In schnell wachsenden Hyphen des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii ist die Oberflächenvergrößerung bis zu 40-fach höher, als in den Knospen des nah verwandten Pilzes Saccharomyces cerevisiae. Um die Wachstumszonen auf die Hyphenspitzen zu begrenzen, müssen Polaritätsfaktoren wie Rezeptoren und Sensoren, sowie überschüssiges Membranmaterial in subapikalen Bereichen von der Zelloberfläche entfernt werden. Dies wird durch den Prozess der Endozytose erreicht. In S. cerevisiae ist der Hauptendozytoseweg die Clathrin- und Aktin-abhängige Endozytose und der Prozess ist bereits gut charakterisiert. A. gossypii besitzt Homologe zu fast allen Komponenten dieser endozytischen Maschinerie und ist daher besonders gut geeignet die Anpassung des endozytischen Prozesses an schnelles, polares Wachstum zu untersuchen. Um die Endozytose während des polaren Hyphenwachstums zu analysieren, wurden neun homologe Proteine des aus S. cerevisiae bekannten Endozytosemechanismus mittels „live cell imaging“ und TIRF-Mikroskopie sowohl in langsam, als auch in schnell wachsenden Hyphen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Endozytoserate in den schnell wachsenden Hyphen in A. gossypii im Vergleich zu Hefe-Zellen deutlich erhöht ist. Dies wird sowohl durch die Beschleunigung des endozytischen Prozesses, als auch durch eine erhöhte Anzahl an endozytischen Ereignissen pro µm2 Zelloberfläche erreicht. Die fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigten zudem, dass sich die Endozytosezone bei hoher Wachstumsgeschwindigkeit um ca. 3 µm in den hinteren Hyphenbereich verlagert. Ein wesentlicher Unterschied des endozytischen Prozesses in A. gossypii im Vergleich zu S. cerevisiae ist die Funktion von Clathrin. Clathrin kolokalisierte mit keiner der getesteten endozytischen Komponenten und konnte ausschließlich an zellinternen Strukturen detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass Clathrin bei der Endozytose in A. gossypii keine Rolle spielt und seine Funktion auf interne Kompartimente wie die Endosomen oder das Golgi-Netzwerk beschränkt ist. Die Unterschiede in der Clathrin-Funktion zwischen S. cerevisiae und A. gossypii hängen vermutlich mit einer minimalen Abweichung im Genset endozytischer Komponenten in A. gossypii zusammen. So besitzt A. gossypii kein Homologes zu ScSla2, welches in Hefe sowohl mit Clc1, als auch mit dem Aktin-Zytoskelett interagiert. Der Sequenzvergleich der Clc1-Proteine aus S. cerevisiae und A. gossypii zeigt, dass in AgClc1 die Sla2-Bindedomäne fehlt. Mittels eines Komplementationstests konnte nachgewiesen werden, dass die Fusion dieser Bindedomäne an das AgCLC1-Gen ausreicht, um die endozytische Funktion von Clathrin in S. cerevisiae wieder herzustellen. In S. cerevisiae führt die Interaktion von Sla2 und Clc1 zu einer verminderten Aktin-Anlagerung an das entstehende Vesikel und dient als Regulationsmechanismus für die Membraneinstülpung. Das Fehlen dieses Mechanismus könnte in A. gossypii die Membraneinstülpung durch vermehrte Aktin-Anlagerung beschleunigen und auf diese Weise zur Anpassung an das schnelle Hyphenwachstum beitragen.

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Es wurde ein System zur chemischen Modifizierung von Einzelcysteinvarianten des PTS- Transporters EIICBGlc etabliert, mit dem durch unterschiedliche Zugänglichkeit von Markersubstanzen die Zuordnung der jeweiligen Cysteine in Hinblick auf die Cytoplasmamembran gelang. Für die Methode war es notwendig, eine cysteinfreies EIICBGlc zu konstruieren. Dieses trägt des Weiteren eine Mutation, die die Phosphorylierung des Substrats Glukose von dem Transport entkoppelt. Dies ist notwendig, da das Cystein 421, das für die Phosphorylierung des WT verantwortlich ist, in dem cysteinfreien Protein nicht mehr vorhanden ist. Die Transportfähigkeit der Mutanten konnte nachgewiesen werden. Die Ergebnisse des Cystein-Scannings, Daten über dieses Protein aus vorangegangenen Arbeiten, sowie ein Vergleich der Struktur des EIIChb aus B. cereus, ermöglichten die Erstellung eines neuen Modells des Proteins EIICBGlc. In diesem Modell enthält das Protein 10 transmembrane Helices. Die postulierte Substratbindetasche wird aus haarnadelartigen Strukturen gebildet. Die Lage funktioneller Mutanten in dem Modell wurde diskutiert. Die entkoppelte Mutation R203H des Proteins EIICBGlc wurde isoliert. Eine Charakterisierung in Bezug auf ihre Fähigkeit Mlc zu titrieren, zeigte, dass eine Bindung von Mlc in diesem Protein möglich ist. Eine Konformationsänderung, die die Wechselwirkung zu Mlc inhibiert, liegt daher in diesem Protein nicht vor. Es wurde außerdem gezeigt, dass keine Erweiterung der Substratspezifität in diesem Protein vorliegt.

As shown in previous studies Streptomyces lividans enzymatically inactivates fusidic acid by specific esterase FusH giving rise to the 16ß-OH derivative, which sponaneously converts to the lactone.in this work it was shown that S. lividans further modifies fusidic acid and both derivatives, which resulted in several new related substances. The two intermediates (La, Lb) were isolated from the culture filtrate of S. lividans, which was grown in the presence of fusidic acid. The differences in their chemical structures indicate the involvement of multiple enzyme reactions related to hydroxylation, hydration, dehydrogenation and isomerization. Several enzymes were identified and two of them (FusG, FusB) were partially characterized. According to their characteristics and the structures of isolated intermediates, the identified enzymes which are involved in biotranformation are conceivably related to the ones implicated in ß oxidation. The biotransformation of fusidic acid and its derivatives by S. lividans is so far unique, since characterized substances La and Lb have not been found in either fusidic acid-producing or fusidic acid-resistant microorganisms.

The essential gene YNL152w was previously found in a screen designed to isolate putative negative regulators of the S. cerevisiae Pkc1p pathway. Activity assays were performed with a lexA-RLM1-lacZ integrated reporter in different ynl152w truncated mutants. In contrast to the original screen, there were no differences or the activities were even lower in some mutants. To analyze the consequences of different expression levels, YNL152w was expressed under the control of the GAL1/10 promoter. Growth curves were performed under high, intermediate and low expression levels. Strikingly, both conditional strains were able to grow under repressing conditions. However, an aberrant morphology was found suggesting that the cells are indeed affected by low amounts of Ynl152w protein. A series of successive Ynl152wp C-terminal truncations was analyzed to determine cell viability and to investigate the function of the protein. Remarkably, about 2/3 of the protein were dispensable to confer viability. Microscopic analyses of constructs revealed an aberrant morphology characteristic of a cytokinesis defective mutant, with the appearance of swollen cells and formation of big aggregates. Interestingly, the phenotype was more pronounced in the larger truncations. Coherent with these results time-lapse experiments with a large truncated mutant showed a stabilization of the SH3 protein Hof1p at the bud neck. This protein is involved in septum formation and has been reported as a binding partner of YNL152w. The phenotypes observed in the truncated mutants could be attributed to the presence of 4 proline rich motifs. Such motifs have been reported to interact with SH3 domains. An internal deletion of an aspartate rich domain present in the Ynl152wp sequence also displayed a phenotype very similar to that of the largest truncations. Therefore, this domain may play an important role in Ynl152wp function.

The yeast cell wall confers shape and integrity and serves as a first barrier against adverse environmental conditions. This thesis provides a first analysis of the cell wall structure of the milk yeast Kluyveromyces lactis and compares it to the one of the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. Transmission electron microscopy revealed that the cell wall of K. lactis is 60 nm thick in glucose-grown cells and increases to 100 nm on ethanol media, whereas S. cerevisiae displays a cell wall thickness of 100 nm under both conditions. The cell wall proteome of K. lactis shares several homologs with the one of S. cerevisiae, but also contains three proteins not found in the latter. Moreover, three of the common cell wall proteins have two isoforms in K. lactis, but only one in S. cerevisiae. The restructuring of the cell wall on different carbon sources (i.e. glucose versus ethanol) indicates a relation between cell wall synthesis and/or remodeling and glucose signaling. Therefore, a key regulator which mediates the glucose response in S. cerevisiae, the SNF1 protein kinase complex, was further investigated. Mutants lacking the kinase activity have a thinner cell wall and show pronounced cell wall phenotypes in S. cerevisiae, i.e. they are hypersensitive to Zymolyase, Congo red, Calcofluor white and to the antifungal agent Caspofungin. Epistasis analyses with mutants affecting cell wall integrity signaling indicate that the SNF1 complex acts in parallel to the CWI pathway, which is induced upon cell wall stress. Immunological detection reveals the phosphorylation of Thr210 in the Snf1 kinase subunit, which is an indication for the activation of the kinase complex. Genetic analyses suggest that the transcriptional repressor Mig1 may be a downstream target mediating the cellular response. Further epistasis analyses with glycolytic mutants indicate that the availability of glucose-6-phosphate influences the cell wall phenotype of snf1Δ mutants. Hence, the role of the SNF1 complex in cell wall integrity is related to the glucose metabolism and glycolytic flux. This work provides the first comprehensive analysis of the role of glucose signaling and the SNF1 complex in yeast cell wall biosynthesis.

Die Anpassung des Zellwachstums eukaryotischer und prokaryotischer Zellen an sich ändernde intra- und extrazelluläre Signale wie Nährstoffverfügbarkeit, Wachstumsfaktoren und dem zellulären Energielevel bedarf eines effektiven Regulationssystems. In Säugern übernimmt der TSC-Komplex als negativer Regulator des TOR-Signalweges eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellwachstums. In S. pombe ist der TSC-Komplex konserviert. Zudem existieren Homologe der Untereinheiten der AMPK, welche in Säugern den TSC-Komplex positiv regulieren. In der vorliegenden Arbeit konnte die Existenz von zwei funktionell getrennten AMPK-Komplexen nachgewiesen werden: AMPK I, bestehend aus Ssp2, SPCC1919.03c und Cbs2 und AMPK II, bestehend aus Ppk9, SPCC1919.03c und Cbs2. Genetische Daten lassen eine Beteiligung von AMPK I an der Regulation der sexuellen Differenzierung, der Adaption an osmotischen Stress und der Verwertung nicht-fermentierbarer Kohlenstoffquellen vermuten. AMPK II scheint für die Adaption an Cadmiumstress wichtig zu sein.In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin die Beteiligung der beiden AMPK alpha-Isoformen am TSC/Rhb1/TOR-Signalweg in S. pombe näher untersucht. Dabei deutete sich an, dass Ppk9 und der TSC-Komplex weder synergistische noch antagonistische Funktionen in der Zelle ausüben. Im Gegensatz dazu scheinen Ssp2 und die TSC-Proteine antagonistische Funktionen auszuüben. Einige Wachstumsdefekte der ssp2 -Deletionsmutanten können durch eine Hyperaktivierung des TSC/Rhb1/TOR-Signalweges supprimiert werden. Die Deletion von ssp2 führt zu einer Suppression des Wachstumsdefektes von Leucin-auxotrophen tsc-Mutanten. Diese Beobachtung erlaubt die Einordnung von Ssp2 in einem zum TSC/Rhb1/TOR-Weg parallelen Signalweg. Im Gegensatz zu Säugern scheinen in S. pombe TSC/Rhb1/TORC1 und Ssp2 einen gemeinsamen Effektor unabhängig voneinander zu regulieren, um verschiedene Wachstumsbedingungen miteinander zu integrieren und das Zellwachstum entsprechend anzupassen.

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Formine sind an einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wie u. a. der Zytokinese, Endozytose oder auch der Vermittlung von Zellpolarität beteiligt, da sie Schlüsselregulatoren des Aktin- und Mikrotubulizytoskeletts sind. Durch carboxyterminale Formin-Homologie (FH)-Domänen wird die Bildung von Aktinfilamenten vermittelt. Unabhängig davon konnte für einige Formine eine Beteiligung an der Mikrotubulidynamik nachgewiesen werden.Das Genom des filamentösen Pilz Ashbya gossypii codiert für die drei Formine: AgBNI1, AgBNR1 und AgBNR2. Im Fokus der Arbeit stand die Aufklärung der molekularen und zellulären Funktion von AgBnr2. Mit biochemischen Versuchen zur molekularen Analyse konnte sowohl die Fähigkeit zur Aktinpolymerisierung, als auch zur Co-Sedimentierung mit Mikrotubuli für die carboxyterminalen FH-Domänen von AgBnr2 gezeigt werden. Mit Hilfe von in vivo Experimenten, wie Mutantenanalyse, Co-Lokalisierungsstudien und Hefe 2-Hybrid Versuchen konnten die Ergebnisse bestätigt werden. Nach der Repression von AgBNR2 in einem Agbnr1 Deletionsstamm konnten Sporulationsdefekte beobachtet werden. Für das Formin AgBnr2 konnte weiterhin die Wechselwirkung und Co-Lokalisierung mit dem Homolog des sporulationsspezifischen Proteins ScSpo21 nachgewiesen werden, was auf eineBeteiligung des Formins an der Sporulation hindeutet. Durch mikroskopische Untersuchungen und in vitro Versuchen mit gereinigten Zellkernen wurde der Nachweis erbracht, dass AgBnr2 während der Sporulation Aktinfilamente am Zellkern polymerisieren kann.Die Ergebnisse enden in dem Modell zur Bnr-vermittelten Verankerung von Aktinfilamenten am Zellkern. Die Filamente dienen während der Sporenbildung möglicherweise dem Transport von Vorläufervesikeln, die u. a. zur Bildung der Prosporenmembran genutzt werden. Dieses Modell scheint innerhalb der Hemiascomyceten Gültigkeit zu besitzen. Ergänzende Versuche mit ScBnr1 aus S. cerevisiae, dem Homolog zu AgBnr2, weisen auf eine konservierte Funktion der Bnr-Formine hin.

Biological tubes possessing a curvilinear form and a hollow interior exist in most multicellular eukaryotes. In Eumetazoa, the tubes usually comprise an eminently complex network and enable the transport and exchange of fluids and gases between tissues and organs, but also between organisms and their environment. Thus, tubular structures are both morphologically and physiologically integral parts of the animals. Based on a genetic screen for novel factors involved in heart tube differentiation and morphogenesis in Drosophila, the identified mutants were subdivided into several classes: cardiac hyperplasia (kuz and mam, both involved in the Notch-dependent cardiomyocyte specification, Publication 1); impaired cytokinesis (pav and tum, both components of the centralspindlin complex); a single ptc mutant showing a “truncated” heart (Publication 2); and a single loss-of-function mutant displaying reduced lumen diameter in epithelial tubes and perturbed secretion of ECM-components. The latter allele was mapped to the gene locus gartenzwerg (garz) that encodes a large ArfGEF. Due to its novelty, garz was selected as a central part of the thesis (Publication 3). Although garz seems to be expressed ubiquitously, its transcripts are abundant in active secreting cells of tubular structures. Moreover, mutations of garz abolish Golgi-integrity, cause massive retention of secretory cargo in the ER and arrest the apical transport of lipids and ECM molecules. As a consequence, lumen of the salivary glands and trachea fail to expand and show a decreased diameter. The observed phenotypes in tracheal network and salivary glands phenocopy those of COPI/COPII-subunits as well as actin-dependent secretion mutants, suggesting the underlying mechanism might be common. Thus, it is supposed that proper tubulogenesis needs Garz for initiation of the Arf1-COPI machinery. Furthermore, Golgi-based post-translational modifications, targeted sorting of vesicles, outward transport of proteins, or directed membrane delivery all depend on the secretory pathway, and such processes are essential in establishing polarized cells which build the tubular structures. In conclusion, this mechanism seems to be neither restricted to tubulogenesis nor specific to Drosophila. Due to the presence of garz homologues in every eukaryotic genomes, the Arf1/COPI based secretory pathway may play a universal role in metazoan development.