Background: Relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) is an autoimmune inflammatory disorder of the central nervous system, with significant morbidity and mortality. The lymphocyte depleting, anti-CD52 monoclonal antibody alemtuzumab is a highly effective treatment option in RRMS, though associated with high rates of secondary autoimmune disorders. As alemtuzumab is now in routine clinical use, following licensing in Europe and the US, understanding the effects of repeated treatment cycles and reducing the risk of secondary autoimmunity is timely and essential. In this thesis, I explore how repeated treatment impacts the extent of lymphodepletion. I also study the role of soluble CD52, recently described as suppressive via interaction with Siglec-10, in the mechanism of secondary autoimmunity, and determine the biomarker potential of pre-treatment cytokine levels. Findings: CD4 and CD8 lymphocytes are less effectively depleted with repeated treatment cycles. Lymphocyte surface CD52 density was found by flow cytometry to be significantly lower after alemtuzumab treatment, although CD52-negative clones are not seen. In a cytolysis assay, reduced CD52 density was shown to correlate with reduced susceptibility to alemtuzumab. In addition, activated proliferating T lymphocytes, as observed after treatment, downregulated CD52 expression in a gene expression assay and shed the antigen from cell surface as demonstrated by ELISA and flow cytometry. The development of immunoassays to detect and quantify anti-idiotype antibodies to alemtuzumab is presented. The occurrence of antibodies at retreatment did not reduce lymphocyte depletion. A regulatory role for soluble CD52 was not found in suppression assays, and the proportion of antigen-activated CD52hi T cells did not vary between healthy controls and RRMS individuals. Siglec-10 was not seen on cell surface of activated T cells by flow cytometry and gene expression; thus concluding that soluble CD52 does not play a role in post-alemtuzumab induced autoimmunity. Prior to treatment, the only serum cytokine found to distinguish individuals who develop autoimmunity from those who do not was IL-21 (higher in the autoimmune cohort), however currently commercially available IL-21 immunoassays have no utility as predictive biomarker tests.

Knochentumore stellen mit nur 0,2% aller menschlichen Tumore sehr seltene primäre Neoplasien des skelettalen Systems dar. Diese Dissertation beschreibt die genomweite Microarray Analyse von Osteosarkomen und Riesenzelltumoren. Mit einer Microarray Analyse von konventionellen und metastatischen Osteosarkom-Geweben verglichen zu einer Osteoblasten-Primärkultur (HOBc) wurden Gene ermittelt, die im Prozess der Entstehung und Entwicklung sowie im Verlauf der Metastasierung von Osteosarkomen eine Rolle spielen könnten. EFNA1, EphA2, EphA3 und EFNB2 wiesen sehr hohe relative Expressionswerte und eine deutliche Aufregulierung in den Osteosarkomen im Vergleich zu HOBc auf. Mittels RT-PCR und immunhistochemischer Färbung wurde die Expression von EFNA1, EFNA2, EFNB1, EFNB3, EphA1 und EphA2 validiert. Da die deutliche Aufregulation von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom bestätigt werden konnte, wurden beide Ephrine funktionell untersucht. EphA2 wird in Osteosarkom-Zellen durch seinen Liganden EFNA1 Zeit- und Dosis-abhängig internalisiert und vermutlich degradiert. Die Stimulierung des EphA2 Rezeptors durch EFNA1/Fc führt zu einer Aktivierung von Mek, Erk und den Transkriptionsfaktoren Elk1 und cJun. In Wachstumsassays wurde eine signifikant erhöhte Proliferation der stark EphA2 exprimierenden MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen durch EFNA1/Fc beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass die Überexpression von EphA2 und EFNA1 im Osteosarkom eine Rolle während der osteogenen Tumorgenese spielen. Interessanterweise scheinen EphA2 und EFNA1 direkte Zielgene des Mek/Erk-Signalweges zu sein. Wir vermuten einen positiven „feedback-loop“, der die EphA2-Expression über die Aktivierung des Ras/Erk-Signalweges reguliert. Mittels Microarray Analyse wurden auch primäre und rezidivierende Riesenzelltumor-Gewebe analysiert. Riesenzelltumore sind osteolytische Neoplasien mit einem variablen Grad der Aggressivität. Durch diese molekulare Charakterisierung konnten neue Gene (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 und FGFR3) als differentiell exprimiert detektiert werden. Sie wurden bisher noch nicht mit Riesenzelltumoren assoziiert und spielen vermutlich eine Rolle in der Tumorprogression. Weitere Analysen größerer Patientenkollektive sowie funktionelle Studien sind notwendig, um interessante Gene wie AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun und MMP13 weiter zu untersuchen, und um ihre mögliche Beteiligung an Entstehung und Entwicklung von Riesenzelltumoren zu verfestigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die extrazelluläre und intrazelluläre Expression von CD52 in mesenchymalen Tumoren beschrieben. Die unterschiedlichen Expressionsmuster von CD52 in den Microarray Analysen der Riesenzelltumore und Osteosarkome veranlassten uns, CD52 näher zu analysieren. Wir bestätigten die in vivo und in vitro Expression von CD52 in Osteosarkomen, Chondrosarkomen und Riesenzelltumoren sowie in weiteren benignen und malignen skelettalen Entitäten verglichen zu deren nicht-neoplastischen Gegenstücken. Generell wiesen die malignen Tumore eine höhere Expression verglichen mit den benignen Entitäten auf, was eine Rolle des CD52-Antigens bei der Entwicklung von Knochentumoren vermuten lässt. Weiterhin zeigte unsere Analyse erstmals, dass der derzeit bei der chronisch lymphatischen Leukämie eingesetzte CAMPATH-1H-Antikörper auch in der Lage ist, die Proliferation von MNNG/HOS Osteosarkom-Zellen Komplement- und Antikörper-vermittelt zu reduzieren. / Bone tumors are rare neoplasms of the skeletal system amounting to only 0.2% of the overall human tumor burden. This dissertation describes a genome wide microarray analysis of osteosarcoma and giant cell tumor of the bone as well as a functional analysis of ephrins in osteosarcoma cell lines. We used a microarray analysis to detect genes differentially expressed between a normal bone osteoblast primary culture (HOBc) and primary and metastatic osteosarcoma tissue. For EFNA1, EphA2, EphA3 and EFNB2 an increased expression was detected in the osteosarcoma tissue samples compared to HOBc. The study verified the increased expression of EFNA1 and EphA2 through RT-PCR and immunohistochemical staining in human osteosarcomas and so the effects of their interaction in osteosarcoma cell lines were analyzed. We observed time- and dosedependent suppression of EphA2 expression via internalisation and degradation in osteosarcoma cell lines through the EFNA1 ligand. The stimulation of the EphA2 receptor by EFNA1/Fc led to an activation of Mek and Erk. In addition, this stimulation resulted in an activation of the transcription factors Elk1 and cJun. In MTT-assays a significantly higher proliferation of high expressing EphA2 MNNG/HOS osteosarcoma cells was observed by ligand-treatment. Our results show that EphA2 and EFNA1 are overexpressed in osteosarcomas suggesting a role of the EphA2 receptor during osteogenic tumorigenesis. We further showed that EphA2 and EFNA1 are targets of the Mek/Erk pathway. We suggest that a possible positive feedback loop regulates EphA2-expression through the activation of Mek/Erk activity. Further one, a molecular characterization of primary and relapse giant cell tumor tissue (GCT) was performed via microarray hybridization. GCTs are osteolytic neoplasms with variable degrees of aggressiveness. We established gene expression profiles and discovered a number of new genes (AMFR, CD52, Claudin7, EphA1 and FGFR3) that have not been described in GCTs before. Further studies and functional analyses are necessary in order to verify genes like AMFR, Cathepsin L, Claudin7, EphA1, FGFR3, Jun and MMP13 that may be involved in the progression of the GCTs and to identify potential targets for future therapy. In this study we described for the first time the extracellular and intracellular expression of CD52 in mesenchymal tumors. We confirmed the expression of the CD52 mRNA and protein both in vivo and in vitro of osteosarcomas, chondrosarcomas, GCTs and other benign and malign skeletal tumors compared to their non-neoplastic counterpart. In general, the malignant tumors showed a higher CD52-expression compared to the benign entities suggesting a role in the progression of bone tumors. Our results obtained in osteosarcoma MNNG/HOS cells showed that CAMPATH-1H, a CD52 antibody currently used in the treatment of chronic lymphatic leukaemia, led to a complement- and antibody-dependent reduction of viable osteosarcoma cells.

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