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Das Endoplasmatische Reticulum (ER) bildet ein ausgedehntes Netzwerk aus Membran-tubuli und abgeflachten Zisternen in der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines Extraktes der Eier von Xenopus laevis ein in vitro System zur Bildung der polygonalen Membrannetzwerke des ER entwickelt. In diesem System wurde zum ersten Mal eine Mikrotubuliunabhängige Bildung der Membrannetzwerke des ER demonstriert und damit die Existenz Mikrotubuli-unabhängiger Mechanismen für ihre Bildung. Die Membrantubuli entstehen durch die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander. Diese Fusion allein, die unabhängig von Cytosol ist, ist jedoch nicht ausreichend, da durch die Fusion in Abwesenheit von Cytosol lediglich große, kugelförmige Membranvesikel entstehen. Vielmehr ist eine unbekannte cytosolische Aktivität notwendig, damit die Fusion zur Bildung von Membrantubuli und Netzwerken führt. Mit dem in vitro System wurde die Voraussetzung für die Identifizierung dieser Mikrotubuli-unabhängigen, cytosolischen Aktivität geschaffen. Das Verhalten des ER in vitro ähnelt dem des ER in Zellen. Werden Zellen mit Calcium-Ionophoren behandelt, so deassembliert das ER, während in vitro die Bildung des ER durch hohe Konzentrationen von Ca2+ verhindert wird. In der Mitose deassembliert das ER in Abhängigkeit vom Zelltyp zu einem unterschiedlichen Ausmaß. Analog wird das ER in vitro zu einem unterschiedlichem Ausmaß gebildet, abhängig von der Art, in der die zugegebenen mitotischen Cytosole hergestellt wurden. Die Kernhülle hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Zisternen des ER und des Golgi-Apparates. In dieser Arbeit wurde die Bildung des Zellkerns in einem zellfreien System etabliert, das den für die ER-Bildung eingesetzten Extrakt verwendet. Einzelne Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden in einem vereinfachten Kernbildungssystem untersucht. Dabei wurde ein neuer Schritt in diesem Prozeß entdeckt: Das Abflachen von Chromatin-gebundenen Membranvesikeln auf der Oberfläche des Chromatins. Die hierfür verantwortliche Aktivität befindet sich in der cytosolischen Fraktion. Ohne Cytosol binden die Kernmembranvesikel an das Chromatin und fusionieren miteinander, die resultierenden großen Membranvesikel bleiben jedoch kugelförmig, flachen nicht ab und können keine Kernhülle bilden. Die Identifizierung der cytosolischen Faktoren, die an dem Abflachen der Membranen bei der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrantubuli des ER beteiligt sind, sollte Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismen geben und zeigen, ob verwandte Mechanismen an der Bildung ähnlicher Membranstrukturen in der eukaryontischen Zelle beteiligt sind.

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Der Transfer von Chromosom 17 in die menschliche Mammakarzinomzellinie CAL 51 hatte zu einer Reversion des malignen Phänotyps geführt. Aufbauend auf diese Versuche wurde die Genexpression von CAL 51 Zellen versus CAL 17/5 Revertantenzellen mit der "differential display" Methode ana lysiert. Mit dem "differential display" Verfahren konnten 177 differentielle RT-PCR Produkte identifiziert, ausgeschnitten, eluiert und reamplifiziert werden. Ein Vergleich der Sequenzen mit den internationalen Datenbanken ergab: 46% der untersuchten PCR Produkte wiesen keine Homologie zu bekannten Genen auf, 16% zeigten eine hohe Homologie zu EST Sequenzen und cDNA Klonen (unbekannter Gene), 19% eine hohe Homologie zu mitochondrialer DNA und 19% wiesen eine hohe Homologie zu bekannten Genen auf. Die Northern Analyse von 40 ausgewählten Reamplifikaten bestätigte die differentielle Expression in etwa 1/3 der Fälle. Die homologen Gene sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert. Für einige konnte aufgrund ihrer bekannten biologischen Funktionen eine Assoziation mit der Reversion von CAL 51 Zellen vermutet werden. Dazu gehörten u.a. Apolipoprotein J, Sp17 und Profilin. Das Profilingen zeigte eine deutlich erhöhte mRNA- und Proteinexpression in den Revertantenzellen und ist auf Chromosom 17 in der transfizierten Region p13.3 lokalisiert. Profilin ist ein ubiquitäres Protein, das Bindungsstellen für G-Aktin, PIP2 und poly L-Proline besitzt. Die Transfektion von CAL 51 Zellen mit klonierter Profilin cDNA führte bei drei ausgewählten Transfektanten zu einer Suppression des neoplastischen Phänotyps. Die Profilin cDNA Transfektanten zeigten gegenüber den parentalen CAL 51 Zellen und einer Vektortransfektante (ohne Profilin cDNA Insert) ein verlangsamtes Wachstum, eine geringere Koloniebildung in Weichagar, eine differenzierte Strukturbil dung in Matrigel und eine reduzierte Tumorigenität in "nude" Mäusen. Die beobachteten Veränderungen korrelierten zumeist mit der Profilinexpression in den Transfektanten. Eine SSCP- und Sequenzanalyse des Profilingens in CAL 51 Zellen ergab drei Sequenzunterschiede gegenüber der "wildtyp" DNA: Ein homozygoter Basenaustausch in der Promoterregion (A-773G), ein homozygoter Basenaustausch in Exon 3 (C334T) (ohne Aminosäureaustausch) sowie eine heterozygote Deletion in der untranslatierten 3' Region (645delT). Die Bedeutung dieser Sequenzunterschiede ist noch unklar. Mit ersten Northern Analysen von Tumor- und Normalgeweben sowie mehreren Brustkrebszellinien wurde begonnen. Die kleine Anzahl der untersuchten Proben erlaubt noch keine Interpretation der Ergebnisse.