In schnell wachsenden Hyphen des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii ist die Oberflächenvergrößerung bis zu 40-fach höher, als in den Knospen des nah verwandten Pilzes Saccharomyces cerevisiae. Um die Wachstumszonen auf die Hyphenspitzen zu begrenzen, müssen Polaritätsfaktoren wie Rezeptoren und Sensoren, sowie überschüssiges Membranmaterial in subapikalen Bereichen von der Zelloberfläche entfernt werden. Dies wird durch den Prozess der Endozytose erreicht. In S. cerevisiae ist der Hauptendozytoseweg die Clathrin- und Aktin-abhängige Endozytose und der Prozess ist bereits gut charakterisiert. A. gossypii besitzt Homologe zu fast allen Komponenten dieser endozytischen Maschinerie und ist daher besonders gut geeignet die Anpassung des endozytischen Prozesses an schnelles, polares Wachstum zu untersuchen. Um die Endozytose während des polaren Hyphenwachstums zu analysieren, wurden neun homologe Proteine des aus S. cerevisiae bekannten Endozytosemechanismus mittels „live cell imaging“ und TIRF-Mikroskopie sowohl in langsam, als auch in schnell wachsenden Hyphen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Endozytoserate in den schnell wachsenden Hyphen in A. gossypii im Vergleich zu Hefe-Zellen deutlich erhöht ist. Dies wird sowohl durch die Beschleunigung des endozytischen Prozesses, als auch durch eine erhöhte Anzahl an endozytischen Ereignissen pro µm2 Zelloberfläche erreicht. Die fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigten zudem, dass sich die Endozytosezone bei hoher Wachstumsgeschwindigkeit um ca. 3 µm in den hinteren Hyphenbereich verlagert. Ein wesentlicher Unterschied des endozytischen Prozesses in A. gossypii im Vergleich zu S. cerevisiae ist die Funktion von Clathrin. Clathrin kolokalisierte mit keiner der getesteten endozytischen Komponenten und konnte ausschließlich an zellinternen Strukturen detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass Clathrin bei der Endozytose in A. gossypii keine Rolle spielt und seine Funktion auf interne Kompartimente wie die Endosomen oder das Golgi-Netzwerk beschränkt ist. Die Unterschiede in der Clathrin-Funktion zwischen S. cerevisiae und A. gossypii hängen vermutlich mit einer minimalen Abweichung im Genset endozytischer Komponenten in A. gossypii zusammen. So besitzt A. gossypii kein Homologes zu ScSla2, welches in Hefe sowohl mit Clc1, als auch mit dem Aktin-Zytoskelett interagiert. Der Sequenzvergleich der Clc1-Proteine aus S. cerevisiae und A. gossypii zeigt, dass in AgClc1 die Sla2-Bindedomäne fehlt. Mittels eines Komplementationstests konnte nachgewiesen werden, dass die Fusion dieser Bindedomäne an das AgCLC1-Gen ausreicht, um die endozytische Funktion von Clathrin in S. cerevisiae wieder herzustellen. In S. cerevisiae führt die Interaktion von Sla2 und Clc1 zu einer verminderten Aktin-Anlagerung an das entstehende Vesikel und dient als Regulationsmechanismus für die Membraneinstülpung. Das Fehlen dieses Mechanismus könnte in A. gossypii die Membraneinstülpung durch vermehrte Aktin-Anlagerung beschleunigen und auf diese Weise zur Anpassung an das schnelle Hyphenwachstum beitragen.

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Es wurde ein System zur chemischen Modifizierung von Einzelcysteinvarianten des PTS- Transporters EIICBGlc etabliert, mit dem durch unterschiedliche Zugänglichkeit von Markersubstanzen die Zuordnung der jeweiligen Cysteine in Hinblick auf die Cytoplasmamembran gelang. Für die Methode war es notwendig, eine cysteinfreies EIICBGlc zu konstruieren. Dieses trägt des Weiteren eine Mutation, die die Phosphorylierung des Substrats Glukose von dem Transport entkoppelt. Dies ist notwendig, da das Cystein 421, das für die Phosphorylierung des WT verantwortlich ist, in dem cysteinfreien Protein nicht mehr vorhanden ist. Die Transportfähigkeit der Mutanten konnte nachgewiesen werden. Die Ergebnisse des Cystein-Scannings, Daten über dieses Protein aus vorangegangenen Arbeiten, sowie ein Vergleich der Struktur des EIIChb aus B. cereus, ermöglichten die Erstellung eines neuen Modells des Proteins EIICBGlc. In diesem Modell enthält das Protein 10 transmembrane Helices. Die postulierte Substratbindetasche wird aus haarnadelartigen Strukturen gebildet. Die Lage funktioneller Mutanten in dem Modell wurde diskutiert. Die entkoppelte Mutation R203H des Proteins EIICBGlc wurde isoliert. Eine Charakterisierung in Bezug auf ihre Fähigkeit Mlc zu titrieren, zeigte, dass eine Bindung von Mlc in diesem Protein möglich ist. Eine Konformationsänderung, die die Wechselwirkung zu Mlc inhibiert, liegt daher in diesem Protein nicht vor. Es wurde außerdem gezeigt, dass keine Erweiterung der Substratspezifität in diesem Protein vorliegt.

As shown in previous studies Streptomyces lividans enzymatically inactivates fusidic acid by specific esterase FusH giving rise to the 16ß-OH derivative, which sponaneously converts to the lactone.in this work it was shown that S. lividans further modifies fusidic acid and both derivatives, which resulted in several new related substances. The two intermediates (La, Lb) were isolated from the culture filtrate of S. lividans, which was grown in the presence of fusidic acid. The differences in their chemical structures indicate the involvement of multiple enzyme reactions related to hydroxylation, hydration, dehydrogenation and isomerization. Several enzymes were identified and two of them (FusG, FusB) were partially characterized. According to their characteristics and the structures of isolated intermediates, the identified enzymes which are involved in biotranformation are conceivably related to the ones implicated in ß oxidation. The biotransformation of fusidic acid and its derivatives by S. lividans is so far unique, since characterized substances La and Lb have not been found in either fusidic acid-producing or fusidic acid-resistant microorganisms.

The essential gene YNL152w was previously found in a screen designed to isolate putative negative regulators of the S. cerevisiae Pkc1p pathway. Activity assays were performed with a lexA-RLM1-lacZ integrated reporter in different ynl152w truncated mutants. In contrast to the original screen, there were no differences or the activities were even lower in some mutants. To analyze the consequences of different expression levels, YNL152w was expressed under the control of the GAL1/10 promoter. Growth curves were performed under high, intermediate and low expression levels. Strikingly, both conditional strains were able to grow under repressing conditions. However, an aberrant morphology was found suggesting that the cells are indeed affected by low amounts of Ynl152w protein. A series of successive Ynl152wp C-terminal truncations was analyzed to determine cell viability and to investigate the function of the protein. Remarkably, about 2/3 of the protein were dispensable to confer viability. Microscopic analyses of constructs revealed an aberrant morphology characteristic of a cytokinesis defective mutant, with the appearance of swollen cells and formation of big aggregates. Interestingly, the phenotype was more pronounced in the larger truncations. Coherent with these results time-lapse experiments with a large truncated mutant showed a stabilization of the SH3 protein Hof1p at the bud neck. This protein is involved in septum formation and has been reported as a binding partner of YNL152w. The phenotypes observed in the truncated mutants could be attributed to the presence of 4 proline rich motifs. Such motifs have been reported to interact with SH3 domains. An internal deletion of an aspartate rich domain present in the Ynl152wp sequence also displayed a phenotype very similar to that of the largest truncations. Therefore, this domain may play an important role in Ynl152wp function.

The yeast cell wall confers shape and integrity and serves as a first barrier against adverse environmental conditions. This thesis provides a first analysis of the cell wall structure of the milk yeast Kluyveromyces lactis and compares it to the one of the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. Transmission electron microscopy revealed that the cell wall of K. lactis is 60 nm thick in glucose-grown cells and increases to 100 nm on ethanol media, whereas S. cerevisiae displays a cell wall thickness of 100 nm under both conditions. The cell wall proteome of K. lactis shares several homologs with the one of S. cerevisiae, but also contains three proteins not found in the latter. Moreover, three of the common cell wall proteins have two isoforms in K. lactis, but only one in S. cerevisiae. The restructuring of the cell wall on different carbon sources (i.e. glucose versus ethanol) indicates a relation between cell wall synthesis and/or remodeling and glucose signaling. Therefore, a key regulator which mediates the glucose response in S. cerevisiae, the SNF1 protein kinase complex, was further investigated. Mutants lacking the kinase activity have a thinner cell wall and show pronounced cell wall phenotypes in S. cerevisiae, i.e. they are hypersensitive to Zymolyase, Congo red, Calcofluor white and to the antifungal agent Caspofungin. Epistasis analyses with mutants affecting cell wall integrity signaling indicate that the SNF1 complex acts in parallel to the CWI pathway, which is induced upon cell wall stress. Immunological detection reveals the phosphorylation of Thr210 in the Snf1 kinase subunit, which is an indication for the activation of the kinase complex. Genetic analyses suggest that the transcriptional repressor Mig1 may be a downstream target mediating the cellular response. Further epistasis analyses with glycolytic mutants indicate that the availability of glucose-6-phosphate influences the cell wall phenotype of snf1Δ mutants. Hence, the role of the SNF1 complex in cell wall integrity is related to the glucose metabolism and glycolytic flux. This work provides the first comprehensive analysis of the role of glucose signaling and the SNF1 complex in yeast cell wall biosynthesis.

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