 innerhalb der ER-Membran eine Voraussetzung für den Transport von ERAD‑Substraten in das Zytoplasma ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals einen direkten Einfluss der Transmembranregion von Hrd1 auf den Abbau luminaler ERAD‑Zielproteine. / In eukaryotes, secretory proteins are synthesized on cytoplasmic ribosomes and transported into the endoplasmic reticulum (ER), where they obtain their biologically active structure. Defect proteins that arise from errors in this maturation process are degraded by the “ER-associated protein degradation” (ERAD) pathway. A central component of ERAD is the HRD-ligase, a membrane-bound protein complex that contains the ubiquitin ligase Hrd1. Some published work raised speculations on an involvement of this trans-membrane domain in a novel transport system for the export of misfolded proteins from the ER. In the course of this work new insights for the importance of the transmembrane domain of Hrd1 for the degradation of ERAD substrates in the model organism Saccharomyces cerevisiae were obtained. The substitution of two amino acids in the third trans-membrane helix of Hrd1 (Hrd1E84L, H101L) specifically impairs the turnover of misfolded ER-luminal proteins whereas the processing of membrane-bound Hrd1 substrates remained largely unaffected. The Hrd1 variant therefore displays most likely a defect in the transport of luminal ERAD substrates through the ER membrane. No major changes in the assembly of the HRD-ligase by the Hrd1 variant were detected. Still, in site specific in vivo photo-crosslinking assays substantial changes in the spatial orientation of the ligase subunit Der1 towards Hrd1E84L, H101L were detected. Der1 is exclusively required for the degradation of ER-luminal ERAD substrates. This implies that the proper alignment of Hrd1 and Der1 within the ER membrane is a prerequisite for the transport of ERAD substrates into the cytoplasm. This work shows for the first time a direct involvement of the trans-membrane region of Hrd1 in the degradation of luminal ERAD client proteins.

Der Tumorsuppressor p53 spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und verhindert die Bildung und Entwicklung von Krebs. Frühere Studien auf Einzelzellebene haben gezeigt, der p53 nach dem Auftreten von DNS Schäden in einer Serie gleichförmiger Pulse im Kern akkumuliert. Um den Einfluss von Temperatur, dem Zustand des NFκB Weges oder dem Vorhandensein von Wachstumsfaktoren auf die p53 Dynamiken nach DNS-Schäden zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit A549 und MCF10A p53 Reporter-Zelllinien verwendet. Um Daten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung auf Einzelzellebene zu erhalten, wurde Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Überraschenderweise zeigten A549 Zellen, die mit γ-Strahlung behandelt wurden, eine höhere p53 Akkumulation und ein verlängertes Zeitintervall zwischen den p53 Pulsen, wenn sie bei 30°C inkubiert wurden im Vergleich zu Zellen unter physiologischen Bedingungen. Hingegen zeigten Zellen bei 40°C eine höhere p53 Pulsfrequenz. Außerdem wurde die p53 Zielgen-Expression durch die Änderungen in der Dynamik beeinflusst. In den beiden Zelllinien, A549 und MCF10A, wurde die p53 Dynamik durch Inhibierung des NFκB Signalweges verändert, nicht aber durch dessen Aktivierung mittels TNF. So verlängert die Inhibierung des NFkB Signalweges das Zeitintervall zwischen p53 Pulsen, was sich auch in der Expression von p53 Zielgenen wiederspiegelt. Weiterhin konnte in MCF10A Zellen durch Experimente mit verschiedenen Medien-Bedingungen gezeigt werden, dass p53 Dynamiken vor allem durch die Anwesenheit von EGF und Hydrocortison geprägt werden. So führt EGF zu einem pulsierenden p53 Verhalten, während Hydrocortison alleine die p53 Antwort vollständig aufhebt.. Diese Studie macht deutlich, wie wichtig es ist, das Verhältnis von zellulärem Zustand und p53 Antwort systematisch zu untersuchen, um Krebstherapien wirksamer zu machen / The tumor suppressor p53 plays important roles in maintaining cellular homeostasis and in preventing the formation and development of cancer. Previous studies on p53 activation after DNA damage have reported that it shows a series of regular discrete pulses of protein accumulation over time at the single cell level. In this work A549 and MCF10A p53 reporters cell line were used to investigate how p53 dynamics after DNA damage were affected by changes in temperature, by changes in the state of the NFκB pathway and changes in the provided growth factors. Time-lapse florescent microscopy was used to obtain single cell data with high temporal and special resolution at the single cell level. Surprisingly A549 cells treated with γ-irradiation showed higher level of p53 accumulation and increased time between p53 pulses when imaged at 30°C than cells imaged under physiological conditions. Cells imaged at 40°C showed instead higher p53 pulse frequency. P53 target gene expression was also affected by these changes in dynamics. In both A549 and MCF10A cells, p53 dynamics were changed by NFκB pathways inhibition but not activation via TNFα. Upon inhibition of the NFκB pathway the timing between p53 pulses was increased leading to changes also in p53 target genes expression. In MCF10A cells experiments done under different medium conditions proved that p53 dynamic in this cell line was shaped mainly by the presence of EGF and hydrocortisone that are usual components of the media. EGF leads to a more pulsatile p53 behavior while hydrocortisone completely abrogates the p53 response. These discoveries pointed out the need to study more systematically the relationship between the p53 response to a given stress and the cellular state in order to make cancer therapies more effective.

Ubiquitinierung ist eine essentielle posttranslationale Proteinmodifikation (PTM), die vielfältige Prozesse in eukaryotischen Zellen steuert. Ubiquitin wird zu unterschiedlichen polymeren Ketten zusammengesetzt, wobei E2-Ubiquitin-konjugierende Enzyme häufig eine entscheidende Rolle spielen. Im Rahmen meiner Promotion habe ich die molekularen Grundlagen der Ub Kettensynthese durch die E2-Enzyme Ubc1 und Ubc7 untersucht. Dies geschah mithilfe von in vitro Ubiquitinierungs-Reaktionen, biochemischen und strukturellen Untersuchungen sowie zellbiologischen Experimenten. Ich konnte zeigen, dass zugehörige Ubiquitin-Binde-Domänen (UBDs) die Funktion der E2-Enzyme maßgeblich regulieren. Als einziges unter elf E2-Enzymen in S. cerevisiae enthält Ubc1 eine Ub-bindende UBA Domäne, deren Funktion bisher unklar blieb. Ubc1 modifiziert ausschließlich Lysin 48 (K48) in Ub und wurde mit Proteinqualitätskontrolle sowie der Regulation des Zellzyklus in Verbindung gebracht. Meine Ergebnisse zeigen, dass Ubc1 mithilfe seiner UBA-Domäne vorzugsweise mit K63-verknüpftem Polyubiquitin interagiert, wodurch K48/K63 verzweigte Ub-Ketten entstehen. Basierend auf vorhandenen Strukturinformationen und meinen eigenen röntgenkristallographischen Untersuchungen zeige ich eine Modellstruktur für die Reaktion auf. Meine Ergebnisse stellen eine wesentliche Untersuchungsgrundlage für verzweigten Ub-Ketten dar, über deren Vorkommen und Funktion bisher wenig bekannt ist. Ubc7 assembliert mithilfe seines Kofaktors Cue1 K48-verknüpfte Ub-Ketten im Rahmen des Endoplasmatisches-Retikulum-assoziierten Proteinabbaus (ERAD). In einem kollaborativen Projekt haben wir die Ub-bindende CUE-Domäne in Cue1, die hierfür eine Schlüsselrolle spielt, untersucht. Sie ermöglicht die Ausrichtung des E2-Enzyms an der distalen Spitze der Ub-Kette für eine schnelle Kettenverlängerung, besitzt einzigartige auf den Prozess angepasste Bindungseigenschaften und ihre Beeinträchtigung stört den Abbau des ERAD-Substrates Ubc6. / Ubiquitination is an essential posttranslational protein modification (PTM) that regulates widespread intracellular processes in eukaryotic cells. Ubiquitin (Ub) can be assembled into polymeric chains through its seven internal lysine residues and the N-terminus enabling the formation of a complex "Ubiquitin Code". Factors that guide the molecular machinery which produces this code remain poorly understood. In this study, I demonstrate that ubiquitin binding domains (UBDs) associated with the E2 enzymes Ubc1 and Ubc7 substantially contribute to the assembly of particular Ub chains. Uniquely among the eleven E2 enzymes of S. cerevisiae Ubc1 contains a ubiquitin binding UBA domain. Ubc1 exclusively modifies lysine 48 (K48) in Ub and has been implicated in protein quality control and cell cycle progression. However, the function of its UBA domain remained elusive. I identified Ubc1 to preferentially target specific Ub molecules in K63-linked polyubiquitin via its UBA domain. This activity results in the assembly of K48/K63 branched Ub chains. Based on existing structural information and my own X-ray crystallographic experiments, I propose a structure for the transition state of branched chain assembly by Ubc1. My findings provide a basis for the study of this unusual Ub chain type. Ubc7 has previously been shown to be activated by its co-factor Cue1 to assemble Ub chains linked through lysine 48 (K48) in the context of endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD). In collaboration with Dr. Maximilian von Delbrück and Dr. Andreas Kniss, we identified the ubiquitin binding CUE domain in Cue1 to play a key role in aligning Ubc7 with the distal tip of a K48-linked Ub chain for rapid chain elongation. Furthermore, we showed how binding of Ub by the CUE domain is well adapted towards the chain elongation process and how its disruption impairs degradation of the ERAD substrate Ubc6.

Der TGFβ-Signalweg ist ein multifunktionales System, das zelluläre Prozesse reguliert, die von Proliferation und Migration bis zu Differenzierung und Zelltod reichen. Nach Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung translozieren SMAD-Proteine zum Zellkern und induzieren die Expression zahlreicher Zielgene. Während viele Komponenten des TGFβ-Signalweges identifiziert wurden, verstehen wir noch nicht genau, wie die Aktivierung des Signalwegs in verschiedene zelluläre Antworten übersetzt wird. Da die zelluläre Antwort auf einen gegebenen Stimulus oft sogar in genetisch identischen Zellen variiert, konzentrierte ich mich auf die Messung der Signalwegaktivität auf der Einzelzellebene. Durch die Kombination fluoreszierender Reporterzelllinien mit Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie und automatisierter Bildanalyse beobachtete ich die zytoplasmatische und nukleäre Translokation von SMADs mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in Hunderten einzelner Zellen. Unsere Experimente zeigten, dass die Signalwegaktivität in eine erste synchrone Phase der SMAD-Translokation, gefolgt von einer Adaption und einer zweiten Signalphase mit hoher Variabilität in Stärke und Dauer der nuklearen Akkumulation unterteilt werden kann. Darüber hinaus beobachtete ich, dass Zellen, die aufgrund ihrer dynamischen Eigenschaften in Subpopulationen gruppiert sind, unterschiedliche phänotypische Reaktionen zeigen. Ich war nun daran interessiert, die Netzwerkinteraktionen zu identifizieren, die diese Dynamiken formen und fokussierte mich auf den Crosstalk mit nicht-kanonischen Komponenten des TGFβ-Signalweges. Ich konnte zeigen, dass die Hemmung der MAP Kinasen p38 und ERK die zweite Signalphase spezifisch aufhebt. Diese dynamische Remodellierung führt zu Veränderungen in der Zielgenexpression und den Zellschicksalen. Dies wird zu einem tieferen Verständnis der molekularen Netzwerke führen, die die TGFβ-Signaltransduktion regulieren und Möglichkeiten eröffnen, es in erkrankten Zellen zu modulieren. / The TGFβ pathway is a multi-functional signaling system regulating cellular processes ranging from proliferation and migration to differentiation and cell death. Upon ligand binding and receptor activation, SMAD proteins translocate to the nucleus and induce expression of numerous target genes. While many components of the TGFβ pathway have been identified, we are still challenged to understand how pathway activation is translated into distinct cellular responses. As the cellular response to a given stimulus often varies even in genetically identical cells, I focused on measuring pathway activity on the single cell level. By combining fluorescent reporter cell lines with time-lapse live-cell microscopy and automated image analysis, I monitored the cytoplasmic to nuclear translocation of SMADs with high temporal and spatial resolution in hundreds of individual cells. Our experiments demonstrated that pathway activity can be divided into a first synchronous phase of SMAD translocation, followed by adaptation and a second signaling phase with high variability in the extent and duration of nuclear accumulation. Furthermore, I observed that cells clustered into subpopulations according to their dynamic features show different phenotypic responses. I was interested in identifying the network interactions that shape these dynamics and focus on crosstalk with non-canonical components of the TGFβ pathway. I could show that inhibition of the MAP kinases p38 and ERK specifically abrogates the second signaling phase. This dynamic remodeling led to changes in target gene expression and cell fate decisions. I explored the molecular mechanisms underlying this interaction of the canonical and non-canonical pathways. This will provide a deeper understanding of the molecular networks regulating TGFβ signaling and open opportunities to modulate it in diseased cells.

Als Reaktion auf DNA-Schäden aktivieren Zellen den NF-κB-Signalweg, der die apoptotischen Reaktionen reguliert. Die Signalwege, die die zytoplasmatischen NF-κB-Dimere als Reaktion auf eine breite Palette von Immun- und Entzündungssignalen aktivieren, sind umfassend untersucht worden; die molekularen Mechanismen, die die Kern-DNA mit der zytoplasmatischen Aktivierung von NF-κB verbinden, sind jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mithilfe genomweiter siRNA-Screens systematisch Regulatoren und wesentliche Komponenten identifiziert, die für die durch DNA-Schäden ausgelöste Aktivierung des NF-κB-Signalwegs erforderlich sind. Von den identifizierten Komponenten konnten wir nachweisen, dass TSG101 die NF-κB-Aktivierung durch DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass TSG101 mit PARP1 interagiert und dessen katalytische Aktivität kontrolliert. Die Ausrichtung auf TSG101 führt dazu, dass PARP1 in DNA-Läsionen gefangen wird und die durch DNA-Schäden ausgelöste NF-κB-Aktivierung vermindert wird. In Abwesenheit von TSG101 fehlen den Zellen PAR-abhängige zelluläre Reaktionen und sie sind für die durch DNA-Schäden ausgelöste Apoptose sensibilisiert. Die signalinduzierte Verarbeitung von p100 ist ein wesentlicher Schritt für die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB-Wegs. Trotz seiner Bedeutung für die Immunantwort, die Entwicklung und verschiedene bösartige Erkrankungen wurden die Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die die Verarbeitung von p100 regulieren, nie mit endogenen Systemen analysiert. In dieser Studie haben wir mit Hilfe eines CRISPR-Cas9-basierten Knock-out-Screening-Systems nicht-redundante E3-Ligasen identifiziert, die für die signalinduzierte p100-Verarbeitung erforderlich sind. Außerdem haben wir das TWEAK-induzierte Ubiquitinom mittels Massenspektrometrie charakterisiert. / In response to DNA damage, cells activate the NF-κB pathway that regulates the apoptotic responses. The signaling pathways that activate the cytoplasmic NF-κB dimers in response to a wide range of immune and inflammatory signals have been investigated extensively; however, the molecular mechanisms that link the nuclear DNA with cytoplasmic activation of NF-κB is relatively less known. Here we systematically identified regulators and essential components required for the DNA damage-induced activation of the NF-κB pathway using genome-wide siRNA screens. Amongst the identified components, we validated that TSG101 regulates the NF-κB activation by DNA damage. We showed that TSG101 interacts with PARP1 and controls its catalytic activity. Targeting TSG101 consequently achieves trapping of PARP1 in DNA lesions and diminishes the DNA damage-induced NF-κB activation. In the absence of TSG101, cells lack PAR-dependent cellular responses and are sensitized to DNA damage-induced apoptosis. The signal-induced processing of p100 is an essential step for the activation of the non-canonical NF-κB pathway. Despite of its importance in immune responses, development, and several malignancies, the ubiquitin-proteasome system components regulating p100 processing were never analyzed using endogenous systems. In this study, utilizing a CRISPR Cas9 based knock out screening system we identified non-redundant E3 ligases required for the signal-induced p100 processing. We also characterized the TWEAK-induced ubiquitinome via mass spectrometry.

Neuronen sind bei der Informationsübertragung des zentralen Nervensystems von entscheidender Bedeutung. Ihre Aktivität liegt der Signalverarbeitung und höheren kognitiven Prozessen zugrunde. Neuronen sind in den extrazellulären Raum eingebettet, der mehrere Teilchen, darunter auch Ionen, enthält. Ionenkonzentrationen sind nicht statisch. Intensive neuronale Aktivität kann intrazelluläre und extrazelluläre Ionenkonzentrationen verändern. In dieser Arbeit untersuche ich das Wechselspiel zwischen neuronaler Aktivität und der Dynamik der Ionenkonzentrationen. Dabei konzentriere ich mich hauptsächlich auf extrazelluläre Kalium- und intrazelluläre Natriumkonzentrationen. Mit Hilfe der Theorie dynamischer Systeme zeige ich, wie moderate Änderungen dieser Ionenkonzentrationen die neuronale Aktivität qualitativ verändern können, wodurch sich möglicherweise die Signalverarbeitung verändert. Dann modelliere ich ein leitfähigkeitsbasiertes neuronales Netzwerk mit Spikes. Das Modell sagt voraus, dass eine moderate Änderung der Konzentrationen, die einen Mikroschaltkreis von Neuronen umgeben, die Leistungsspektraldichte der Populationsaktivität verändern könnte. Insgesamt unterstreicht diese Arbeit die Bedeutung der Dynamik der Ionenkonzentrationen für das Verständnis neuronaler Aktivität auf langen Zeitskalen und liefert technische Erkenntnisse darüber, wie das Zusammenspiel zwischen ihnen modelliert und analysiert werden kann. / Neurons are essential in the information transfer mechanisms of the central nervous system. Their activity underlies both basic signal processing, and higher cognitive processes. Neurons are embedded in the extracellular space, which contains multiple particles, including ions which are vital to their functioning. Ionic concentrations are not static, intense neuronal activity alters the intracellular and extracellular ionic concentrations which in turn affect neuronal functioning. In this thesis, I study the interplay between neuronal activity and ionic concentration dynamics. I focus specifically on the extracellular potassium and intracellular sodium concentrations. Using dynamical systems theory, I illustrate how moderate changes in these ionic concentrations can qualitatively change neuronal activity, potentially altering signal processing. I then model a conductance-based spiking neural network. The model predicts that a moderate change in the concentrations surrounding a microcircuit of neurons could modify the power spectral density of the population activity. Altogether, this work highlights the need to consider ionic concentration dynamics to understand neuronal activity on long time scales and provides technical insights on how to model and analyze the interplay between them.