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Analysis of structure and function of Chriz complex in Drosophila melanogaster

Glotov, Alexander 09 March 2016 (has links)
Die Chromatinstruktur spielt eine bedeutende Rolle bei der Stadien- und Gewebs-spezifischen Genexpression. Der epigenetische Status von Chromatindomänen wird mit Hilfe einer Anzahl von Proteinen und Histonmodifikationen etabliert und aufrechterhalten. Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Bedeutung und Funktion des Chriz Protein Komplexes bei Drosophila, der spezifisch in dekondensierten Regionen von Interphase Chromosomen gebunden ist. Meine RNAi Experimente an embryonalen S2 Zellen zeigten, dass die Rekrutierung von Z4 und der Kinase Jil-1 an das Chromatin sowie dessen H3S10 Phosphorylierung während der Interphase von Chriz abhängt. Diese Ergebnisse lieferten einen starken Hinweis auf eine Ähnlichkeit bei der Bildung des Komplexes in polytänen Zellen und diploiden S2 Zellen. Ich führte eine vergleichende Analyse der Bindungsprofile von Proteinen des Chriz Komplex zwischen Speicheldrüsen im 3.Larvenstadium und S2 Zellen im chromosomalen Intervall 61C7-8 durch. Ich fand heraus, dass die Chriz Bindungsprofile im proximalen Teil der Domäne konserviert waren. Dagegen beobachtete ich eine veränderte Chriz Bindung im distalen Teil, die mit einem veränderten Transkriptionsprofil in dieser Region übereinstimmte. Chriz und Z4 RNAi Experimente in S2 Zellen führten zu einer Veränderung der Expression vieler Chriz- und Z4- bindender Gene. Mittels Co-Immunpräzipitation und Protein „Pull-down“ konnte ich die Bindung der Insulator Proteine BEAF-32 und CP190 im Chriz-Komplex nachweisen und die für die Protein-Protein Interaktion notwendigen Proteinabschnitte grob kartieren. Schließlich überprüfte ich die Möglichkeit einer Rekrutierung des Chriz Komplexes durch BEAF-32 durch Induktion von Punktmutationen in bekannten BEAF-32 Bindemotiven. Meine Ergebnisse wiesen eine Wechselwirkung zwischen Chriz und Insulator Proteinen nach und zeigten, dass der Chriz-Komplex eine wichtige Bedeutung bei der strukturellen Organisation von Chromatin Domänen besitzt. / Chromatin structure is important for the correct stage and tissue-specific expression of the genetic material. The epigenetic state of chromatin domains is established and maintained by a number of proteins and histone modifications. The aim of current thesis is to investigate the role and function of Chriz protein complex, specifically bound to decondensed regions of interphase chromosomes in Drosophila. Several proteins were known to compose Chriz complex - chromodomain protein Chriz, zinc finger protein Z4 and H3S10 kinase Jil-1. I performed RNAi experiments on S2 cells which demonstrated that recruitment of Z4 and Jil-1 kinase to chromatin and interphase H3S10 phosphorylation are dependent on the presence of Chriz. I accomplished the comparative analysis of binding profiles of Chriz complex components between 3rd instar larvae salivary glands and S2 cell culture within 61C7-8 chromosomal interval. I found that Chriz binding profiles between two tissues are conserved at proximal part, however variant Chriz binding in distal part of 61C7-8 domain coincides with differences in transcription profile in the same region. Publicly available genome-wide data shows a tendency of Chriz to bind near Transcription Start Sites (TSS) and promoter regions of active genes. Chriz and Z4 RNAi experiments, performed in S2 cells resulted in expression changes of many Chriz- and Z4-binding genes. Using co-immunoprecipitation and pull-down assays, I identified insulator proteins BEAF-32 and CP190 to be present in the Chriz complex and performed rough mapping of interacting domains. Using BEAF-32 RNAi and introduced point mutations to BEAF-32 binding motifs I examined the possibility for recruitment of Chriz complex by BEAF-32. The obtained results revealed the interplay between Chriz and insulator proteins and point to important architectural role of Chriz complex in organizing chromatin domains.
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Unraveling the interactome of chromatin regulators that block reprogramming

Baytek, Gülkiz 01 February 2022 (has links)
Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. / Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.
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Genomweites Expressionsprofil skelettaler Tumore und funktionelle Analyse der Ephrine und CD52 in Osteosarkomen und Riesenzelltumoren

Günther, Raphaela 23 April 2008 (has links)
Knochentumore stellen mit nur 0,2% aller menschlichen Tumore sehr seltene primäre Neoplasien des skelettalen Systems dar. Diese Dissertation beschreibt die genomweite Microarray Analyse von Osteosarkomen und Riesenzelltumoren. Mit einer Microarray Analyse von konventionellen und metastatischen Osteosarkom-Geweben verglichen zu einer Osteoblasten-Primärkultur (HOBc) wurden Gene ermittelt, die im Prozess der Entstehung und Entwicklung sowie im Verlauf der Metastasierung von Osteosarkomen eine Rolle spielen könnten. EFNA1, EphA2, EphA3 und EFNB2 wiesen sehr hohe relative Expressionswerte und eine deutliche Aufregulierung in den Osteosarkomen im Vergleich zu HOBc auf. Mittels RT-PCR und immunhistochemischer Färbung wurde die Expression von EFNA1, EFNA2, EFNB1, EFNB3, EphA1 und EphA2 validiert. Da die deutliche Aufregulation von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom bestätigt werden konnte, wurden beide Ephrine funktionell untersucht. EphA2 wird in Osteosarkom-Zellen durch seinen Liganden EFNA1 Zeit- und Dosis-abhängig internalisiert und vermutlich degradiert. Die Stimulierung des EphA2 Rezeptors durch EFNA1/Fc führt zu einer Aktivierung von Mek, Erk und den Transkriptionsfaktoren Elk1 und cJun. In Wachstumsassays wurde eine signifikant erhöhte Proliferation der stark EphA2 exprimierenden MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen durch EFNA1/Fc beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass die Überexpression von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom eine Rolle während der osteogenen Tumorgenese spielen. Interessanterweise scheinen EphA2 und EFNA1 direkte Zielgene des Mek/Erk-Signalweges zu sein. Wir vermuten einen positiven „feedback-loop“, der die EphA2-Expression über die Aktivierung des Ras/Erk-Signalweges reguliert. Mittels Microarray Analyse wurden auch primäre und rezidivierende Riesenzelltumor-Gewebe analysiert. Riesenzelltumore sind osteolytische Neoplasien mit einem variablen Grad der Aggressivität. Durch diese molekulare Charakterisierung konnten neue Gene (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 und FGFR3) als differentiell exprimiert detektiert werden. Sie wurden bisher noch nicht mit Riesenzelltumoren assoziiert und spielen vermutlich eine Rolle in der Tumorprogression. Weitere Analysen größerer Patientenkollektive sowie funktionelle Studien sind notwendig, um interessante Gene wie AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun und MMP13 weiter zu untersuchen, und um ihre mögliche Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Riesenzelltumoren zu verfestigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die extrazelluläre und intrazelluläre Expression von CD52 in mesenchymalen Tumoren beschrieben. Die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD52 in den Microarray Analysen der Riesenzelltumore und Osteosarkome veranlassten uns, CD52 näher zu analysieren. Wir bestätigten die in vivo und in vitro Expression von CD52 in Osteosarkomen, Chondrosarkomen und Riesenzelltumoren sowie in weiteren benignen und malignen skelettalen Entitäten verglichen zu deren nicht-neoplastischen Gegenstücken. Generell wiesen die malignen Tumore eine höhere Expression verglichen mit den benignen Entitäten auf, was eine Rolle des CD52-Antigens bei der Entwicklung von Knochentumoren vermuten lässt. Weiterhin zeigte unsere Analyse erstmals, dass der derzeit bei der chronisch lymphatischen Leukämie eingesetzte CAMPATH-1H-Antikörper auch in der Lage ist, die Proliferation von MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen Komplement- und Antikörper-vermittelt zu reduzieren. / Bone tumors are rare neoplasms of the skeletal system amounting to only 0.2% of the overall human tumor burden. This dissertation describes a genome wide microarray analysis of osteosarcoma and giant cell tumor of the bone as well as a functional analysis of ephrins in osteosarcoma cell lines. We used a microarray analysis to detect genes differentially expressed between a normal bone osteoblast primary culture (HOBc) and primary and metastatic osteosarcoma tissue. For EFNA1, EphA2, EphA3 and EFNB2 an increased expression was detected in the osteosarcoma tissue samples compared to HOBc. The study verified the increased expression of EFNA1 and EphA2 through RT-PCR and immunohistochemical staining in human osteosarcomas and so the effects of their interaction in osteosarcoma cell lines were analyzed. We observed time- and dosedependent suppression of EphA2 expression via internalisation and degradation in osteosarcoma cell lines through the EFNA1 ligand. The stimulation of the EphA2 receptor by EFNA1/Fc led to an activation of Mek and Erk. In addition, this stimulation resulted in an activation of the transcription factors Elk1 and cJun. In MTT-assays a significantly higher proliferation of high expressing EphA2 MNNG/HOS osteosarcoma cells was observed by ligand-treatment. Our results show that EphA2 and EFNA1 are overexpressed in osteosarcomas suggesting a role of the EphA2 receptor during osteogenic tumorigenesis. We further showed that EphA2 and EFNA1 are targets of the Mek/Erk pathway. We suggest that a possible positive feedback loop regulates EphA2-expression through the activation of Mek/Erk activity. Further one, a molecular characterization of primary and relapse giant cell tumor tissue (GCT) was performed via microarray hybridization. GCTs are osteolytic neoplasms with variable degrees of aggressiveness. We established gene expression profiles and discovered a number of new genes (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 and FGFR3) that have not been described in GCTs before. Further studies and functional analyses are necessary in order to verify genes like AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun and MMP13 that may be involved in the progression of the GCTs and to identify potential targets for future therapy. In this study we described for the first time the extracellular and intracellular expression of CD52 in mesenchymal tumors. We confirmed the expression of the CD52 mRNA and protein both in vivo and in vitro of osteosarcomas, chondrosarcomas, GCTs and other benign and malign skeletal tumors compared to their non-neoplastic counterpart. In general, the malignant tumors showed a higher CD52-expression compared to the benign entities suggesting a role in the progression of bone tumors. Our results obtained in osteosarcoma MNNG/HOS cells showed that CAMPATH-1H, a CD52 antibody currently used in the treatment of chronic lymphatic leukaemia, led to a complement- and antibody-dependent reduction of viable osteosarcoma cells.
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Characterization of a novel lysine acetylation site in the N-terminal domain of the centromeric histone variant Cse4 in Saccharomyces cerevisiae

Pöpsel, Juliane 14 October 2015 (has links)
Die zentromerischen Regionen eukaryotischer Chromosomen sind notwendig für die Segregation der Schwesternchromatiden während der Zellteilung. In den Nukleosomen in diesen Regionen ist das kanonische Histon H3 durch die zentromerische Histon H3 Variante CENP-A ersetzt. Diese wird in Saccharomyces cerevisiae Cse4 genannt. Indem CENP-A die geordnete Assemblierung einzelner Untereinheiten des Kinetochors vermittelt, spezifiziert es die zentromerische Chromosomenregion und ist damit essentiell für die korrekte Segregation der Chromosomen während der Zellteilung. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cse4 posttranslational modifiziert wird. Von Bedeutung für diese Arbeit sind die in der essentiellen Domäne des N-terminus liegenden Methylierung von Arginin 37 und die Acetylierung von Lysin 49, die durch phänotypische Suppression eine genetische Interaktion und eine antagonistische Funktion bei der epigenetischen Regulation in der korrekten Assemblierung der Kinetochoruntereinheiten zeigen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Acetylierung an Cse4K49 von der Histonacetyltransferase Gcn5 abhängt, und dass dieses Enzym Komponenten des SAGA-Komplexes, aber nicht des ADA-Komplexes benötigt. Außerdem konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Acetylierung von K49 in der frühen S-Phase ansteigt und zum Ende der S-Phase abnimmt. Es konnte weiterhin eine biochemische Interaktion der N-terminalen Domäne von Cse4 mit der COMA-Untereinheit Ctf19, der zentralen Region des Kinetochors, nachgewiesen werden, möglicherweise mit einer Präferenz zu einer nicht acetylierten Form von Cse4K49. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Transkriptions-Co-Aktivator Komplex SAGA eine Funktion an der zentromerischen Region in S. cerevisiae aufweist. Des Weiteren ist die Acetylierung an Cse4K49 in die Rekrutierung der Kinetochoruntereinheit Ctf19 involviert, und gibt damit einen Hinweis auf einen epigenetischen Regulationsmechanismus während der Chromosomensegregation. / The centromeric regions of eukaryotic chromosomes are essential for proper chromosome segregation. The nucleosomal composition in these regions differs from that of canonical nucleosomes in that histone H3 is replaced by the H3 variant CENP-A, which is termed Cse4 in Saccharomyces cerevisiae. CENP-A is the most important epigenetic mark on centromeres and essential for accurate kinetochore establishment at centromeric sites, which in turn are necessary to connect the centromeric sites to the microtubules. Whereas the histone fold domain of Cse4 shares a sequence homology with canonical histone H3, the N-terminal domain is rather long as compared to canonical histone tails and the centromeric histone variants of higher eukaryotes. One part of this flexible, positively charged histone tail has been shown to represent an essential N-terminal domain (END). Lysine 49 was defined as an acetylation site in this region, but the modification remains to be characterized in detail. In this study, we found that the Cse4K49 acetylation is dependent on the histone acetyltransferase Gcn5, and that the enzyme in this context acts within the SAGA/SLIK complex, whereas an involvement of the smaller ADA complex was not observed. Furthermore, we addressed the cell-cycle dependence of the K49 acetylation and found an increase in early S-phase and a decrease in late S-phase, whereas the R37 methylation persisted throughout S-phase. Ctf19 was found to bind acetylated and unacetylated Cse4K49 with a preference for unacetylated Cse4. The findings presented here show that the transcriptional co-activator complex SAGA functions at centromeric regions in S. cerevisiae, and that the Cse4K49 acetylation has an influence on the recruitment of the kinetochore subunit Ctf19. This suggests an epigenetic regulatory mechanism involving a specific acetylation on the N-terminus of Cse4 in chromosome segregation.
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Determination of protein localization and RNA kinetics in human cells

Arsie, Roberto 14 October 2022 (has links)
In dieser Dissertation haben wir das Verhalten menschlicher Zellen in Raum und Zeit untersucht. Hochwertige Datensätze subzellulärer Regionen in HEK293-Zellen wurden mit Hilfe der BirA* Proximity-Labelling-Aktivität erstellt, wobei die Lokalisierung auf zelluläre Regionen beschränkt wurde, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer zu reinigen sind (d. h. die dem Zytosol zugewandten Seiten des ER, Mitochondrien und Plasma-membranen). Wir entwickelten daraufhin einen Ansatz zur Kartierung der Verteilung von Proteinen, die aktiv an RNA binden, und nannten ihn f-XRNAX. Wir stellten hintergrundkorrigierte Proteome für Zellkerne, Zytoplasma und Membranen von HEK293-Zellen her. Überraschenderweise wurden viele nicht-kanonische RBPs in der Membranfraktion identifiziert, und ihre Peptidprofile waren in Regionen mit hoher Dichte an intrinsisch ungeordneten Regionen angereichert, was auf eine möglicherweise schwache, durch diese nicht-strukturellen Motive vermittelte Interaktion mit RNA hinweist. Schließlich konnten wir die unterschiedliche Bindung desselben Proteins an RNA in verschiedenen HEK293-Kompartimenten nachweisen. Im zweiten Teil dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Bestimmung und Quantifizierung von neu transkribierten RNAs auf Einzelzellebene. Die Kinetik der RNA-Transkription und -Degradation war bis vor kurzem auf Einzelzellebene nicht messbar. Daher haben wir einen neuen Ansatz (SLAM-Drop-seq genannt) entwickelt, indem wir die veröffentlichte SLAM-seq-Methode an Einzelzellen angepasst haben. Wir haben SLAM-Drop-seq verwendet, um die zeitabhängigen RNA-Kinetikraten der Transkription und des Umsatzes für Hunderte von oszillierenden Transkripten während des Zellzyklus von HEK293-Zellen zu schätzen. Wir fanden heraus, dass Gene ihre Expression mit unterschiedlichen Strategien regulieren und spezifische Modi zur Feinabstimmung ihrer kinetischen Raten entlang des Zellzyklus haben. / In this PhD dissertation we investigated the behaviour of human cells through space and time. High quality datasets of subcellular regions in HEK293 cells were generated using BirA* proximity labelling activity and restricting its localization at cellular regions difficult to purified with traditional methods (i.e., the cytosol-facing sides of the endoplasmic reticulum, mitochondria, and plasma membranes). We then developed an approach to map the distribution of proteins actively binding to RNA, and named it f-XRNAX. We recovered background-corrected proteomes for nuclei, cytoplasm and membranes of HEK293 cells. Surprisingly, many non-canonical RBPs were identified in the membrane fraction, and their peptide profiles were enriched in regions with high density of intrinsically disordered regions, indicating a possibly weak interaction with RNA mediated by these non-structural motives. Lastly, we provided evidence of the differential binding to RNA of the same protein in different HEK293 compartments. In the second part of this thesis, we focused on the determination and quantification of newly transcribed RNAs at the single-cell level. The kinetics of RNA transcription, processing and degradation were until recently not measurable at the single-cell level. Thus, we have developed a novel approach (called SLAM-Drop-seq ) by adapting the published SLAM-seq method to single cells. We used SLAM Drop-seq to estimate time-dependent RNA kinetics rates of transcription and turnover for hundreds of oscillating transcripts during the cell cycle of HEK293 cells. We found that genes regulate their expression with different strategies and have specific modes to fine-tune their kinetic rates along the cell cycle.
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Using modern microscopy and image analysis methods to study dosage compensation in C. elegans

Breimann, Laura 17 February 2022 (has links)
Condensine sind essentiell für die Faltung von Chromatin und wurden auch mit der Transkriptionsregulation in Verbindung gebracht. Der zugrunde liegende Mechanismus für die Transkriptionsregulation ist jedoch unklar. Condensin DC in C. elegans ist ein gutes Modell zur Erforschung der Transkriptionsregulation durch Condensine, da es spezifisch für die Dosiskompensation der Gene auf dem X Chromosom benutzt wird. Condensin DC bindet an beide X Chromosome in C. elegans Hermaphroditen und reduziert deren Transkription um die Hälfte. In meiner Dissertation habe ich untersucht, welche Rolle ein dynamisches Binden von Condensin DC an Chromatin spielt und wie dies die Transkription während der Embryogenese reguliert. Condensine binden dynamisch an Chromatin, um es zu komprimieren und durch Bildung von Schlaufen die Transkription zu regulieren. Mit Hilfe von „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) habe ich in adulten Darmzellen von C. elegans untersucht, welche Faktoren das dynamische Binden von Condensin DC an die X Chromosomen beeinflussen. Meine Daten zeigen, dass sowohl die ATPase-Domäne von Condensin DC, als auch eine nicht-katalytische Aktivität einer Histon-Demethylase die Bindedynamik von Condensin DC beeinflussen und damit Transkription regulieren. Zusätzlich habe ich mit einem Mikroskopieansatz, der auf dem Nachweis von einzelnen RNA Molekülen beruht (smFISH), die Transkription von mehreren Genen untersucht, die durch Condensin DC während der Embryonalentwicklung reguliert werden. Die aus diesen Daten ermittelten Transkriptionskinetiken deuten darauf hin, dass Condensin DC vorrangig die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert. Zusammenfassend liefert meine Forschung neue Einblicke in die Transkriptionsregulation durch Condensine und kann als Basis für detailliertere, mechanistische Studien der Rolle von Condensinen in der Transkriptionsregulation in C. elegans und auch in anderen Organismen dienen. / Condensins are essential for chromosome compaction and have been implicated in transcription regulation. The mechanistic foundation of this regulatory function is poorly understood. A clear paradigm to address this question is the X-specific condensin DC in C. elegans, which specifically binds to and transcriptionally represses X chromosomes in XX hermaphrodites by 2-fold. In my thesis, I studied condensin DC binding dynamics to the X chromosome and how condensin DC affects transcription kinetics in single embryos. The binding of condensins to chromatin has been described in recent microscopy-based studies as dynamic in processes including loop formation, chromatin compaction and transcription regulation. To study the dynamics of condensin DC binding, I established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in C. elegans adult intestinal cells. With this method, I studied how the ATPase domain and different histone modifiers regulate the dynamic binding of condensin DC. I found that the ATPase domain is critical for binding of the complex and that the noncatalytic activity of a histone demethylase increases the dynamics of condensin DC binding, which is crucial for its role in transcription regulation. To further study the mechanism of condensin DC in transcription regulation, I used an imaging approach based on widefield single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). I obtained thousands of smFISH images for a set of condensin DC-regulated genes and extracted mature and nascent RNA counts in 3D, which I used to determine transcription burst characteristics throughout embryonic development. My data show that condensin DC regulates the frequency of transcription initiation to down-regulate X-chromosomal genes. Taken together, my results provide new insight into condensin-mediated transcription regulation, which can be used to inform future studies on the mechanism of condensins in transcription regulation in C. elegans and other organisms.
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ERK signal duration decoding by mRNA dynamics

Uhlitz, Florian Sören 17 June 2019 (has links)
Der RAF-MEK-ERK-Signalweg steuert grundlegende, oftmals entgegengesetzte zelluläre Prozesse wie die Proliferation und Apoptose von Zellen. Die Dauer des vermittelten Signals wurde als entscheidener Faktor für die Steuerung dieser Prozesse identifiziert. Es ist jedoch nicht eindeutig geklärt, wie die verschiedenen früh und spät reagierenden Genexpressionsmodule kurze und lange Signale unterscheiden können und durch welche kinetischen Merkmale ihre Antwortzeit bestimmt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Proteinphosphorylierungsdaten als auch Genexpressionsdaten aus HEK293-Zellen gewonnen, die ein induzierbares Konstrukt des Proto-Onkogens RAF tragen. Hierbei wurde ein neues Genexpressionsmodul identifiziert, dass sich aus sofort induzierten aber spät antwortenden Genen zusammensetzt. Es unterscheidet sich in der Genexpressionsdynamik und Genfunktion von anderen Modulen, und wurde mit Hilfe mathematischer Modellierung experimenteller Daten identifiziert. Es wurde festgestellt, dass diese Gene aufgrund von langen Halbwertszeiten der vermitteltenden mRNA in der Lage sind spät auf das eingehende Signal zu reagieren und die Dauer des Signals in die Amplitude der Genantwort zu übersetzen. Trotz der langsamen Akkumulation und damit späten Antwortzeit, konnte aufgrund einer GC-reichen Promoterstruktur zunächst vermutet und mit Hilfe eines Markerverfahrens bestätigt werden, dass die Transkription dieser Gene instantan mit Beginn der ERK-Aktivierung startet. Eine vergleichende Analyse zeigte, dass das Prinzip der Signaldauer-Entschlüsselung in PC12-Zellen und MCF7-Zellen, zwei paradigmatischen Zellsystemen für die ERK-Signaldauer, konserviert ist. Insgesamt deuten die Ergebnisse der Untersuchung darauf hin, dass das neu identifizierte Genexpressionsmodul der Entschlüsselung der ERK-Signaldauer dient und das mRNA Halbwertszeiten sowohl hierfür, als auch für die zeitliche Abfolge der Genantwort eine entscheidende Rolle spielen. / The RAF-MEK-ERK signalling pathway controls fundamental, often opposing cellular processes such as proliferation and apoptosis. Signal duration has been identified to play a decisive role in these cell fate decisions. However, it remains unclear how the different early and late responding gene expression modules can discriminate short and long signals and what features govern their timing. Both protein phosphorylation and gene expression time course data was obtained from HEK293 cells carrying an inducible construct of the proto-oncogene RAF. A new gene expression module of immediate-late genes (ILGs) distinct in gene expression dynamics and function was identified by mathematical modelling. It was found that mRNA longevity enables these ILGs to respond late and thus translate ERK signal duration into response amplitude. Despite their late response, their GC-rich promoter structure suggested and metabolic labelling with 4SU confirmed that transcription of ILGs is induced immediately. A comparative analysis showed that the principle of duration decoding is conserved in PC12 cells and MCF7 cells, two paradigm cell systems for ERK signal duration. Altogether, the findings of this study indicate that ILGs decode ERK signal duration and that both decoding capacity and gene expression timing are governed by mRNA half-life.
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RNA Polymerase II identifies enhancers in different states of activation

Caglio, Giulia 15 May 2019 (has links)
Enhancer regulieren die Transkription ihrer Zielgene und deren Expression. Sie bieten eine Bindestelle für verschiedenste Transkriptionsfaktoren (TF) und RNA Polymerase II (RNAPII) und unterstützen die Gentranskription durch das Zustandekommen von Chromatinkontakten. Zusätzlich transkribiert RNAPII in Enhancer-Regionen kurze, non-polyadenylierte Transkripte, die man Enhancer-RNA (eRNA) nennt. Der Mechanismus der RNAPII-Rekrutierung und –Regulation an Enhancern ist bisher wenig verstanden, insbesondere wie das Vorhandensein von RNAPII-Modifikationen den Chromatinstatus, -faltung sowie die Genaktivierung beeinflusst. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Enhancer-Bestimmung miteinander verglichen. Während eine klare Bestimmung des besten Ansatzes sich als komplex erwies, konnte gezeigt werden, dass die Bindung von RNAPII an regulatorische Regionen in Zusammenhang mit TF eine universelle Konstante darstellte. Weiterhin wurden der Status der Enhancer-gekoppelten RNAPII-Aktivierung und deren Transkriptionsaktivität untersucht. Als Hauptergebnis ergab sich, dass der RNAPII-Status mit der Enhancer-Aktivität und daraus folgend mit veränderter Transkriptionsaktivität korreliert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein extragenischer RNAPII ein neues Werkzeug zur Identifikation von regulatorischen Regionen ist. Erfolgreich konnten regulatorische Regionen in embryonalen Stammzellen der Maus sowie während der neuronalen Differenzierung vorhergesagt und mittels Enhancer-Aktivität in-vivo bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass im Laufe der der neuronalen Differenzierung extragenische RNAPII-Bindung spezifische Aktivierungsmuster aufweist: ihr Transkriptionslevel wird durch Kinasen feinmaschig reguliert und es werden verschiedene Formen maturierter RNA erzeugt. Zusammenfassend konnte RNAPII als Werkzeug zur Identifikation und Charakterisierung regulatorischer Regionen in verschiedenen Zelltypen ausgemacht werden. Selbst mit minimalen RNAPII-Datensätzen ist es möglich, gleichzeitig regulatorische Regionen zu identifizieren als auch ihren eigenen Aktivierungsstatus sowie den ihrer kodierender Genpromotoren zu bestimmen. / Enhancers regulate transcription of target genes and gene expression. They act as recruitment sites for multiple transcription factors (TFs) and RNA polymerase II (RNAPII) and favour transcription of target genes through chromatin contacts. RNAPII at enhancer regions transcribes short and mostly non-polyadenylated transcripts, called enhancer RNAs (eRNAs). The mechanisms of RNAPII recruitment and regulation at enhancers remain ill understood, in particular how signalling through RNAPII modifications may influence chromatin states, looping and gene activation. In this study, I compare enhancer lists defined with different approaches and find that their relation is very complex. However, I find that RNAPII binding co-occurs with TF binding at regulatory regions, independently of the identification approach used. I characterize the state of RNAPII activation at enhancers and its transcriptional activity. I find that RNAPII state reflects enhancer activation state and correlates with different transcriptional outputs. In addition, I demonstrate that extragenic RNAPII is a novel tool to identify regulatory regions. I successfully identified putative regulatory regions in mESC and during neuronal differentiation, with enhancer activity in vivo. Extragenic RNAPII regions have specific activation patterns during neuronal differentiation, are finely regulated at the transcriptional level by kinases and transcribe differently mature RNAs. In conclusion, I establish RNAPII as a tool to identify and characterise regulatory regions in a cell type of interest. With minimal RNAPII datasets it is possible to simultaneously identify regulatory regions, infer their state of activation, and the state of activation of coding gene promoters.
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Developmental regulomes that drive tissue-specific and temporally controlled gene expression in Drosophila melanogaster

Guimarães, Ana Luísa 12 February 2020 (has links)
Während der Entwicklung des Organismus führen naive Zellen aufgrund eines streng regulierten Transkriptionsprogramms zu differenzierten Zelltypen und Geweben. Obwohl viele Aspekte dieses Differenzierungsprozesses noch wenig verstanden sind, ist allgemein anerkannt, dass Transkriptionsfaktoren (TFs), die mit cis-regulatorischen Modulen (CRMs), nämlich Enhancern, interagieren, einen wesentlichen Beitrag zur Regulierung der räumlich-zeitlichen Genexpression leisten. Um die regulatorischen Wechselwirkungen von Enhancern zu verstehen, verwendete ich eine Technik namens inSTEP, von zwei wichtigen neurogenen Enhancern und einem mesodermalen Enhancer zu entschlüsseln. inSTEP ist eine Abkürzung für in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics und beinhaltet die Präzipitation eines ausgewählten Enhancers zusammen mit all seinen gebundenen Elementen aus einem bestimmten Gewebe zur Identifizierung durch Massenspektrometrie (MS), wodurch die Identifizierung von regulatorischen Kandidaten ermöglicht wird, die die Neurogenese vorantreiben. Das Herunterfallen von mindestens zwei der mutmaßlichen Regulierungskandidaten CG4707 und CG2962 führte zu einem veränderten Reportergen-Expressionsmuster, das vom vndenhancer gesteuert wurde, was darauf hindeutet inSTEP ist in der Lage, neue regulatorische Proteine zu identifizieren, die an der Regulation der Genexpression im sich entwickelnden Nervensystem beteiligt sind. Einer der Enhancer, an denen ich am meisten interessiert bin, ist ein Enhancer für das Gen vnd, das einen entscheidenden TF für die Neurogenese codiert. Ich habe mein Projekt daher über die Frage hinaus erweitert, wie vnd-Expression reguliert wird, um auch die Rolle einzubeziehen, die Vnd selbst bei der Neurogenese spielt. Ich habe ChIP-seq-Experimente durchgeführt, um die genomweiten Bindungsprofile von Vnd aufzuklären, und ich habe Werkzeuge entwickelt, die die isoformspezifische Rolle von Vnd aufklären. / During organismal development, naive cells give rise to differentiated cell types and tissues as a result of a tightly regulated transcriptional programs. Although many aspects of this differentiation process are still poorly understood, it is widely accepted that transcription factors (TFs) interacting with cis-regulatory modules (CRMs), namely enhancers, are major contributors to regulate spatio-temporal gene expression. In order to understand the regulatory interactions of enhancers, I used a technique called inSTEP to unravel the enhancer-protein interactions on two major neurogenic enhancers (for the vnd and rho genes) and one mesodermal enhancer (1070enhancer), for which no target genes are known. inSTEP is an acronym for in vivo Spatio-Temporal Enhancer Proteomics and entails precipitation of a chosen enhancer together with all its bound elements from a specific tissue, for identification by mass spectrometry (MS), thus enabling the identification of regulatory candidates driving neurogenesis. I have identified candidate regulators in the ventral column and selected ten to do follow-up experiments The knock down of at least two of the vndenhancer putative regulators, CG4707 and CG2962, led to an altered reporter gene expression pattern driven by the vndenhancer, suggesting that inSTEP is able to identify new regulatory proteins involved in the regulation of gene expression in the developing nervous system. One of the enhancers I am most interested in is an enhancer for the gene vnd, which encodes a crucial TF for neurogenesis. I have therefore expanded my project beyond the question of ‘how’ vnd expression is regulated, to also include the role Vnd itself plays in neurogenesis. I have conducted ChIP-seq experiments to elucidate the genome-wide binding profiles of Vnd and I have developed tools that will elucidate the isoform-specific role of Vnd.
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Unterschiedliche Autoregulation am PU.1 Lokus in B -Zellen und myeloischen Zellen

Leddin, Mathias 21 June 2011 (has links)
Als Schlüsselfaktor des hämatopoietischen Systems spielt PU.1 eine ent-scheidende Rolle in der Entwicklung der meisten hämatopoietischen Li-nien. Das PU.1 Expressionslevel bestimmt das Differenzierungspotential hämatopoietischer Stammzellen und Vorläufer. In den unterschiedlichen Zelltypen werden verschiedene Expressionsstärken etabliert. Wie diese zelltypischen Expressionslevel vonPU.1 generiert werden, ist bisher weit-gehend unbekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde mit Hilfe eines transgenen Maus-modells die cis-regulatorische Einheit von PU.1 definiert, um mit nachfol-genden molekularbiologischen und genomweiten Ansätzen Mechanismen der zellspezifischen Regulation von PU.1 zu aufzuzeigen. Die Definition der cis-regulatorischen Einheit von PU.1 erfolgte mit Hilfe eines transgenen Mausmodells, welches ein humanes PU.1 BAC Kons-trukt trägt. Es konnte gezeigt werden, dass humanes und murines PU.1 substituierbar sind und den gleichen Regulationsmechanismen unterlie-gen. Mit Hilfe genomweite DNaseI hypersensitivity Analysen, Methylie-rungs- und Bindungsstudien konnte ein neuer Regulationsmechanismus beschrieben werden, der eine spezifische kombinatorische Interaktion verschiedener cis-regulatorischer Elemente erfordert. Durch Reportergenassays in verschiedenen Zelltypen war es möglich, einen myeloischen Enhancer zu identifizieren. Es konnte gezeigt werden, dass PU.1 mit zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktoren interagiert, um unterschiedliche Bindungsmuster an seinen regulatorischen Elementen zu etablieren. Dadurch kommt es zu den spezifischen Expressionstärken von PU.1 / The transcription factor PU.1 occupies a central role in controlling myeloid and early B cell development and its correct lineage-specific expression is critical for the differentiation choice of hematopoietic progenitors. However, little is known of how this tissue-specific pattern is established. We previously identified an upstream regulatory cis-element (URE) whose targeted deletion in mice decreases PU.1 expression and causes leukemia. We show here that the URE alone is insufficient to confer physiological PU.1 expression, but requires the cooperation with other, previously unidentified elements. Using a combination of transgenic studies, global chromatin assays and detailed molecular analyses we present evidence that PU.1 is regulated by a novel mechanism involving cross-talk between different cis-elements together with lineage-restricted autoregulation. In this model, PU.1 regulates its expression in B cells and macrophages by differentially associating with cell-type specific transcription factors at one of its cis-regulatory elements to establish differential activity patterns at other elements.

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