Drosophila insulin like peptides (DILPs) and their human homolog insulin act as messengers to control many physiological processes in the body. Fields in which insulin signaling is crucial are e.g. growth, stress responses and aging. Consequently, many diseases are caused by disturbed insulin signaling, of which diabetes is the most prominent. During the last decades the functions of insulins and their signaling pathways have been studied in detail; what remains less well understood is how the production of insulin and insulin like peptides is regulated. The family of Neprilysins (Neps) belongs to the M13-zinc ion binding metallopeptidases. Neprilysins cleave peptides that regulate a wide range of cellular processes and are therefore linked to a variety of diseases like cancer, analgesia, hypertension or Alzheimer’s disease. In the fruit fly Drosophila melanogaster, five Neprilysins are expressed; but their in vivo substrates have not yet been identified. One of the Drosophila Neprilysins, Nep4, is expressed in the CNS, in muscle tissue, in cardiac tissue and in male reproductive organs. Nep4 is expressed in two isoforms, Nep4A and Nep4B. Isoform A is composed of a short intracellular domain, a transmembrane domain and a large extracellular domain containing the catalytically active center, whereas soluble Nep4B only consists of the extracellular domain. This thesis reveals that overexpression of catalytically active Nep4A in muscle tissue leads to animals with impaired insulin expression, decreased size and weight, affected feeding behavior and reduced locomotion speed. Further phenotypes are an impaired energy metabolism and larval lethality. Knockdown of the whole enzyme or knockout of its catalytic activity also interferes with feeding and locomotion speed and, in addition, causes pupal lethality. As an explanation for the phenotypes, Nep4 mediated hydrolysis of different short neuropeptide F (sNPF) species, which were identified as novel substrates of the peptidase, is proposed. sNPF is known to regulate insulin signaling and knockdown of sNPF phenocopies the Nep4 overexpression phenotypes, which suggests that Nep4 mediated hydrolysis of sNPF regulates insulin expression in the fly. Based on these results additional regulatory peptides were identified as novel Nep4 substrates. Among them are peptides that do not only regulate insulin signaling, but also feeding behavior (Hallier et al., 2016). These findings represent good evidence that muscle bound Nep4 is key to regulate homeostasis of distinct hemolymph circulating peptide hormones. Nep4 localizing to the surface of the central nervous system is likely necessary to ensure effective ligand clearance and thus proper regulation of corresponding peptide receptors.

The present study focuses on the cardiac function of Drosophila melanogaster. Drosophila heart parameters are evolutionarily conserved, making Drosophila a useful human heart disease model. This model enables the in vivo investigation of physiological and genetic methods. This thesis is subdivided into four parts: parts 1-3 comprise the introductions of three publications, and part 4 presents unpublished data. The first publication is about the heart physiology of Drosophila. It explains how intracardiac valve cells work and proves their participation in blood flow directionality. A databased model shows the orientation of myofibrils within the valve cell. The myofibrils allow the valve cells to oscillate between a roundish and elongated cell shape. A toll-GFP enhancer line was shown to mediate strong reporter gene activity in the intracardiac valve of third instar larvae, pupae and adults. Transmission electron microscopy (TEM) analyses and immunohistochemical studies showed the differentiation of larval valve cells for the first time. The second publication focuses on the cardiac extracellular matrix (ECM), which contains two unique proteins - Lonely heart (Loh) and Pericardin (Prc). The study demonstrated that Loh is crucial for Prc recruitment to the developing matrix. Loh is anchored to the ECM by its thrombospondin type 1 repeat (TSR1-1) with its embedded putative glycosaminoglycan (GAG)-binding side. The N-terminus of Loh is proposed to face the plasma membrane. Prc is presumably recruited by two Loh TSR1 domains (TSR1-2 and TSR1-4). Nearly all Drosophila tissues, except salivary glands, create Prc networks through ectopic Loh expression. The study also found that the amount of Prc and Loh in the cardiac ECM influences heart function. The third publication investigated a set of neuropeptides and their ability to modulate cardiac function in third instar larvae. The results showed that 11 of the 19 tested peptides significantly affected the heart function in semi-intact larvae. Furthermore, the peptides’ in vivo relevance was tested through the knockdown of chronotropic peptide precursors. The study found that a RNAi mediated knockdown of all respective peptide precursors affected the heart rate. By combining semi-intact heart preparations and in vivo analyses, we identified several heartbeat-modulatory peptides in Drosophila. The unpublished data introduces a new software program called HIRO. It is written in Java, platform-independent and can easily detect the heart rhythm. Only mild anaesthesia and basic equipment are needed to record the Drosophila heartbeat. HIRO was used to show the influence of the RNAi-mediated downregulation of critical ECM proteins in Drosophila third instar larvae. The screen revealed Myospheroid and Laminin A as promising candidates that can significantly affect the heart parameters. HIRO is optimised for future applications and can be used as a high-throughput screening software with a simple setup. Taken together, this thesis provides new insights into the physiology and function of the Drosophila heart. The developed software HIRO comes with a user-friendly interface and a step-by-step introduction to easily conduct heart parameter measurements. HIRO will help to expand our knowledge of the fundamental processes in the model organism Drosophila melanogaster.

Die Kardiogenese kann speziesübergreifend in eine distinkte Abfolge von dynamischen Entwicklungsphasen unterteilt werden. In frühen Stadien der Vertebraten-Herzentwicklung wie auch bei Drosophila melanogaster beginnt die Organogenese des Herzens mit der Selektion und Spezifizierung der Herzvorläuferzellen aus bilateral angelegtem, mesodermalem Gewebe. Anschließend resultiert die Differenzierung der determinierten Herzvorläuferzellen in bilateralen Reihen spezifischer Herzzellgruppen. Die Herzzellen migrieren in dorsale Richtung aufeinander zu und assemblieren zu einem Herzrohr. Diese dynamischen Prozesse unterliegen einem komplexen Netzwerk an hoch konservierten Regulationsmechanismen. In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Metalloprotease Kuzbanian/ADAM10 eine Rolle während der Kardiogenese von Drosophila spielt, in dem sie die Selektion der Herzzellvorläufer aus dem kardialen Mesoderm steuert. Durch die unterbleibende Prozessierung des Notch-Rezeptors in kuzbanian Mutanten wird eine Überzahl an Herzvorläuferzellen determiniert. Weiterhin ist die Notch-abhängige asymmetrische Zellteilung in kuzbanian Mutanten fehlreguliert. Die perikardialen Herzzelllinien verschieben sich zu Gunsten der kardialen Herzzellen und resultieren in einer Hyperplasie der Kardiomyozyten. Eine weitere Phase der Kardiogenese in Drosophila ist die korrekte Ausbildung des Herzrohres und die damit einhergehenden Herzlumenbildung. Durch das Herzlumen kann die Hämolymphe durch das Herzrohr in den Körper des Tieres gepumpt werden. Die Bildung des Lumens bedingt eine stereotype Zellformänderung der Kardiomyozyten. Diese Modulierung der Zellform resultiert in halbmondförmigen Kardiomyozyten, die dorsal und ventral miteinander in Kontakt treten und so einen zentralen, luminalen Bereich umschließen – das Herzlumen. Das Rezeptor/Liganden-Paar Uncoordinated 5 (Unc5) und NetrinB ist für die korrekte Ausbildung der luminalen Kardiomyozytenseite notwendig. Es konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen von Unc5 oder NetrinB die Kardiomyozyten in einer runden Zellform verbleiben lässt. Die Kardiomyozyten lagern sich entlang ihrer gesamten Kontaktfläche aneinander ohne dass ein Lumen entsteht. Lebendbeobachtungen an unc5 Mutanten zeigten, dass das Fehlen des Herzlumens zu einem kompletten Verlust des Hämolymphstroms führt.

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Im Menschen regulieren extrazelluläre Metalloproteasen eine Vielzahl von physiologischen Prozessen, wobei deren exakte Funktionen bei der Ausbildung humaner Krankheiten wie beispielsweise Krebs, der Alzheimerschen Krankheit oder Störungen des Herz-Kreislaufsystems vielfach noch unbekannt sind. Insbesondere die Proteinfamilie der Neprilysine wird seit einigen Jahren vermehrt in Bezug auf eine mögliche Anwendung als Therapeutikum gegen die genannten Erkrankungen hin diskutiert. In dieser Arbeit wurde erstmals die M13-Metalloprotease Neprilysin 4 (Nep4) aus dem Modellorganismus Drosophila melanogaster charakterisiert. Zusätzlich wurde zu Beginn dieser Arbeit das ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease)-Protein Meltrin analysiert. Innerhalb der Neprilysin-Familie kommt Nep4 eine Sonderrolle zu, da es im Gegensatz zu den meisten Neprilysinen nicht ausschließlich als membrangebundenes Protein, sondern isoformspezifisch auch in löslicher Form exprimiert wird. In diesem Zusammenhang deuten RT-PCRs, in situ Hybridisierungen und Antikörperfärbungen auf ein breites Funktionsspektrum beider Isoformen hin, das in den zahlreichen Geweben, in denen Nep4 exprimiert wird, hauptsächlich der Etablierung und Aufrechterhaltung der Homöostase verschiedener bioaktiver Peptide dienen dürfte. Über den gesamten Lebenszyklus der Fruchtfliege kann Nep4 in Gliazellen des ZNS und in den männlichen Geschlechtszellen nachgewiesen werden, während es im Verlauf der Embryogenese zusätzlich in Herz- und Muskelzellen exprimiert wird. Die regulatorischen Elemente zur Steuerung der neuronalen (ZNS) und mesodermalen (Herz und Muskel) Nep4 Expression konnten in dieser Arbeit identifiziert und für die Erzeugung transgener Fliegenlinien genutzt werden. Mittels semi-quantitativer PCR und durch Untersuchungen von Fliegen, die GFP unter der Kontrolle des mesodermalen Enhancers exprimieren, wurde die endogene Expression von Nep4 im Muskel von Larven des dritten Stadiums nachgewiesen. Da alle nachfolgenden Stadien Reporteraktivität im Herzen und Muskel zeigen, wird die Peptidase vermutlich durchgängig in diesen Geweben benötigt. Die katalytische Aktivität von Nep4 konnte anhand der Peptide Substanz P und Angiotensin I demonstriert werden. Dabei ist die Enzymaktivität, wie für die Neutralen Endopeptidasen (Nep) typisch, von einem neutralen pH-Wert abhängig und wird durch bekannte Inhibitoren der humanen Neprilysine, Nep und Nep2 reduziert. Bei einer künstlich erhöhten Expression von Nep4 in der Muskulatur der Fruchtfliege ist, entgegen der Erwartung, nicht die katalytische Aktivität, sondern ausschließlich die nicht katalytische, intrazelluläre Domäne ursächlich für eine nekrotische Gewebedegeneration. Um eine mögliche Funktion der intrazellulären Domäne des Nep4 Proteins im Muskel genauer zu erforschen, wurden Proteininteraktionsstudien durchgeführt, erste Interaktionspartner identifiziert und deren Interaktion auf Proteinebene nachgewiesen.

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