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The functionalization of the outer lattice of in vitro reconstituted microtubules has paved the way for the development of diverse nano-device applications. The outer lattice has been metallized for the bottom-up synthesis of nanowires composed of various materials. Moreover, a wide range of biomolecules and nanoprobes have been attached to the outer surface for nano-scale transport and detection assays in conjunction with motor proteins. The functionalization of the outer lattice has certain implications: While the nanowires adopt the overall shape of the microtubules, their surface is inhomogeneous due to the absence of any morphological control. The attachment of cargo on the outer lattice creates a ‘roadblock effect’ hindering the transport activity of the motor proteins as they share a common substrate surface. In this project, the utilization of the hollow interior region of the microtubules, called the lumen (∼15 nm in diameter) is proposed to overcome these limitations. A strategy is developed to functionalize the microtubule lumen by targeting molecular cargo conjugated to lumen-binding (anti-acetyl alpha-tubulin lysine-40) antibodies. This would optimize existing motility-based applications as the outer surface would be exclusively available for the activity of the motor proteins. Furthermore, microtubules functionalized with luminal gold nanoparticle ‘seeds’ are utilized for the lumen-templated assembly of gold nanowires.

Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability. Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome. In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium. / Die Kenntnis der Funktion von Mikrotubuli-assoziierenden Proteinen (MAPs) ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik und deren Regulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Mikrotubuli-assoziierenden Proteins TACC (Transforming acidic coiled-coil), welches in vielen Organismen an der Stabilisierung und dem Wachstum von Mikrotubuli beteiligt ist, im Modellorganismus Dictyostelium discoideum untersucht. Das Dictyostelium TACC Protein konnte während des gesamten Zellzyklus am Centrosom nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde es an den Mikrotubuli-Plus-Enden vorgefunden, überraschenderweise jedoch ausschließlich während der Interphase. Die gleiche Zellzyklusabhängige Lokalisation wurde für CP224 beobachtet, einem Homologen der XMAP215 Proteine in Dictyostelium. Diese ubiquitären MAPs sind konservierte, direkte Interaktionspartner der TACC Proteine und spielen eine zentrale Rolle bei der Nukleation und der Polymerisation von Mikrotubuli. Durch diese Arbeit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass TACC und XMAP215 Proteine während der Interphase und Mitose unterschiedlich stark mit Mikrotubuli-Plus-Enden assoziiert sein können. Durch Untersuchungen an Knockdown-Mutanten wurde ersichtlich, dass Dictyostelium TACC eine Rolle beim Mikrotubuli-Wachstum während der Interphase spielt und über weite Strecken der Mitose essentiell für die Ausbildung von astralen Mikrotubuli ist. In anderen Organismen konnte als Ursache instabiler Mikrotubuli in TACC Mutanten häufig unzureichendes Rekrutieren des jeweiligen XMAP215 Proteins an das Centrosom ausgemacht werden. Um entsprechende Auswirkungen auf die Lokalisation von CP224 durch den Knockdown von TACC in Dictyostelium zu untersuchen, wurden Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Experimente durchgeführt. Diese ergaben, dass CP224 auch in Abwesenheit von TACC in vollem Umfang an die Centrosomen und Spindelpole rekrutiert wird. Anders als im Wildtyp, konnte in TACC Mutanten allerdings kein CP224 an den Mikrotubuli-Plus-Enden nachgewiesen werden. Somit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass ein TACC Protein essentiell für die Assoziation eines XMAP215 Proteins mit den Mikrotubuli-Plus-Enden ist. Im Laufe der genannten Experimente stellte sich heraus, dass sich die GFP-TACC Stämme aufgrund ihrer markierten Plus-Enden sehr gut für Untersuchungen zur ungewöhnlichen Mikrotubuli-Dynamik in Dictyostelium eignen. Zwar weisen Mikrotubuli hier über die gesamte Länge ausgeprägte Krümmungs- und Seitwärtsbewegungen auf, es können jedoch im Vergleich zu anderen Organismen während der Interphase kaum Wachstums- oder Verkürzungsvorgänge beobachtet werden. Dennoch können Dictyostelium Mikrotubuli unter Verwendung von Agenzien wie Thiabendazol oder Nocodazol, welche ausschließlich auf dynamische Mikrotubuli wirken, signifikant verkürzt werden. Durch FRAP Experimente und Einsatz von 5D Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen werden, dass Dictyostelium Mikrotubuli nur in der Zellperipherie, nicht aber im pericentrosomalen Bereich dynamisch sind. Die Identifikation bislang unbekannter Bestandteile des Dictyostelium Centrosoms erfuhr in den vergangenen Jahren große Fortschritte. Ein von unserer Gruppe durchgeführter Proteomics-Ansatz brachte eine Vielzahl potentiell centrosomaler Proteine zu Tage, von welchen bereits viele am Centrosom nachgewiesen werden konnten. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung dreier noch unbekannter Proteine aus dem Proteomics-Ansatz, Cenp68, CP103 und dem Dictyostelium Homologen des Spindle Assembly Checkpunkt Proteins Mad1. Hierbei zeigte sich, dass lediglich CP103 Bestandteil isolierter, Mikrotubuli-freier Centrosomen ist, während Cenp68 an die Centromere und Mad1 an die Kinetochoren lokalisieren. Die Charakterisierung von Cenp68 umfasste außerdem die Herstellung eines polyklonalen anti-Cenp68 Antikörpers, das Suchen nach Interaktionspartnern und die Erzeugung eines Cenp68 Knockout-Stammes. Letzterer wies jedoch keinen offensichtlichen Phänotyp auf. Das Verhalten des Dictyostelium Mad1 Proteins während der Mitose stimmte in großen Teilen mit dem anderer Mad1 Proteine überein, was auf die Existenz eines bislang unerforschten Spindle Assembly Chekpunkts in Dictyostelium hinweisen könnte.

Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden. / The Dictyostelium centrosome consists of a layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. A tight linkage through the nuclear envelope connects the cytosolic centrosome with the clustered centromeres within the nuclear matrix. At G2/M the corona dissociates, and the core structure duplicates yielding two spindle poles. The two proteins CP148 and CP55 were discovered in a proteomic analysis of Dictyostelium centrosomes. CP148 is a novel coiled-coil protein of the centrosomal corona. GFP-CP148 exhibited cell cycle dependent presence and absence at the centrosome, which correlates with dissociation of the corona in prophase and its reformation in late telophase. During telophase, GFP-CP148 formed cytosolic foci, which coalesced and joined the centrosome. This explains the hypertrophic appearance of the corona upon strong overexpression of GFP-CP148. Depletion of CP148 by RNAi caused virtual loss of the corona and disorganization of interphase microtubules. Surprisingly, formation of the mitotic spindle and astral microtubules was unaffected. Thus, microtubule nucleation complexes associate with centrosomal core components through different means during interphase and mitosis. Furthermore, CP148 RNAi caused dispersal of centromeres and altered Sun1 distribution at the nuclear envelope, suggesting a role of CP148 in the linkage between centrosomes and centromeres. Taken together, CP148 is an essential factor for the formation of the centrosomal corona, which in turn is required for centrosome/centromere linkage. As CP148, CP55 was also identified in a centrosomal proteome analysis. It is a component of the centrosomal core structure, and persists at the centrosome throughout the entire cell cycle. FRAP experiments revealed the majority of centrosomal GFP-CP55 is immobile indicating a structural task of CP55 at the centrosome. GFP-CP55 overexpression elicits supernumerary centrosomes containing the usual set of corona and core marker proteins. The CP55 null mutant is characterized by increased ploidy, a less structured, slightly enlarged corona, and by supernumerary, cytosolic MTOCs, containing only corona proteins and lacking a core structure. Live cell imaging showed that supernumerary MTOCs arise in telophase. Lack of CP55 also caused premature recruitment of the corona organizer CP148 to mitotic spindle poles, already in metaphase instead of telophase. Forces transmitted through astral microtubules may expel prematurely acquired or loosely attached corona fragments into the cytosol, where they act as independent MTOCs. CP55null cells were also impaired in growth, most probably due to difficulties in centrosome splitting during prophase. Furthermore, although they were still capable of phagocytosis, they appeared unable to utilize phagocytosed nutrients. This inability may be attributed to their disorganized Golgi apparatus.

Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the main load-bearing structure in plant cell walls. Cellulose microfibrils are laid down in a tight parallel array, surrounding plant cells like a corset. Orientation of microfibrils determines the direction of growth by directing turgor pressure to points of expansion (Somerville et al., 2004). Hence, cellulose deficient mutants usually show cell and organ swelling due to disturbed anisotropic cell expansion (reviewed in Endler and Persson, 2011). How do cellulose microfibrils gain their parallel orientation? First experiments in the 1960s suggested, that cortical microtubules aid the cellulose synthases on their way around the cell (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). This was proofed in 2006 through life cell imaging (Paredez et al., 2006). However, how this guidance was facilitated, remained unknown. Through a combinatory approach, including forward and reverse genetics together with advanced co-expression analysis, we identified pom2 as a cellulose deficient mutant. Map- based cloning revealed that the gene locus of POM2 corresponded to CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1). Intriguingly, we previously found the CSI1 protein to interact with the putative cytosolic part of the primary cellulose synthases in a yeast-two-hybrid screen (Gu et al., 2010). Exhaustive cell biological analysis of the POM2/CSI1 protein allowed to determine its cellular function. Using spinning disc confocal microscopy, we could show that in the absence of POM2/CSI1, cellulose synthase complexes lose their microtubule-dependent trajectories in the plasma membrane. The loss of POM2/CSI1, however does not influence microtubule- dependent delivery of cellulose synthases (Bringmann et al., 2012). Consequently, POM2/CSI1 acts as a bridging protein between active cellulose synthases and cortical microtubules. This thesis summarizes three publications of the author, regarding the identification of proteins that connect cellulose synthases to the cytoskeleton. This involves the development of bioinformatics tools allowing candidate gene prediction through co-expression studies (Mutwil et al., 2009), identification of candidate genes through interaction studies (Gu et al., 2010), and determination of the cellular function of the candidate gene (Bringmann et al., 2012). / Zellulose ist das abundanteste Biopolymer der Erde und verleiht pflanzlichen Zellwänden ihre enorme Tragkraft. Mit der Reißfestigkeit von Stahl umwickeln Zellulosefibrillen pflanzliche Zellwände wie ein Korsett. Die Orientierung der Zellulosefibrillen bestimmt zugleich die Wachstumsrichtung, indem sie den Zellinnendruck (Turgor) in die entsprechende Ausdehnungsrichtung dirigiert (Somerville et al.,2004).Folglich zeigen Mutanten mit gestörter Zellulosesynthese oft geschwollene Organe und Zellen, die sich nicht mehr gerichtet ausdehnen können (zusammengefasst von Endler und Persson,2011). Wie aber erhalten die Zellulosefibrillen ihre parallele Orientierung? Erste Experimente aus den1960ern führten zur Vermutung, kortikale Mikrotubuli leiten die Zellulosesynthasen auf ringförmigen Bahnen um die Zellen herum (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). Diese Theorie wurde 2006 mit Hilfe moderner mikroskopischer Methoden bestätigt (Paredez et al., 2006). Wie jedoch dieser Leitmechanismus funktioniert, blieb bisher unentdeckt. Durch die Kombination verschiedener genetischer und bioinformatischer Methoden, konnten wir pom2 als Zellulose defiziente Mutante identifizieren. Die Ermittlung des Genlocus durch Map-based cloning zeigte, dass es sich bei POM2 um CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1) handelt, ein Gen, dessen korrespondierendes Protein, wie vorher von uns gezeigt, mit dem zytosolischen Teil der primären Zellulosesynthasen interagiert (Gu et al., 2010). Durch ausführliche zellbiologische Charakterisierung von POM2/CSI1 konnten wir seine zelluläre Funktion entschlüsseln. Mit Hilfe konfokaler Spinning- Disc-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass in Abwesenheit von POM2/CSI1, Zellulosesynthasen von den Mikrotubuli- Bahnen abweichen. Der ebenfalls von den Mikrotubuli abhängige Transport der Zellulosesynthasen zur Zellmembran hingegen, war nicht beeinflusst (Bringmann et al., 2012). Demzufolge ist POM2/CSI1 das gesuchte Bindeglied zwischen aktiven Zellulosesynthasen und Mikrotubuli. In dieser Dissertationsschrift werden drei Publikationen des Autors zusammengefasst, die wa ̈hrend der Arbeit an der Dissertiation entstanden sind. Sie beinhalten die Entwicklung bioinformatischer Methoden zur Ko- Expressionsanalyse, um Kandidatengene zu ermitteln (Mutwil et al., 2009), die Identifikaton des Kandidatengens POM2/CSI1 in einer Interaktionsstudie (Gu et al., 2010), sowie die Bestimmung der zellula ̈ren Funktion des korrespondieren- den Proteins POM2/CSI1 (Bringmann et al., 2012).

Sensory-motile cells fulfill various biological functions ranging from immune activity or wound healing to the formation of the highly complex nervous systems of vertebrates. In the case of neurons, a dynamic structure at the tip of outgrowing processes navigates towards target cells or areas during the generation of neural networks. These fan shaped growth cones are equipped with a highly complex molecular machinery able to detect various external stimuli and to translate them into directed motion. Receptor and adhesion molecules trigger signaling cascades that regulate the dynamics of an internal polymeric scaffold, the cytoskeleton. It plays a crucial role in morphology maintenance as well as in the generation and distribution of growth cone forces. The two major components, actin and microtubules (MTs) connect on multiple levels through interwoven biochemical and mechanical interactions. Actin monomers assemble into semiflexible filaments (F-actin) which in turn are either arranged in entangled networks in the flat outer region of the growth cone (lamellipodium) or in radial bundles termed filopodia. The dynamic network of actin filaments extends through polymerization at the front edge of the lamellipodium and is simultaneously moving towards the center (C-domain) of the growth cone. This retrograde flow (RF) of the actin network is driven by the polymerizing filaments themselves pushing against the cell membrane and the contractile activity of motor proteins (myosins), mainly in the more central transition zone (T-zone). Through transmembrane adhesion molecules, a fraction of the retrograde flow forces is mechanically transmitted to the cellular substrate in a clutch-like mechanism generating traction and moving the GC forward. MTs are tubular polymeric structures assembled from two types of tubulin protein subunits. They are densely bundled in the neurite and at the growth cone “neck” (where the neurite opens out into the growth cone) they splay apart entering the C-domain and more peripheral regions (P-domain). Their advancement is driven by polymerization and dynein motor protein activity. The two subsystems, an extending array of MTs and the centripetal moving actin network are antagonistic players regulating GC morphology and motility. Numerous experimental findings suggest that MTs pushing from the rear interact with actin structures and contribute to GC advancement. Nevertheless, the amount of force generated or transmitted through these rigid structures has not been investigated yet. In the present dissertation, the deformation of MTs under the influence of intracellular load is analyzed with fluorescence microscopy techniques to estimate these forces. RF mechanically couples to MTs in the GC periphery through friction and molecular cross-linkers. This leads to MT buckling which in turn allows the calculation of the underlying force. It turns out that forces of at least act on individual MT filaments in the GC periphery. Compared to the relatively low overall protrusion force of neuronal GCs, this is a substantial contribution. Interestingly, two populations of MTs buckle under different loads suggesting different buckling conditions. These could be ascribed to either the length-dependent flexural rigidity of MTs or local variations in the mechanical properties of the lamellipodial actin network. Furthermore, the relation between MT deformation levels and GC morphology and advancement was investigated. A clear trend evolves that links higher MT deformation in certain areas to their advancement. Interactions between RF and MTs also influence flow velocity and MT deformation. It is shown that transient RF bursts are related to higher MT deformation in the same region. An internal molecular clutch mechanism is proposed that links MT deformation to GC advancement. When focusing on GC dynamics it is often neglected that the retraction of neurites and the controlled collapse of GCs are as important for proper neural network formation as oriented outgrowth. Since erroneous connections can cause equally severe malfunctions as missing ones, the pruning of aberrant processes or the transient stalling of outgrowth at pivotal locations are common events in neuronal growth. To date, mainly short term pausing with minor cytoskeletal rearrangements or the full detachment and retraction of neurite segments were described. It is likely that these two variants do not cover the full range of possible events during neuronal pathfinding and that pausing on intermediate time scales is an appropriate means to avoid the misdetection of faint or ambiguous external signals. In the NG108-15 neuroblastoma cells investigated here, a novel type of collapse was observed. It is characterized by the degradation of actin network structures in the periphery while radial filopodia and the C-domain persist. Actin bundles in filopodia are segmented at one or multiple breaking points and subsequently fold onto the edge of the C-domain where they form an actin-rich barrier blocking MT extension. Due to this characteristic, this type of collapse was termed fold collapse. Possible molecular players responsible for this remarkable process are discussed. Throughout fold collapse, GC C-domain area and position remain stable and only the turnover of peripheral actin structures is abolished. At the same time, MT driven neurite elongation is hindered, causing the GC to stall on a time scale of several to tens of minutes. In many cases, new lamellipodial structures emerge after some time, indicating the transient nature of this collapse variant. From the detailed description of the cytoskeletal dynamics during collapse a working model including substrate contacts and contractile actin-myosin activity is derived. Within this model, the known and newly found types of GC collapse and retraction can be reduced to variations in local adhesion and motor protein activity. Altogether the results of this work indicate a more prominent role of forward directed MT-based forces in neuronal growth than previously assumed. Their regulation and distribution during outgrowth has significant impact on neurite orientation and advancement. The deformation of MT filaments is closely related to retrograde actin flow which in turn is a regulator of edge protrusion. For the stalling of GCs it is not only required that actin dynamics are decoupled from the environment but also that MT pushing is suppressed. In the case of fold collapse, this is achieved through a robust barrier assembled from filopodial actin bundles.

Microtubules are cytoskeletal protein polymers relevant to a wide range of cell functions. In order to polymerize, the constituent tubulin subunits need to bind the nucleotide GTP, but its subsequent hydrolysis to GDP in the microtubule lattice induces depolymerization. The resulting behaviour of stochastic switching between growth and shrinkage is called dynamic instability. Both dynamic instability and microtubule mechanical properties are integral to many cell functions, yet are poorly understood. The present study uses thermal fluctuation measurements of grafted microtubules with different nucleotide contents to extract stiffnesses, relaxation times, and drag coefficients with an unprecedented precision. Both the stiffness and the relaxation time data indicate that stiffness is a function of length for GDP microtubules stabilized with the chemotherapy drug taxol. By contrast, measurements on microtubules polymerized with the non-hydrolizable GTP-analogue GMPCPP show a significantly higher, but constant, stiffness. The addition of taxol is shown to not significantly affect the properties of these microtubules, but a lowering of the GMPCPP content restores the length-dependent stiffness seen for taxol microtubules. The data are interpreted on the basis of a recent biopolymer model that takes into account the anisotropic architecture of microtubules which consist of loosely coupled protofilaments arranged in a tube. Using taxol microtubules and GMPCPP microtubules as the respective analogues of the GDP and GTP state of microtubules, evidence is presented that shear coupling between neighbouring protofilaments is at least two orders of magnitude stiffer in the GTP state than in the GDP state. Previous studies of nucleotide effects on tubulin have focussed on protofilament bending, and the present study is the first to be able to show a dramatic effect on interprotofilament bonds. The finding’s profound implications for dynamic instability are discussed. In addition, internal friction is found to dominate over hydrodynamic drag for microtubules shorter than ∼ 4 μm and, like stiffness, to be affected by the bound nucleotide, but not by taxol. Furthermore, the thermal shape fluctuations of free microtubules are imaged, and the intrinsic curvatures of microtubules are shown for the first time to follow a spectrum reminiscent of thermal bending. Regarding the extraction of mechanical data, this assay, though previously described in the literature, is shown to suffer from systematic flaws.

A major challenge in nanotechnology is the spatially controlled transport of cargo on the nanometer scale. The use of a nanoscale transport system based on molecular motors and filaments of the cytoskeleton proved as a promising approach to this problem. Therefore, the objective of this work was to pattern planar surfaces with motor proteins in a way that allows controlled and guided movement of microtubule-shuttles. The first part of the work was in particular focused on generating nanometer–sized tracks of motor proteins on unstructured surfaces. Specifically, microtubules themselves were used as biological templates for the stamping and alignment of motor proteins. Compared to other soft lithography techniques like microcontact printing this approach circumvented protein denaturation due to drying and conformational changes caused by mechanical stress. Given the large persistence length of microtubules their encounters with the boundaries of the nanotracks are limited to shallow approach angles. This way, the generated structures proved very efficient for the guiding of microtubules without topographical barriers. Topography-free guiding, as demonstrated in this work, is expected to significantly ease the design and fabrication of microtubule-transport systems and opens up the possibility to transport cargo of unlimited size, i.e. without any constraints by the dimensions of topographic guiding channels. Moreover, the biotemplated patterning is a promising tool for in vitro studies on the individual and cooperative action of motor proteins. In particular it might be helpful for the reconstitution of complex subcellular machineries in synthetic environments. As an example, microtubule-microtubule sliding by the biomolecular motor ncd has been shown to induce directional sliding between antiparallel microtubules and static cross-linking between parallel ones. The second part of the work explored an in-situ patterning technique for motor proteins to enable user-defined pattern designs, and investigated the achievable resolution. Photothermal patterning, based on localized light-to-heat conversion combined with a thermoresponsive polymer layer, was presented as a novel method. Specifically, the conformation of poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) molecules in aqueous solution was switched between the swollen state at T < 30°C (protein-repelling conformation) to the collapsed state at T > 33°C (protein-binding conformation) by optical signals of visible light to generate heat in a highly-localized manner. Upon heating of a light-absorbing layer on the substrate, the surface-grafted PNIPAM molecules collapsed locally and allowed motor proteins in solution to bind in the illuminated areas. To confirm the successful patterning of kinesin-1 molecules and their functionality microtubule-based gliding motility assays were performed. It was shown that the microtubules bind to the patterned kinesin-1 molecules and are transported exclusively in the patterned areas. While the achieved pattern sizes were currently in the range of ten micrometers, finite element modeling (implemented in COMSOL) showed that increased optical intensities possibly combined with cooling of the sample allow to significantly scale down the pattern dimensions. The produced patterns can be reversibly activated and deactivated at high and low temperature, respectively. Moreover, sequential patterning of multiple kinds of proteins on the same surface will be possible in a similar way without the need for specific linker molecules or elaborate surface preparation. Another advantage of the method is the use of visible light, which is versatile as any wavelength can be applied. In addition visible light is in comparison to other UV-based photopatterning techniques non-damaging to proteins. / Der räumlich kontrollierte Transport von nanoskaligen Objekten ist eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie. Ein auf molekularen Motoren und Filamenten des Zellskeletts basierendes Nanotransportsystem hat sich dabei als ein viel versprechender Ansatz erwiesen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es daher, ebene Oberflächen so mit Motorproteinen zu strukturieren, dass eine kontrollierte und geführte Bewegung von Mikrotubuli-Transportern ermöglicht wird. Der erste Teil der Arbeit war insbesondere darauf fokussiert, Motorprotein-Spuren im Nanometerbereich zu erzeugen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Strukturierungsmethode zur Realisierung von benutzerdefinierten Musterdesigns untersucht und die erreichbare Auflösung bestimmt. Für die Nanometerstrukturierung von Oberflächen mit funktionalen Motorproteinen wurde ein neuer Ansatz demonstriert. Mit der Anwendung von Biotemplaten, wie hier der Mikrotubuli, konnte ein hoch-lokalisiertes und orientiertes Anbinden von Proteinen an Oberflächen sowie gleichzeitig geringer Proteindenaturierung erreicht werden. Durch spezifisches Stempeln beziehungsweise Binden von Motoren wurden Muster aus funktionellen Proteinen mit hoher Oberflächendichte hergestellt. Die erzeugten Motor-Spuren haben gezeigt, dass Nanometerstrukturierungen möglich sind und ohne topographische Barrieren zu zuverlässiger Führung von Mikrotubuli führen können. Bisher konnte die nicht-topographische Strukturierung von Oberflächen mit Kinesin-1-Motoren nur im Mikrometerbereich demonstriert werden. Wegen der hohen Steifigkeit der Mikrotubuli war die thermische Energie des Systems in diesen Fällen nicht ausreichend, um die führende Spitze der Mikrotubuli zurück auf das Gebiet mit den strukturierten Motoren zu biegen. Dieses Problem wird durch die kleine Breite der hier demonstrierten Motor-Nanospuren verhindert, da das Auftreffen der Mikrotubuli mit den Grenzlinien auf extrem flache Winkel begrenzt ist. Interessanterweise haben sich Spuren des nicht-prozessiven Motors Kinesin-14 für das Führen und den Transport im Nanometerbereich als noch zuverlässiger herausgestellt als Kinesin-1-Spuren. Es ist zu erwarten, dass nicht-topographisches Führen, wie es in dieser Arbeit gezeigt wurde, das Design und die Herstellung von Mikrotubuli-Transportsystemen deutlich vereinfacht und die Möglichkeit eröffnet, Cargo mit unlimitierter Größe, d.h. ohne Einschränkungen durch die Abmessungen der topographischen Führungskanäle, zu transportieren. Zusätzlich ist die biotemplierte Strukturierung ein viel versprechendes Werkzeug um das individuelle und das kooperative Arbeiten von Motorproteinen in vitro untersuchen und komplexe subzelluläre Maschinerien in synthetischer Umgebung rekonstituieren zu können. Dies wurde am Beispiel des gerichteten Gleitens des biomolekularen Motors Kinesin-14 gezeigt, der ein gerichtetes Gleiten zwischen antiparallelen Mikrotubuli und statisches Vernetzen zwischen parallelen Mikrotubuli hervorruft. Mit dem Ansatz des biotemplierten Strukturierens ist es jedoch nicht einfach möglich, benutzerdefinierte Spuren zu erzeugen. Daher wurde die photothermische Proteinstrukturierung als eine neue Methode für die frei programmierbare, hochauflösende und schnelle Herstellung von strukturierten Proteinoberflächen eingeführt. Auf diese Weise wurden Kinesin-1-Muster durch licht-induziertes Heizen einer licht-absorbierenden Substratschicht erzeugt. Die thermisch schaltbaren poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM) Moleküle auf der Oberfläche kollabierten lokal und erlaubten es den Motorproteinen, in den beleuchteten Gebieten aus der Lösung an die Oberfläche zu binden. Die Bewegung gleitender Mikrotubuli bestätigte anschließend die erfolgreiche Strukturierung der Kinesin-1-Motoren und deren Funktionalität, da die Mikrotubuli an die strukturierten Motoren banden und ausschließlich in den strukturierten Gebieten transportiert wurden. Neben der Proteinstrukturierung wurde die lokalisierte Licht-zu-Wärme-Umwandlung kombiniert mit einer thermisch schaltbaren Polymerschicht auch für die lokale Aktivierung von Kinesin-1-Motoren auf der Oberfläche genutzt. Ein Vorteil der photothermischen Proteinstrukturierung ist die Möglichkeit, sichtbares Licht zu verwenden, da jede beliebige Wellenlänge angewendet werden kann und sichtbares Licht, im Vergleich zu anderen UV-basierten Photostrukturierungsmethoden, Proteine nicht schädigt. Modellierungen mit Hilfe der Finite-Elemente-Methode (implementiert in der Software COMSOL) haben gezeigt, dass die Lichtintensität und die Oberflächentemperatur speziell eingestellt werden müssen, um definierte Strukturgrößen zu erzielen. Während die derzeitig erzeugten Muster Größen im Bereich von zehn Mikrometern hatten, könnten durch höhere optische Intensitäten kombiniert mit Kühlung der Probe die Größenordnungen signifikant reduziert werden. Die reale experimentelle Auflösung wird jedoch auch von der Schaltcharakteristik des Polymers und der Proteinbindungsdynamik abhängen. Die hergestellten Muster können reversibel bei hohen beziehungsweise niedrigen Temperaturen aktiviert und deaktiviert werden. Zusätzlich können auf die gleiche Weise verschiedene Proteinsorten sequentiell auf einer Oberfläche strukturiert werden, ohne dass spezifische Bindungsmoleküle oder aufwändige Oberflächenpräparationen notwendig wären. Die Möglichkeit, Proteine reversibel an die Oberfläche zu binden, um geschriebene Muster wieder löschen zu können, wäre eine Weiterentwicklung und würde die Anwendungsmöglichkeiten der photothermischen Strukturierungsmethode erweitern. Außerdem würden optisch schaltbare Polymere das direkte Strukturieren von Motoren mit Licht ermöglichen und daher die Methode vereinfachen.

Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden. / The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.

Die vorliegende Doktorarbeit stammt aus (ist in) dem Bereich der NanoBioTechnologie. Ihr Ziel ist es, das Motorprotein Kinesin und Mikrotubuli einzusetzen, um DNS-Moleküle in einem synthetischen Umgebung zu manipulieren. Diese Doktorarbeit setzt sich aus fünf Kapiteln zusammen. In der Einführung wird die makromolekulare Struktur der Zelle beschrieben, z.B. das Zytoskelett und Kinesin, eins der Motorproteine, die auf Mikrotubuli entlang laufen können. Der Schwerpunkt dieses Kapitels liegt auf der Nützlichkeit biologischer Motoren für den Aufbau und die Organisation von Strukturen im technischen Umfeld. Das zweite Kapitel zeigt, wie Kinesin und Mikrotubulis in einem synthetischen Umfeld für den Transport verschiedener Frachten, z.B. Streptavidin, Quantum dots oder DNS-Molekülen, genutzt werden können. Hier liegt der Schwerpunkt auf der Manipulation der DNS-Moleküle durch motor-gesteuerte Mikrotubulis und wie dieser Fracht-Transport-Mechanismus prinzipiell als Basis für die Entwicklung neuer Konzepte im Bereich des Bioingenieurwesens dienen kann. Ein Beispiel für ein solches Konzept ist die auf DNS basierende Molekularelektronik, bei der die Bindung und Streckung von DNS-Molekülen zwischen leitfähigen Oberflächen notwendig ist. Das dritte Kapitel beschreibt den Einfluß der Oberflächeneigenschaften auf die DNS-Anbindung. Es bietet Antworten darauf, wie diese Eigenschaften erforscht, spezifisch gestaltet und vorbereitet werden können, so daß sie der wissenschaftlichen Zielsetzung angemessen sind. Auf die Betrachtung von komplexen Musteranordnungen, wie sie in der Nanoelektronik genutzt werden können, wird im vierten Kapitel eingegangen. Hier wird auf praktische Art und Weise deutlich gemacht, wie DNS-Moleküle an leitfähige Oberflächen gebunden und dort durch Motorproteine und Mikrotubulis manipuliert werden können. Die Vorteile der motor-basierten Manipulation gegenüber den konventionellen Methoden wie AFM oder der optischen Pinzette werden diskutiert. Das fünfte und letzte Kapitel zeigt, wie man das Kinesin-Mikrotubuli-System nutzen kann, um daraus Informationen über DNS-Moleküle abzuleiten. Dafür wurde das Verhalten der Mikrotubulis in Beziehung auf die von gebundenen DNS-Molekülen ausgeübten Kräfte untersucht. Zusammenfassend habe ich experimentelle Untersuchungen und Färbeprotokolle entwickelt, um den gesamten Manipulationsprozeß zu detektieren, visualisieren und kontrollieren. Weiterhin untersuchte ich seine Implikationen auf theoretische Analysen, sowie auf praktische Anwendungen im Nano-Ingenieurwesen. Meine Daten demonstrieren, das DNS-Moleküle im synthetischen Umfeld so manipuliert werden können, daß kontrollierte DNS-Bioschnittstellen entstehen; Schnittstellen, die sowohl für weitere nanoelektronische Anwendungen als auch für topologische DNS-Studien genutzt werden können. Es wird weiterhin erwartet, daß das Kinesin-Mikrotubuli-System für die 3D-Anordnung auf biomolekularer Ebene im technischen Umfeld eine ebenso wichtige Rolle spielen wird. Die Fähigkeit, Vorlagen von Biomolekülen und/oder Anordungen mit definierten Eigenschaften zu schaffen und gleichzeitig ihre biologische Aktivität zu erhalten, kann als Beweis dienen, daß biologische Motoren für die molekulare Fertigung genutzt werden können. - (Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. IX - XIII) / The work described in this thesis is in the field of NanoBioTechnology. Its goal is to leverage the motor protein kinesin and its microtubule track to manipulate DNA molecules in synthetic environment. This thesis contains five chapters. The first chapter describes macromolecular structures of the cell: i. e. the cytoskeleton and one of the motor proteins that move along it, kinesin. Emphasized is how biological motors might prove useful for organizing structures in engineered environments. The second chapter demonstrates how kinesin and microtubules can be used in synthetic environments to transport different cargos: i.e. streptavidin, quantum dots and DNA molecules. Special emphasis is placed on the manipulation of DNA molecules by the motor-driven microtubules. This cargo transport mechanism serves as a proof-of-principle for new bioengineering concepts such as DNA-based molecular electronics. The third chapter describes the influences of the surface properties on the DNA attachment and offers answers as how surface characteristics can be investigated, specifically designed and prepared so that they can serve the desired scientific purpose. The fourth chapter describes the manner in which DNA molecules can be attached to conductive surfaces and manipulated with motor proteins and microtubules. The complex DNA pattern formation that can be used for nanoelectronics is demonstrated. The advantages of motor-based manipulation over the conventional "one-by-one" methods (AFM, optical tweezers etc.) are discussed. The fifth and last chapter shows how one can use the kinesin-microtubule system to derive information about DNA molecules. For this, the response of the microtubules to forces exerted by attached DNA molecules has been studied. In summary, I have generated experimental assays and staining procedures to detect, visualize and control the entire manipulation process and to investigate its implications for theoretical analysis as well as for practical nano-engineered applications. My data demonstrated that DNA molecules can be manipulated in synthetic environment by kinesin and microtubules in such a way that controlled DNA biointerfaces can be generated. These biointerfaces can then be used for nanoelectronical application as well as for DNA topological studies. The kinesin-microtubule system is also expected to be equally important for 3D biomolecular assembly in engineered environments. The ability to generate templates of biomolecules and/or bioassemblies with well-defined features while maintaining their bioactivity, serves as proof-of-principle that biological motors can be used for molecular manufacturing. - (The pressure copies contain in each case a CD-ROM as component: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- To overview of contents see thesis P. IX - XIII)