Chlamydia trachomatis (Ctr), an obligate intracellular gram negative human pathogen, causes sexually transmitted diseases and acquired blindness in developing countries. The infectious elementary bodies (EB) of Ctr involved in adherence and invasion processes are critical for chlamydial infectivity and subsequent pathogenesis which requires cooperative interaction of several host cell factors. Few receptors have been known for this early event, yet the molecular mechanism of these receptors involvement throughout Ctr infection is not known. Chlamydial inclusion membrane serves as a signaling platform that coordinates Chlamydia-host cell interaction which encouraged me to look for host cell factors that associates with the inclusion membrane, using proteome analysis. The role of these factors in chlamydial replication was analyzed by RNA interference (RNAi) (in collaboration with AG Thomas Meyer). Interestingly, EphrinA2 receptor (EphA2), a cell surface tyrosine kinase receptor, implicated in many cancers, was identified as one of the potential candidates. Due to the presence of EphA2 in the Ctr inclusion proteome data, I investigated the role of EphA2 in Ctr infection. EphA2 was identified as a direct interacting receptor for adherence and entry of C. trachomatis. Pre-incubation of Ctr-EB with recombinant human EphA2, knockdown of EphA2 by siRNA, pretreatment of cells with anti-EphA2 antibodies or the tyrosine kinase inhibitor dasatinib significantly reduced Ctr infection. This marked reduction of Ctr infection was seen with both epithelial and endothelial cells used in this study. Ctr activates EphA2 upon infection and invades the cell together with the activated EphA2 receptor that interacts and activates PI3K survival signal, promoting chlamydial replication. EphA2 upregulation during infection is associated with Ctr inclusion membrane inside the cell and are prevented being translocated to the cell surface. Ephrins are natural ligands for Ephrin receptors that repress the activation of the PI3K/Akt pathway in a process called reverse signaling. Purified Ephrin-A1, a ligand of EphA2, strongly interferes with chlamydial infection and normal development, supporting the central role of these receptors in Chlamydia infection. Overexpression of full length EphA2, but not the mutant form lacking the intracellular cytoplasmic domain, enhanced PI3K activation and Ctr infection. Ctr infection induces EphA2 upregulation and is mediated by activation of ERK signaling pathway. Interfering with EphA2 upregulation sensitizes Ctr-infected cells to apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) suggesting the importance of intracellular EphA2 signaling. Collectively, these results revealed the first Ephrin receptor “EphA2” that functions in promoting chlamydial infection. In addition, the engagement of a cell surface receptor at the inclusion membrane is a new mechanism how Chlamydia subverts the host cell and induces apoptosis resistance. By applying the natural ligand Ephrin-A1 and targeting EphA2 offers a promising new approach to interfere with Chlamydia infection. Thus, the work provides the evidence for a host cell surface tyrosine kinase receptor that is exploited for invasion as well as for receptor-mediated intracellular signaling to facilitate the chlamydial replication. / Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligat intrazellulär lebendes Gram negatives Bakterium, das Geschlechtskrankheiten verursachen kann. In Entwicklungsländern führt es zudem häufig zu erworbener Blindheit. Die infektiösen Elementarkörper (EB) sind für die Anheftung an die Wirtszelle sowie die Aufnahme von Ctr in die Wirtzelle verantwortlich. Dies ist ein wichtiger Schritt, da nur so die sich anschließende Krankheitsentwicklung stattfinden kann. Diese ist auch abhängig vom engen Zusammenspiel der Ctr Proteine mit den Wirtszellfaktoren. Obgleich dieser Schritt so wichtig ist, wurden erst wenige Wirtszellrezeptoren gefunden und welche Rolle diese Rezeptoren im weiteren Verlauf der Infektion spielen, ist noch nicht richtig verstanden. Die chlamydiale Inklusionsmembran fungiert als Signalplattform, die das Zusammenspiel von Chlamydien und Wirtszelle koordiniert. In dieser Arbeit wurden die Wirtszellproteine, die an der Inklusionsmembran lokalisiert sind, mit Hilfe einer Proteomanalyse identifiziert. Anschließend wurde die Rolle dieser Proteine bei der Chlamydienvermehrung in einem RNAi screen untersucht (in Zusammenarbeit mit der AG Thomas Meyer). Hier wurde überraschenderweise der EphrinA2 Rezeptor, eine sich auf der Oberfläche der Zellen befindliche Rezeptor Tyrosin Kinase, die vor allem mit Krebs in Verbindung gebracht wird, als ein potentieller Kandidat identifiziert. Da die Proteomdaten gezeigt haben, dass EphrinA2 an der Inklusionsmembran lokalisiert ist, wurde die Rolle von EphrinA2 während der Ctr Infektion hier näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass EphrinA2 ein direkter Rezeptor für Ctr ist, der sowohl die Adhärenz als auch die Aufnahme von Ctr in die Wirtszelle bewerkstelligt. Vorinkubation von Ctr- EB mit rekombinantem menschlichen EphrinA2, das herunterregulieren von EphrinA2 mit Hilfe einer siRNA oder das Vorinkubieren der menschlichen Zelle mit Antikörpern gegen EphrinA2 oder dem Tyrosinkinase Inhibitor Dasatinib, reduzierten die Ctr Infektion signifikant. Diese drastische Reduktion der Ctr Infektion wurde sowohl in Epithelzellen als auch in Endothelzellen beobachtet. Ctr aktiviert EphrinA2 während der Infektion und invadiert die Wirtszelle zusammen mit dem aktivierten Rezeptor, dieser interagiert mit dem aktivierten PI3K Überlebenssignal, was die Replikation der Chlamydien ermöglicht. An der Inklusionsmembran akkumuliert EphrinA2, da der Transport von neuem Rezeptor zur Zellmembran unterbunden ist. Ephrine sind die natürlichen Liganden der Ephrinrezeptoren, sie unterdrücken die Aktivierung des PI3K/Akt Signalweges in einem Prozess, der reverse Signalübertragung genannt wird. Aufgereinigtes Ephrin-A1, ein Ligand des EphrinA2 Rezeptors, verhindert eine normale Chlamydieninfektion, was eine zentrale Rolle dieses Rezeptors weiterhin bestätigt. Die Überexpression von EphrinA2, erhöhte die PI3K Aktivierung und Ctr Infektion. Dies war nicht der Fall, wenn eine Mutante, der die intrazelluläre Domäne fehlt, überexprimiert wurde. Eine Ctr Infektion induziert die Hochregulierung von EphrinA2, welche durch die Aktivierung des ERK Signalwegs bewerkstelligt wird. Wenn die Hochregulierung von EphrinA2 verhindert wird, werden Ctr infizierte Zellen sensitiver für Apoptose induziert durch tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), was ein weiter Hinweis für die Bedeutung der intrazellulären EphrinA2 Signalübermittlung ist. Insgesamt haben diese Ergebnisse den ersten Ephrin Rezeptor "EphA2" offenbart, der in der Förderung chlamydialer Infektionen fungiert. Hinzu kommt, dass die Bindung eines Oberflächenrezeptors an die Inklusionsmembran ein neuer Mechanismus ist, die Wirtszelle zu verändern und eine Apoptoseresistenz in der Zelle zu induzieren. Die Zugabe des natürlichen Liganden Ephrin-A1 eröffnet eine neue vielversprechende Möglichkeit Chlamydieninfektionen zu bekämpfen. Daher liefert diese Arbeit erste Hinweise, das eine Wirtszelltyrosinkinase, die sich an der Zelloberfläche befindet, notwendig ist für die Invasion und die intrazelluläre Signalübermittlung, welche für die chlamydiale Replikation notwendig ist, essentiell ist.

Knochentumore stellen mit nur 0,2% aller menschlichen Tumore sehr seltene primäre Neoplasien des skelettalen Systems dar. Diese Dissertation beschreibt die genomweite Microarray Analyse von Osteosarkomen und Riesenzelltumoren. Mit einer Microarray Analyse von konventionellen und metastatischen Osteosarkom-Geweben verglichen zu einer Osteoblasten-Primärkultur (HOBc) wurden Gene ermittelt, die im Prozess der Entstehung und Entwicklung sowie im Verlauf der Metastasierung von Osteosarkomen eine Rolle spielen könnten. EFNA1, EphA2, EphA3 und EFNB2 wiesen sehr hohe relative Expressionswerte und eine deutliche Aufregulierung in den Osteosarkomen im Vergleich zu HOBc auf. Mittels RT-PCR und immunhistochemischer Färbung wurde die Expression von EFNA1, EFNA2, EFNB1, EFNB3, EphA1 und EphA2 validiert. Da die deutliche Aufregulation von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom bestätigt werden konnte, wurden beide Ephrine funktionell untersucht. EphA2 wird in Osteosarkom-Zellen durch seinen Liganden EFNA1 Zeit- und Dosis-abhängig internalisiert und vermutlich degradiert. Die Stimulierung des EphA2 Rezeptors durch EFNA1/Fc führt zu einer Aktivierung von Mek, Erk und den Transkriptionsfaktoren Elk1 und cJun. In Wachstumsassays wurde eine signifikant erhöhte Proliferation der stark EphA2 exprimierenden MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen durch EFNA1/Fc beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass die Überexpression von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom eine Rolle während der osteogenen Tumorgenese spielen. Interessanterweise scheinen EphA2 und EFNA1 direkte Zielgene des Mek/Erk-Signalweges zu sein. Wir vermuten einen positiven „feedback-loop“, der die EphA2-Expression über die Aktivierung des Ras/Erk-Signalweges reguliert. Mittels Microarray Analyse wurden auch primäre und rezidivierende Riesenzelltumor-Gewebe analysiert. Riesenzelltumore sind osteolytische Neoplasien mit einem variablen Grad der Aggressivität. Durch diese molekulare Charakterisierung konnten neue Gene (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 und FGFR3) als differentiell exprimiert detektiert werden. Sie wurden bisher noch nicht mit Riesenzelltumoren assoziiert und spielen vermutlich eine Rolle in der Tumorprogression. Weitere Analysen größerer Patientenkollektive sowie funktionelle Studien sind notwendig, um interessante Gene wie AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun und MMP13 weiter zu untersuchen, und um ihre mögliche Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Riesenzelltumoren zu verfestigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die extrazelluläre und intrazelluläre Expression von CD52 in mesenchymalen Tumoren beschrieben. Die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD52 in den Microarray Analysen der Riesenzelltumore und Osteosarkome veranlassten uns, CD52 näher zu analysieren. Wir bestätigten die in vivo und in vitro Expression von CD52 in Osteosarkomen, Chondrosarkomen und Riesenzelltumoren sowie in weiteren benignen und malignen skelettalen Entitäten verglichen zu deren nicht-neoplastischen Gegenstücken. Generell wiesen die malignen Tumore eine höhere Expression verglichen mit den benignen Entitäten auf, was eine Rolle des CD52-Antigens bei der Entwicklung von Knochentumoren vermuten lässt. Weiterhin zeigte unsere Analyse erstmals, dass der derzeit bei der chronisch lymphatischen Leukämie eingesetzte CAMPATH-1H-Antikörper auch in der Lage ist, die Proliferation von MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen Komplement- und Antikörper-vermittelt zu reduzieren. / Bone tumors are rare neoplasms of the skeletal system amounting to only 0.2% of the overall human tumor burden. This dissertation describes a genome wide microarray analysis of osteosarcoma and giant cell tumor of the bone as well as a functional analysis of ephrins in osteosarcoma cell lines. We used a microarray analysis to detect genes differentially expressed between a normal bone osteoblast primary culture (HOBc) and primary and metastatic osteosarcoma tissue. For EFNA1, EphA2, EphA3 and EFNB2 an increased expression was detected in the osteosarcoma tissue samples compared to HOBc. The study verified the increased expression of EFNA1 and EphA2 through RT-PCR and immunohistochemical staining in human osteosarcomas and so the effects of their interaction in osteosarcoma cell lines were analyzed. We observed time- and dosedependent suppression of EphA2 expression via internalisation and degradation in osteosarcoma cell lines through the EFNA1 ligand. The stimulation of the EphA2 receptor by EFNA1/Fc led to an activation of Mek and Erk. In addition, this stimulation resulted in an activation of the transcription factors Elk1 and cJun. In MTT-assays a significantly higher proliferation of high expressing EphA2 MNNG/HOS osteosarcoma cells was observed by ligand-treatment. Our results show that EphA2 and EFNA1 are overexpressed in osteosarcomas suggesting a role of the EphA2 receptor during osteogenic tumorigenesis. We further showed that EphA2 and EFNA1 are targets of the Mek/Erk pathway. We suggest that a possible positive feedback loop regulates EphA2-expression through the activation of Mek/Erk activity. Further one, a molecular characterization of primary and relapse giant cell tumor tissue (GCT) was performed via microarray hybridization. GCTs are osteolytic neoplasms with variable degrees of aggressiveness. We established gene expression profiles and discovered a number of new genes (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 and FGFR3) that have not been described in GCTs before. Further studies and functional analyses are necessary in order to verify genes like AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun and MMP13 that may be involved in the progression of the GCTs and to identify potential targets for future therapy. In this study we described for the first time the extracellular and intracellular expression of CD52 in mesenchymal tumors. We confirmed the expression of the CD52 mRNA and protein both in vivo and in vitro of osteosarcomas, chondrosarcomas, GCTs and other benign and malign skeletal tumors compared to their non-neoplastic counterpart. In general, the malignant tumors showed a higher CD52-expression compared to the benign entities suggesting a role in the progression of bone tumors. Our results obtained in osteosarcoma MNNG/HOS cells showed that CAMPATH-1H, a CD52 antibody currently used in the treatment of chronic lymphatic leukaemia, led to a complement- and antibody-dependent reduction of viable osteosarcoma cells.

Au sein d'un organisme les cellules se divisent et assurent la croissance, la différentiation et l'homéostasie des tissus. Des travaux récents proposent qu'elles communiquent activement entre voisines au sein des organes solides pour coordonner leur propre division et la préservation de l'intégrité tissulaire. Nous proposons que la signalisation Eph-éphrine, acteur de la communication cellulaire locale, participe à cette coordination entre division cellulaire et cohésion du tissu. Au cours de ma thèse, j'ai démontré dans plusieurs modèles cellulaires que la signalisation Eph-éphrine contrôle la division cellulaire et peut induire des retards dans l'abscission et de la polyploïdie. J'ai prouvé par vidéomicrosocpie que ces défauts d'abscission dépendent du domaine catalytique du récepteur EphB2 et de l'activation de la protéine tyrosine kinase relais c-Src. En cascade, c-Src phosphoryle un régulateur clé de la stabilité du pont intercellulaire, la protéine citron kinase (CitK). J'ai également observé que CitK était anormalement localisé durant la cytocinése en aval de la voie Eph. Par des essais kinase in vitro, j'ai exclu une phosphorylation directe de CitK par le récepteur Eph et identifié c-Src comme capable de phosphoryler directement CitK. J'ai identifié les résidus tyrosines de CitK phosphorylés par c-Src, mutés deux d'entre eux et à l'aide d'analyses de sauvetage phénotypique, démontré que ces résidus étaient nécessaires et suffisants pour induire des défauts d'abscission. J'ai ensuite validé in vivo ce rôle original de la voie Eph-éphrine, dans le contexte du développement neuronal chez la souris. Plusieurs membres de la famille des Eph-éphrines sont exprimés dans les progéniteurs neuraux à l'origine des neurones corticaux et des auteurs ont montrés que CitK contrôle la cytocinèse de ces cellules. En utilisant un système Cre-lox, j'ai spécifiquement éteint la signalisation Eph dans ces progéniteurs et observé une modification de la ploïdie neuronale dans ces animaux. J'ai également observé dans les progéniteurs neuraux une co-localisation physiologique de résidus tyrosines phosphorylés et de la protéine CitK, qui adopte un enrichissement apical caractéristique. Ces résultats suggèrent notamment que la signalisation Eph-éphrine pourrait contrôler l'abscission des progéniteurs neuraux via la phosphorylation de CitK. La cytocinèse est aujourd'hui décrite comme un processus cellulaire autonome orchestré par la machinerie intracellulaire. Les résultats obtenus durant mon doctorat suggèrent que la cytocinèse est également régulée par l'environnement local de la cellule comme j'en ai fait la démonstration avec la signalisation Eph-éphrine. D'autre part, mes travaux suggèrent que la phosphorylation de CitK sert d'interrupteur moléculaire durant la progression à travers la division cellulaire et le contrôle de la ploïdie des neurones. / Cells within an organism successfully divide to ensure growth, differentiation and homeostasie. Recent work suggests that dividing cells actively communicate with neighbours thus spatially and temporally coordinating cell division while maintaining tissue cohesiveness. We hypothesized that Eph-ephrin signalling, a local cell-cell signalling pathway, could participate in coordinating cell division within a tissue. Using vertebrate and invertebrate cell culture models I showed that Eph-signalling controls cell division and induces delay in the abscission of nascent daughter cells as well as polyploidy. Using time-lapse imaging I proved that the Eph-mediated abscission failure depends on the catalytic activity of the receptor via the non receptor tyrosine kinase relay molecule c-Src. Downstream of Eph signalling c-Src phosphorylates the protein citron kinase (CitK) a well known regulator of intercellular bridge stability. I also observed that CitK was abnormally localized during cytokinesis when Eph signalling was active. Further, using in vitro kinase assays, I demonstrated that Eph does not directly phosphorylate CitK but that c-Src could do so. In addition, using Mass Spectrometry I mapped all tyrosine residues directly phosphorylated by c-Src. I mutated two of them located in the Rho binding domain of CitK and demonstrated that phosphorylation of those residues are necessary and sufficient to induce cytokinesis failure. I validated in vivo this novel role of Eph-ephrin signalling in a physiological context in the developing mouse neocortex. Members of the Eph/ephrin family are expressed in neural progenitors that give rise to neurons of the cortex upon neurogenic division. Importantly, CitK has been shown by others to control cytokinesis of these progenitor cells. Using the Cre-lox system, I specifically turned off Eph forward signalling in neural progenitor cells and observed an alteration of neuronal ploidy in these mutant animals. Further, I also observed that CitK which adopts a particular apical localisation in neural progenitors physiologically co-localized with phosphorylated tyrosine residues. Altogether, these results suggest that Eph-ephrin signalling controls abscission of neural progenitors by promoting phosphorylation of CitK. The textbook view of cytokinesis is that it is a cell autonomous event orchestrated by the intracellular machinery. Data obtained during my PhD suggest that cytokinesis is also regulated by local environment, here Eph/ephrin signalling, and that phosphorylation of CitK may represent a molecular switch in the normal progression of cell division and in the control of neuronal ploidy.

No description available.