Ubiquitinierungen sind dynamische, posttranslationale Proteinmarkierungen, die eine Vielzahl zellulärer Reaktionen hervorrufen. Die strukturell unterschiedlichen Signale werden von einer Ubiquitinierungsmaschinerie, bestehend aus E1-, E2- und E3-Enzymen, aufgebaut. Die Synthese von Polyubiquitin wird durch ubiquitinbindende Domänen (UBD) innerhalb der enzymatischen Kaskade stimuliert. Das E2-Enzym Ubc7 katalysiert zusammen mit dessen Kofaktor Cue1 die Polymerisierung von Ubiquitineinheiten und kennzeichnet Substratproteine mit Lysin 48 (K48)-ver¬knüpf¬ten Ubiquitinketten für den Endoplasmatische Retikulum-assoziierten Proteinabbau (ER-associated protein degradation, ERAD). In dieser Arbeit konnte mittels in vitro rekonstitu¬ierter Ubiquitinierungsreaktionen die Funktionsweise der ubiquitinbindenden CUE-Domäne von Cue1 während der Synthese von Polyubiquitin aufgeklärt werden. Verlängerungs¬reaktionen von Ubiquitinketten konnten durch Fluoreszenzmessungen verfolgt und die CUE-Domäne als Substratrezeptor von Ubc7 beschrieben werden. Anscheinend erhöht die Ubiquitin¬bindung durch Cue1 die lokale Konzentration von Ubc7 an den Ketten und positio¬niert das E2-Enzym effizient für die Übertragung der gebundenen Ubiquiti-neinheit. Die Reaktionen werden durch eine Bindungspräferenz der Cue1-CUE-Domäne für K48-ver¬knüpfte Ubiquitinmoleküle zusätzlich beschleunigt. Es ist bekannt, dass UBDs Ubiquitin¬signale entschlüsseln. Die Charakterisierung der CUE-Domäne beschreibt eine Notwendigkeit der Bindung von Ubiquitin bereits während der Entstehung von Polyubiquitin. Neben den E3-Ubiquitinligasen existieren Deubiquitinasen (DUB), die an der Reifung und dem Abbau von Ubiquitinsignalen beteiligt sind. Die proteasomalen DUBs Ubp6 und Rpn11 zeigen basale Aktivitäten in Isolation, die eingebunden in den 26S-Komplex moduliert werden. Fluoreszenz-basierte Untersuchungen von Kettenabbaureaktionen lassen erste Schlüsse über die Spezifitäten und die Abbaumechanismen der Enzyme zu. / Polyubiquitination is an essential process modulating protein function in eukaryotic cells. Only recently ubiquitin binding activity has emerged as an important factor in ubiquitin chain assembly. Cue1 is a crucial component of yeast endoplasmic reticulum associated protein degradation complexes which recruits and activates the E2 ubiquitin conjugating enzyme Ubc7. Our NMR solution structure reveals an unconventional CUE domain of Cue1 that substantially stimulates ubiquitin chain elongation by Ubc7.Results from NMR analysis combined with interaction studies and in vitro ubiquitination reactions imply that binding of CUE to a ubiquitin moiety adjacent to the acceptor ubiquitin is a prerequisite for rapid chain elongation. By this mode of action, the CUE domain counteracts the inability of associated Ubc7, to progressively elongate ubiquitin chains. Elongation of K48-linked ubiquitin chains is additionally accelerated since the CUE domain preferentially binds chains of K48-linkage. Our data support a model, where dynamic binding of ubiquitin chains assist to position Ubc7 for rapid elongation of K48-linked chains. Thus, the CUE domain acts as acceleration factor of elongation. Our study provides detailed mechanistic insight into how a ubiquitin binding domain governs polyubiquitin chain formation.

Ubiquitinierung ist eine essentielle posttranslationale Proteinmodifikation (PTM), die vielfältige Prozesse in eukaryotischen Zellen steuert. Ubiquitin wird zu unterschiedlichen polymeren Ketten zusammengesetzt, wobei E2-Ubiquitin-konjugierende Enzyme häufig eine entscheidende Rolle spielen. Im Rahmen meiner Promotion habe ich die molekularen Grundlagen der Ub Kettensynthese durch die E2-Enzyme Ubc1 und Ubc7 untersucht. Dies geschah mithilfe von in vitro Ubiquitinierungs-Reaktionen, biochemischen und strukturellen Untersuchungen sowie zellbiologischen Experimenten. Ich konnte zeigen, dass zugehörige Ubiquitin-Binde-Domänen (UBDs) die Funktion der E2-Enzyme maßgeblich regulieren. Als einziges unter elf E2-Enzymen in S. cerevisiae enthält Ubc1 eine Ub-bindende UBA Domäne, deren Funktion bisher unklar blieb. Ubc1 modifiziert ausschließlich Lysin 48 (K48) in Ub und wurde mit Proteinqualitätskontrolle sowie der Regulation des Zellzyklus in Verbindung gebracht. Meine Ergebnisse zeigen, dass Ubc1 mithilfe seiner UBA-Domäne vorzugsweise mit K63-verknüpftem Polyubiquitin interagiert, wodurch K48/K63 verzweigte Ub-Ketten entstehen. Basierend auf vorhandenen Strukturinformationen und meinen eigenen röntgenkristallographischen Untersuchungen zeige ich eine Modellstruktur für die Reaktion auf. Meine Ergebnisse stellen eine wesentliche Untersuchungsgrundlage für verzweigten Ub-Ketten dar, über deren Vorkommen und Funktion bisher wenig bekannt ist. Ubc7 assembliert mithilfe seines Kofaktors Cue1 K48-verknüpfte Ub-Ketten im Rahmen des Endoplasmatisches-Retikulum-assoziierten Proteinabbaus (ERAD). In einem kollaborativen Projekt haben wir die Ub-bindende CUE-Domäne in Cue1, die hierfür eine Schlüsselrolle spielt, untersucht. Sie ermöglicht die Ausrichtung des E2-Enzyms an der distalen Spitze der Ub-Kette für eine schnelle Kettenverlängerung, besitzt einzigartige auf den Prozess angepasste Bindungseigenschaften und ihre Beeinträchtigung stört den Abbau des ERAD-Substrates Ubc6. / Ubiquitination is an essential posttranslational protein modification (PTM) that regulates widespread intracellular processes in eukaryotic cells. Ubiquitin (Ub) can be assembled into polymeric chains through its seven internal lysine residues and the N-terminus enabling the formation of a complex "Ubiquitin Code". Factors that guide the molecular machinery which produces this code remain poorly understood. In this study, I demonstrate that ubiquitin binding domains (UBDs) associated with the E2 enzymes Ubc1 and Ubc7 substantially contribute to the assembly of particular Ub chains. Uniquely among the eleven E2 enzymes of S. cerevisiae Ubc1 contains a ubiquitin binding UBA domain. Ubc1 exclusively modifies lysine 48 (K48) in Ub and has been implicated in protein quality control and cell cycle progression. However, the function of its UBA domain remained elusive. I identified Ubc1 to preferentially target specific Ub molecules in K63-linked polyubiquitin via its UBA domain. This activity results in the assembly of K48/K63 branched Ub chains. Based on existing structural information and my own X-ray crystallographic experiments, I propose a structure for the transition state of branched chain assembly by Ubc1. My findings provide a basis for the study of this unusual Ub chain type. Ubc7 has previously been shown to be activated by its co-factor Cue1 to assemble Ub chains linked through lysine 48 (K48) in the context of endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD). In collaboration with Dr. Maximilian von Delbrück and Dr. Andreas Kniss, we identified the ubiquitin binding CUE domain in Cue1 to play a key role in aligning Ubc7 with the distal tip of a K48-linked Ub chain for rapid chain elongation. Furthermore, we showed how binding of Ub by the CUE domain is well adapted towards the chain elongation process and how its disruption impairs degradation of the ERAD substrate Ubc6.