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Univ., Diss.--Münster, 1998.

Thesis (doctoral)--Lausanne, 1979.

University, Diss., 2005--Würzburg.

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The effect of menthol on nicotine metabolism was examined in liver S9 fractions of four different species and in the in vivo mouse model. The purpose of this study was to investigate three parameters: (1) biotransformation of nicotine to cotinine in various species (human, mouse, rat and trout) using in vitro methods; (2) to determine if the addition of menthol with nicotine altered biotransformation of nicotine to cotinine; (3) and to assess similar parameters in an in vivo mouse model. The major findings of this study include: (1) mice appear to metabolize nicotine, over time, in a manner similar to humans; (2) menthol decreased cotinine production, over time, after a single dose in mice; and (3) menthol increased cotinine production, over time, after repeated doses, in mice.

This thesis investigates the biosynthesis of the tropane alkaloid hyoscyamine in Datura stramonium. The biosynthesis of the medicinally important tropane alkaloid hyoscyamine has been investigated for many years. However, the complete biosynthetic pathway is still to be unravelled. This thesis concentrates primarily on the last step of hyoscyamine biosynthesis - the rearrangement of littorine to hyoscyamine. In Chapter 1, an introduction to the biosynthesis of hyoscyamine and other related alkaloids is discussed. In Chapter 2, (^18)O-labelling studies are utilised in order to probe the nature of the rearrangement. The results reveal that intriguingly that the rearrangement is uidirect and perhaps involves an aldehyde intermediate, which requires to be reduced by a dehydrogenase to furnish hyoscyamine. In Chapter 3, aryl substituted fluorophenyllactates were used in order to probe the mechanism of the rearrangement of littorine to hyoscyamine. The working hypothesis suggests the involvement of a carbocation uitermediate following literature reports on chemical and enzymatic models. The results reveal that the mechanism of the rearrangement is not as clear cut as predicted, and that perhaps binding affinities to the littorine synthase and littorine mutase affect the efficiency of the rearrangement. In Chapter 4, attention turned back to the tropane moiety of hyoscyamine. Its biosynthesis has been thoroughly investigated although there still remains the mystery as to how acetate units are condensed with the N-methylpyrrolinium salt to generate the bicyclic tropane ring.

The biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane was investigated in rats and in in vitro systems. First, the metabolites were identified in vivo using GC/MS and 19F NMR analysis. The main metabolite was identified as trifluoroacetic acid, the minor metabolite as 3,3,3-trifluoropropionic acid and as a cleavage product, inorganic fluoride was found. As the in vitro system, liver microsomes from rat and human samples and rat liver homogenates were used. Trifluoroacetic acid and 3,3,3 trifluoropropionic acid were confirmed in vitro as metabolic intermediates, following biotransformation of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane by the cytochrome P-450-system. Studies, designed for clarifying the cardiotoxicity of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane were driven by the hypothesis that 3,3,3-trifluoropropionic acid is the toxic agent. This was based on the lethal toxicity, which was observed in previous in vivo experiments. In addition, the point of its structural similarity to toxic agents as for example monofluoroacetic acid or of possible metabolic intermediates like difluoroacrylic acid with known toxicity were considered to support this assumption. However, trifluoroacetic acid was neglected as the sought-after toxic agent because of its different toxic effects, known from literature. Investigations on the biotransformation of 3,3,3-trifluoropropionic acid were performed and resulted in no metabolic activity and in poor elimination of 3,3,3-trifluoropropionic acid in vivo. The histopathological effects on the heart, which were observed in the 90-day oral toxicity study of 1,1,1,3,3-pentafluoropropane in rats, namely mononuclear inflammatory cell infiltrations and degenerated myocardial fibers, were not observed after a 28 day repeated exposure of up to 10 mg/kg b.w. of 3,3,3-trifluoropropionic acid. However, a single high dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid lead to severe toxicological effects. The difference in the observed toxic effects after a single and repeated administration may be due to adaptive mechanisms in rats. The toxicological effects included clinical signs like ataxia, coma and cramps. The conditions of the rats suggested possible inhibition of the energy supply to the organism. Furthermore, the interference of 3,3,3-trifluoropropionic acid in the functionality of the organism was investigated. Experiments were performed in vitro in rat liver and heart mitochondria to investigate effects on the mitochondrial ß-oxidation. However, the transformation of the substrate [U14C] palmitic acid in the ß oxidation pathway was not inhibited by 3,3,3-trifluoropropionic acid. In addition, no cytotoxicity of 3,3,3 trifluoropropionic acid was observed in the cell culture systems. The main effect after a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid was seen in clinical pathology and metabonomic analysis. The decrease in blood glucose is considered to have the most far-reaching consequences for the toxicity of 3,3,3-trifluoropropionic acid. If considering this change as the primary effect after a single dose, secondary effects, for example, the above-mentioned clinical signs could be explained. In addition, the observed high level of ketone bodies might have been responsible for life-threatening possible ketoacidosis. In general, ketoacidosis occurs after an imbalance between glycolysis, lipolysis, TCA cycle activity and respiratory function. Based on the results, ß-oxidation of fatty acids was not affected, and due to the decrease in glucose levels and the high levels of acetyl CoA, glycolysis was considered not to be impaired. Increased amounts of acetyl CoA might be a result of insufficient activity of the TCA cycle. However, the inhibition of the TCA cycle can be based on the impairment of specific enzymes and/or on the involvement of messenger substrates like insulin. Supporting the first mentioned aspect are decreased levels of TCA cycle intermediates, like α-ketoglutarate or citrate, as seen in 1H-NMR spectra of urine. However, the second aspect would explain the drop in blood glucose with the impairment of glucose transporters or the impairment of the insulin balance. If a single dose of 3,3,3-trifluoropropionic acid had stimulated the insulin release, glycolysis would be activated, and high amounts of acetyl CoA would be produced. In case of impaired use by the TCA cycle, levels of ketone bodies would be increased. Experiments were designed to characterize the direct effect of 3,3,3-trifluoropropionic acid on rat insulinoma-derived INS-1 cells as possible increase in insulin release. Further investigations are necessary to answer in which step of the metabolic pathway 3,3,3-trifluoropropionic acid interferes or finally which specific enzyme is inhibited or activated by 3,3,3-trifluoropropionic acid, leading to the drop in blood glucose and finally in lethal toxicity. / Die Biotransformation von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan wurde in Ratten und in in vitro Systemen untersucht. Die in der Ratte mit dem Urin ausgeschiedenen Metabolite wurden per GC/MS und 19F-NMR identifiziert. Als Hauptmetabolit entstand Trifluoressigsäure, als Nebenmetabolit 3,3,3-Trifluorpropionsäure und als Abspaltungsprodukt Fluorid. Als in in vitro Systeme wurden Ratten- und Humanleber-mikrosomen, sowie Rattenleberhomogenate verwendet. Auch hier wurden Trifluoressigsäure und 3,3,3-Trifluorpropionsäure als metabolische Zwischenprodukte identifiziert. Weitere in vivo Studien wurden durchgeführt um die beobachtete subchronische Kardiotoxizität von 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan zu erklären. Da vorangegangene Experimente eine hohe letale Toxizität des Metaboliten 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten, wurde dieser als das toxische Agens hypothetisiert. Diese Annahme unterstützend, ist dessen strukturelle Ähnlichkeit zu Substanzen mit bekannten toxischen Profilen wie Monofluoressigsäure oder Difluoracrylsäure, ein mögliches entstehendes Intermediat. Der Hauptmetabolit Trifluoressigsäure jedoch, wurde auf Grund seiner bekannten Toxizität als initiierendes Agens der Kardiotoxizität ausgeschlossen. In vivo Untersuchungen mit 3,3,3-Trifluorpropionsäure zeigten jedoch keine weitere metabolische Aktivität und eine geringe renale Ausscheidung an 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Nach einer einmalig hohen Dosis von 3,3,3-Trifluorpropionsäure traten markante Symptome wie Ataxie, komatöse Zustände und Krämpfe auf. Dies deutete auf eine Beeinträchtigung des Energiezustandes des Organismus hin. Die histo-pathologischen Veränderungen des Herzens, mononukleäre Infiltrate von Entzündungszellen und degenerierte Myokard-Fasern, die für 1,1,1,3,3-Pentafluorpropan in einer 90-Tages Studie in Nagern beobachtet wurden, konnten jedoch nicht nach 28-tägiger Exposition mit 10 mg/kg Körpergewicht 3,3,3-Trifluorpropionsäure beobachtet werden. Die unterschiedlichen Effekte die nach einmaliger und wiederholter Gabe beobachtet wurden, lassen sich durch mögliche Adaptionsprozesse erklären, die initiale Schädigungen kompensieren. Die folgenden Experimente waren auf die funktionelle Beeinflussung des Organismus durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure ausgerichtet. In vitro Untersuchungen in Mitochondrien von Rattenleber und –herz mit dem Umsatz des Modellsubstrates [U14C] Palmitinsäure zeigten jedoch keine Inhibierung der ß-Oxidation durch 3,3,3-Trifluorpropionsäure. Zytotoxizitätsassays wurden im Weiteren in der human-hepatonom Zell-Linie HepG2, und in der kardialen Muskelzell-Linie H9C2 mit folgenden Endpunkten durchgeführt: die Freisetzung von LDH, ein Parameter für die Membranintegrität, die MTT Reduktase Aktivität, ein Parameter für die metabolische Aktivität, und die Messung von Kristallviolett, ein Parameter für die Viabilität von Zellen. Für 3,3,3-Trifluorpropionsäure konnte jedoch keine Zytotoxizität beobachtet werden. Deutliche Effekte wurden hingegen in der klinischen Pathologie und anhand Metabonomics beobachtet. Diese bestanden vor allem in der Abnahme der Glukosekonzentration im Blut, das weitreichende Konsequenzen mit sich führt, und als primärer Effekt die sekundären Effekte wie die beobachtenden klinischen Symptome erklären könnte. Ein weiterer Schlüsselparameter war die Erhöhung von Ketonkörpern in Urin und Serum, welche für eine lebensbedrohliche mögliche Ketoazidosis verantwortlich sein kann und durch ein Ungleichgewicht im Energiehaushalt ausgelöst werden kann. Da eine Beeinträchtigung der ß Oxidation und der Glykolyse ausgeschlossen wurde, könnte das erhöhte Vorkommen von Acetyl-CoA auf eine limitierte Aktivität des Zitronensäurezyklus hindeuten. Grund hierfür kann die Inhibierung von beteiligten Enzymen sein oder auch der Einfluß von Messenger-Substraten wie Insulin. Ersteres wurde untermauert mit der Beobachtung in 1H NMR Spektren von Urin mit erhöhten Mengen an Intermediaten des Zitronensäurezyklus, wie α Ketoglutarate oder Zitrat. Letzteres würde den Abfall der Blutglukose, basierend auf Beeinflussung von Glukosetransportern oder des Insulinhaushaltes, erklären. Wenn 3,3,3-Trifluorpropionsäure die Freisetzung von Insulin stimulieren würde, würde der Abbau von Glukose aktiviert werden und erhöhte Mengen an Acetyl-CoA resultieren. Wenn gleichzeitig eine Beeinträchtigung des Zitronensäurezyklus vorliegt, kann dies zu einer Erhöhung an Ketonkörpern führen. Experimente zur Messung des Insulin- und Glukosespiegels wurden in vivo und in vitro mit der Ratteninsulinoma Zell-Linie INS-1 durchgeführt, um den Effekt von 3,3,3-Trifluorpropionsäure auf die Freisetzung von Insulin zu charakterisieren. Basierend auf diesen Ergebnissen sind weitere Untersuchungen erforderlich um den Metabolismus von 3,3,3-Trifluorpropionsäure, sowie dessen mögliche Interaktion mit Enzymen oder Rezeptoren aufzuklären, und um den raschen Glukoseabfall im Blut zu erklären, der zu einer letalen Toxizität führen kann