Der Transfer von Chromosom 17 in die menschliche Mammakarzinomzellinie CAL 51 hatte zu einer Reversion des malignen Phänotyps geführt. Aufbauend auf diese Versuche wurde die Genexpression von CAL 51 Zellen versus CAL 17/5 Revertantenzellen mit der "differential display" Methode ana lysiert. Mit dem "differential display" Verfahren konnten 177 differentielle RT-PCR Produkte identifiziert, ausgeschnitten, eluiert und reamplifiziert werden. Ein Vergleich der Sequenzen mit den internationalen Datenbanken ergab: 46% der untersuchten PCR Produkte wiesen keine Homologie zu bekannten Genen auf, 16% zeigten eine hohe Homologie zu EST Sequenzen und cDNA Klonen (unbekannter Gene), 19% eine hohe Homologie zu mitochondrialer DNA und 19% wiesen eine hohe Homologie zu bekannten Genen auf. Die Northern Analyse von 40 ausgewählten Reamplifikaten bestätigte die differentielle Expression in etwa 1/3 der Fälle. Die homologen Gene sind auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert. Für einige konnte aufgrund ihrer bekannten biologischen Funktionen eine Assoziation mit der Reversion von CAL 51 Zellen vermutet werden. Dazu gehörten u.a. Apolipoprotein J, Sp17 und Profilin. Das Profilingen zeigte eine deutlich erhöhte mRNA- und Proteinexpression in den Revertantenzellen und ist auf Chromosom 17 in der transfizierten Region p13.3 lokalisiert. Profilin ist ein ubiquitäres Protein, das Bindungsstellen für G-Aktin, PIP2 und poly L-Proline besitzt. Die Transfektion von CAL 51 Zellen mit klonierter Profilin cDNA führte bei drei ausgewählten Transfektanten zu einer Suppression des neoplastischen Phänotyps. Die Profilin cDNA Transfektanten zeigten gegenüber den parentalen CAL 51 Zellen und einer Vektortransfektante (ohne Profilin cDNA Insert) ein verlangsamtes Wachstum, eine geringere Koloniebildung in Weichagar, eine differenzierte Strukturbil dung in Matrigel und eine reduzierte Tumorigenität in "nude" Mäusen. Die beobachteten Veränderungen korrelierten zumeist mit der Profilinexpression in den Transfektanten. Eine SSCP- und Sequenzanalyse des Profilingens in CAL 51 Zellen ergab drei Sequenzunterschiede gegenüber der "wildtyp" DNA: Ein homozygoter Basenaustausch in der Promoterregion (A-773G), ein homozygoter Basenaustausch in Exon 3 (C334T) (ohne Aminosäureaustausch) sowie eine heterozygote Deletion in der untranslatierten 3' Region (645delT). Die Bedeutung dieser Sequenzunterschiede ist noch unklar. Mit ersten Northern Analysen von Tumor- und Normalgeweben sowie mehreren Brustkrebszellinien wurde begonnen. Die kleine Anzahl der untersuchten Proben erlaubt noch keine Interpretation der Ergebnisse.

Etwa 25 % der Nierenzellkarzinome (RCC) weisen bei Diagnosestellung bereits Metastasen auf. Aufgrund der schlechten Prognose des metastasierten RCC besteht ein dringender Bedarf an neuen Therapieformen sowie an prognostischen und diagnostischen Markern. microRNAs (miRNAs) bieten sich dabei als vielversprechende molekulare Biomarker an. Für den klarzelligen RCC-Subtypen (ccRCC) wurde bereits ein umfangreiches miRNA Expressionsprofil erstellt, mit dem ccRCC-relevante, vorwiegend herunterregulierte miRNAs identifiziert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Expression der miR-141 und miR-145 in RCC-Zelllinien durch epigenetische Mechanismen gehemmt ist und die Promotorbereiche dieser miRNAs stark methyliert vorliegen. In RCC-Zellen konnte eine tumorsuppressive Wirkung dieser miRNAs durch Hemmung der Migration (beide) und Invasion (miR-141) nachgewiesen werden. Durch die gleichzeitige Überexpression der beiden miRNAs kam es zu einer kooperativen Wirkung und so zu einer verstärkten Hemmung der Zellmigration. Weitere Untersuchungen konnten eine Reihe neuer onkogener Targets der miR 141 und miR 145 identifizieren. Dabei zeigte sich ein kooperativer Effekt durch Kombination beider miRNAs auf die Expression der Targets HS6ST2 und LOX. Die Targets LOX und MAP4K4 waren in ccRCC Gewebe auf mRNA-Ebene stark überexprimiert im Vergleich zum umliegenden Normalgewebe. Bei der anschließenden Tissue-Mikroarray-Analyse der Expression auf Proteinebene zeigte sich zudem ein prognostisches Potenzial der Targets LOX und MAP4K4 für das Gesamtüberleben von ccRCC Patienten. Diese Daten verdeutlichen den enormen Einfluss von epigenetisch dysregulierten miRNAs und deren spezifischen Targets auf tumorassoziierte Prozesse. Zudem bietet das Netzwerk aus Epigenetik, miRNAs und deren jeweiligen Targets nicht nur eine Reihe von diagnostischen und prognostischen Möglichkeiten, sondern liefert auch viele Ansatzpunkte für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien. / Approximately 25 % of diagnosed renal cell carcinoma (RCC) have already metastasized. Due to poor prognosis of metastatic RCC, there is an urgent need for new therapies and prognostic and diagnostic markers to identify high-risk patients. Here microRNAs (miRNAs) might be promising new molecular biomarkers. For the clear cell RCC subtype (ccRCC) a comprehensive miRNA expression profile was already established. In this profiling several ccRCC-associated, predominantly down-regulated miRNAs were identified. In the present study, epigenetic mechanisms were identified to play a significant role in the down regulation of miR-141 and miR-145 in RCC cell lines. In addition, a strong methylation of the corresponding promoter regions was detected at molecular level. In RCC cells a tumor suppressive effect of these miRNAs was shown by decreasing migration (both) and invasion (miR-141) and furthermore, co overexpression of both miRNAs resulted in a cooperative effect with increased inhibition of cell migration. Several new oncogenic targets of miR-141 and miR-145 were identified by further investigations. Here the two miRNAs again showed a cooperative effect, as demonstrated by a significantly increased inhibition of HS6ST2 and LOX expression. In ccRCC tissue the expression of LOX and MAP4K4 was strongly enhanced on mRNA level compared to normal tissue. In the subsequent tissue microarray analysis of protein expression, LOX and MAP4K4 showed a prognostic impact for the overall survival of patients with ccRCC. These results illustrate a huge impact of epigenetically dysregulated miRNAs and of their specific targets on tumor-associated processes. Furthermore, the network of epigenetics, miRNAs and their respective targets will offer a number of diagnostic and prognostic capabilities, but will also provide many opportunities for the development of new therapeutic strategies.

Gegenstand der Untersuchung: Vorliegende Arbeit stellt eine molekularbiologische Studie dar, die der Frage nachging, ob der Genotyp für die NAT2 eine Rolle bei der Pathogenese des Mammakarzinoms spielt. Das Mammakarzinom hat eine erbliche Komponente. Neben hoch-penetranten genetischen Mutationen des BRCA1- und BRCA2-Gens stehen polymorphe Enzyme des Fremdstoffwechsels im Verdacht, Präkanzerogene zu aktivieren und somit das Karzinomrisiko zu erhöhen. Die NAT2 detoxifiziert aromatische Amine, wie sie z. B. im Zigarettenrauch enthalten sind und weist eine ausgesprochene bimodale Aktivitätsverteilung auf. Nach systematischer Aufklärung des genetischen Polymorphismus der NAT2 ist eine Vorhersage des Phänotyps mit hoher Sicherheit möglich. Design: Es wurde eine prospektive Fall-Kontroll-Studie an 248 Patientinnen mit Mammakarzinom und 248 Kontrollen (Patientinnen mit anderen, nicht malignen Erkrankungen und Gesunde) durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Blutprobe entnommen, aus der DNA isoliert wurde. Damit wurden folgende Mutationen des NAT2-Gens bestimmt: G191A, C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A. Anhand dieser Mutationen erfolgte die Zuordnung zu Haplotypen. Da bekannt ist, welche mittlere Aktivität der NAT2 bei den einzelnen Genotypen zu erwarten ist, konnte mit dieser Information eine Vorhersage der Aktivität als "schnelle" und "langsame" Acetylierer vorgenommen werden. Methode: Die Genotypisierung erfolgte durch Amplifikation des NAT2 -Gens mit verschiedenen Primern in der PCR, anschließendem Verdau mit Restriktionsenzymen und Charakterisierung der Fragmente mittels Gelelektrophorese. Statistik: Mit der Berechnung von "Odds ratios" und multivariaten logistischen Regressionsanalysen zur Berücksichtigung möglicher Einflussfaktoren wurde der Zusammenhang zwischen NAT2-Genotyp bzw. daraus vorhergesagtem Phänotyp und Mammakarzinom überprüft. Ergebnisse: Es wurden acht verschiedene NAT2-Haplotypen nachgewiesen. 2 Haplotypen (*4 und *12A) kodieren für einen schnellen Acetylierer-Typ, 6 Haplotypen (5A, 5B, 5C, 6A, 7B und 14*B) für den langsamen Acetylierer-Typ. 55,6% der MC-Patientinnen und 58% der Kontrollpersonen Genotypen wiesen den langsamen Acetyliererstatus auf. Dies entspricht in etwa der von anderen Untersuchern beschriebenen Häufigkeit bei Kaukasiern. Es fand sich keine Überrepräsentierung bestimmter Genotypen oder Haplotypen in der Gesamtgruppe der Patientinnen mit Mammakarzinom im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Odds ratio betrug 1,12 (CI: 0,03 - 1,60). In einer Subgruppenanalyse fanden sich keine signifikante Unterschiede in bezug auf das mittlere Alter, das Ausmaß des Zigarettenkonsums und auch von Blutgruppenmerkmalen. Innerhalb des Patientenkollektivs wurde die Verteilung von schnellen und langsamen Acetylierern stratifiziert nach Menopausenstatus, Menstruationsdauer, TNM-Klassifikation und Grading. Bei den Patientinnen mit invasiv-lobulärer Tumorhistologie waren die schnellen Acetylierer in der Auswertung signifikant häufiger als bei invasiv-duktalem Mammakarzinom. Ein weiterer signifikanter Unterschied wird bezüglich des Hormonrezeptorstatus berichtet: Schnelle Acetylierer waren bei Patientinnen mit positivem Hormonrezeptorstatus deutlich häufiger als bei solchen mit negativem Rezeptorstatus. Bezüglich der Tumorhistologie fiel auf, dass die 33 Patientinnen mit einem invasiv-lobulären Mammakarzinom signifikant häufiger schnelle Acetylierer waren. Langsame Acetylierer wiesen dagegen häufiger einen negativen Östrogenrezeptorstatus auf. Schlussfolgerung: Dem Polymorphismus des NAT2-Genotyps als unabhängigem Risikofaktor bei der Entstehung des Mammakarzinoms kommt keine mit den bekannten Risikofaktoren vergleichbare Bedeutung zu. Die Befunde in bezug auf die Tumorhistologie und auf den Hormonrezeptorstatus weisen möglicherweise auf Besonderheiten im Pathomechanismus bei der Entstehung des Mammakarzinoms hin, der derzeit unklar ist. Sie bedürfen weiterer Abklärung. / Genetically polymorphic xenobiotic metabolizing enzymes such as the polymorphic arylamine N-acetyltransferase (NAT2) are supposed to be a host factor for cancer susceptibility. A case-control study of a total of 248 patients with breast cancer and a matched reference group of 248 unrelated subjects without cancer was performed to explore the association between NAT2 genetic polymorphism and individual susceptibility to breast cancer. A structured questionnaire was used to collect relevant information regarding all known or suspected risk factors of breast cancer. Methods: The NAT2 genotype was determined using the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The NAT2-genotype was characterized at nucleotide positions 191, 282, 341, 481, 590, 803, and 857. For evaluation of nucleotide 341, a 3’-mismatch primer was used. Homozygous wild type genotypes NAT2*4/*4 were confirmed by DNA sequencing. Results: Genotypes for rapid acetylation amounted to 44.4% among breast cancer and 41.5% among reference patients. There was no over-representation of specific NAT2-genotypes in the total of breast cancer patients compared with the reference group (odds ratio 1.12, 95%; confidence limits 0.03-1.60). Neither NAT2-status nor smoking status was independently associated with breast cancer risk. Logistic regression analysis, considering confounders such as age, body mass index (BMI), and smoking status (PJ) showed that the NAT2 rapid acetylator genotype was not associated with an increased cancer risk (odds ratio 1.05; 95%-CI: 0.67-1.67; P=0.82). Discrimination into homozygous and heterozygous carriers of allele NAT2*4 did not show any over-representation of NAT2*4/*4 genotypes among breast cancer patients (odds ratio 1.31; 95% confidence limits 0.59-2.91; p=0.50). Hence carriers of the NAT2*4/*4 genotypes, with its especially high acetylation capacity are not at significantly increased risk to breast cancer. Further stratification to different risk factors revealed a non-significant elevation in risk of breast cancer among patients with increasing cigarette smoking who represented the NAT2 rapid acetylator genotype, but lack of association to age, blood groups, menopause, period of menstruation, TNM-classification, tumor grading, and histology. However, evaluation of the role of estrogen receptor status and NAT2 showed that there was a significant association between positive receptor status and NAT2 rapid acetylator genotype (odds ratio 2.07; 95%-CI: 1.32-5.27; P=0.005). Interestingly, in patients with infiltrating lobular breast cancer (n = 33), NAT2 rapid acetylator genotypes were more frequent compared with other tumor subtypes (odds ratio 2.59; 95%-CI: 1.20-5.60; P=0.014). Logistic regression analysis, considering estrogen receptor status, and age showed that the rapid acetylator genotypes were associated with an increased cancer risk (odds ratio 2.4; 95%-CI: 1.04-5.61; P=0.04). Our findings suggest that NAT2-polymorphism is not an independent susceptibility factor for breast cancer. In particular the NAT2 slow acetylator genotype was not associated with an increased breast cancer risk. Striking results point out to a likely association between NAT2 rapid acetylator genotype and tumor histology especially infiltrating lobular breast cancer and positive hormone receptor status These findings refer to special features of pathogenesis in breast cancer requiring more and detailed clarification.

Die essentielle Histon H3 Variante Cse4 ersetzt am Centromer das Standard Histon H3 und bildet zusammen mit Histon H4 funktionelle Cse4-H4 Tetramere aus. In dieser Studie konnte gezeigt werden, das Cse4 über seinen einzigartigen N-Terminus mit zwei Komponenten des Histon-Acetyltransferase-Komplexes SAS-I interagiert: der enzymatischen Untereinheit Sas2 und Sas4. Mutationen innerhalb des atypischen C2HC Zink-Fingers oder der HAT-Aktivierungsdomäne von Sas2 verhindern eine Bindung an Cse4, obwohl mit Hilfe von Co-Immunopräzipitationsexperimenten eine indirekte Interaktion nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass Cse4 mit Cac1, der größten Untereinheit des Chromatin-Assemblierungsfaktors CAF-I und Asf1 interagiert - zwei Histon Chaperonen, die Histon H3 und H4 in Chromatin assemblieren. Unsere Ergebnisse lassen weiterhin auf eine separate Rolle von Cac1, unabhängig von den beiden anderen Untereinheiten schließen. Die Interaktion von Cse4 und Ctf19 wird durch eine Deletion von Sas2 verhindert. Ebenfalls kann die Temperatur-Sensitivität eines cse4-103 mutierten Hefestamms durch eine Sas2-Deletion partiell supprimiert. Somit kann man darauf schließen, dass Sas2 eine Funktion bei der Stabilisierung des Centromers aufweist. Die bisherigen Ergebnisse lassen die Frage aufkommen, ob Cse4 in der Zelle acetyliert ist und ob es möglicherweise als Histon H3 Variante ebenfalls ein Substrat von SAS-I darstellt. Wir konnten zeigen, dass Cse4 tatsächlich in einem acetylierten Status vorliegt, ob SAS-I jedoch für die Acetylierung verantwortlich ist bleibt nachzuweisen. / The essential histone H3 variant Cse4 plays a crucial role at the centromere in S. cerevisiae, where it replaces histone H3 in that it assembles centromere specific (Cse4-H4)2 tetrameres. We found in our study that the histone H3 variant was able to interact over its unique N-Terminus with two subunits of the histone acetyltransferase complex SAS-I: Sas2 and Sas4. Mutations within the acetyl-CoA binding site (HAT domain) or the zink-finger of Sas2 disrupted the binding to Cse4, although an indirect interaction was found with co-immunoprecipitation experiments. Additionally, the N-terminus of Cse4 interacted with Cac1, the largest subunit of the chromatin assembly factor CAF-I and Asf1 - two histone chaperones that assemble histones H3 and H4 into nucleosomes. Our findings further suggest a role of Cac1 independent of Cac2 and Cac3 as no binding to Cse4 could be detected. A role for Sas2 at the centromere was further confirmed in that a sas2 deletion (sas2 delta) disrupted the binding of Cse4 to Ctf19. Additionally, sas2 delta partially rescued the temperature sensitivity of a cse4-103 mutated strain at elevated temperatures, suggesting a role for Sas2 in improving centromere stability. An important question resulted from our studies: is Sas2 able to acetylate the histone H3 variant Cse4 ? We have circumstantial evidence that Cse4 was indeed acetylated in the cell, but whether Sas2 accounts for the acetylation remains to be determined.

Bei Säugerkeimzellen, Zygoten und Embryos in frühen Stadien kommt der epigenetischen Neuprogammierung eine außergewöhnlich wichtige Rolle in der Regulation der Genomfunktionen in entscheidenden Entwicklungsstadien zu. Die epigenetische Neuprogrammierung in Keimzellen löscht zuerst die Imprinting-Markierungen und Epi-Mutationen und stellt dann geschlechtsspezifische Markierungen (genomische Prägung) wieder her. Die vorliegende Arbeit bezieht sich auf das Löschen epigenetischer Modifikationen in primordialen Mauskeimzellen (primordial germ cells (PGCs)) zwischen dem 10.5 bis 13.5 Tag nach der Befruchtung. Entgegen früheren Annahmen zeigen unsere Ergebnisse, daß primordiale Mauskeimzellen (PGCs) beim Eintritt in die embryonalen Keimdrüsen noch immer DNS Methylierungsmarker besitzen, die ähnlich dem Marker in somatischen Zellen sind. Kurz nach dem Eintritt in die Keimdrüsen werden die DNS Methylierungsmarker, die in Verbindung mit geprägten und nicht geprägten Genen stehen, gelöscht. Für die Mehrzahl der Gene beginnt die Löschung der Marker in männlichen und weiblichen Embryos gleichzeitig und ist innerhalb eines Entwicklungstages abgeschlossen. Diese Kinetik deutet auf einen aktiven Demethylierungsprozess hin, initiiert durch ein somatisches Signal, ausgehend von der embryonalen Keimdrüse. Der Zeitpunkt der Neuprogrammierung in den primordialen Keimzellen ist entscheidend, da er sicherstellt, daß Keimzellen beiden Geschlechts einen epigenetisch äquivalenten Status erhalten, bevor sie geschlechtsspezifisch ausdifferenzieren und anschließend neu elterlich geprägt werden. Vollständiges Verständnis des Prozesses der Neuprogrammierung der Keimzellen ist nicht nur im Hinblick auf genomisches Imprinting wichtig, sondern auch für die Erforschung von Mechanismen für die Wiederherstellung von omnipotenten Zellen bei Klonierung und Stammzellenerhaltung. / Epigenetic reprogramming in mammalian germ cells, zygote and early embryos, plays a crucial role in regulating genome functions at critical stages of development. Germ line epigenetic reprogramming assures erasure of all the imprinting marks and epi-mutations and establishment of new sex-specific gametic imprints. The presented work focuses on the erasure of epigenetic modifications that occur in mouse primordial germ cells (PGCs) between day 10.5 to 13.5 post coitum (dpc). Contrary to previous assumptions, our results show that as they enter the genital ridge the PGCs still possess DNA methylation marks comparable to those found in somatic cells. Shortly after the entry of PGCs into the gonadal anlagen the DNA methylation marks associated with imprinted and non-imprinted genes are erased. For most genes the erasure commences simultaneously in PGCs of both male and female embryos and is completed within only one day of development. The kinetics of this process indicates that is an active demethylation process initiated by a somatic signal emanating from the stroma of the genital ridge. The timing of reprogramming in PGCs is crucial since it ensures that germ cells of both sexes acquire an equivalent epigenetic state prior to the differentiation of the definitive male and female germ cells in which, new parental imprints are established subsequently. Complete understanding of the germline reprogramming processes is important not only in the light of genomic imprinting but also for resolving other mechanisms connected with restoring cellular totipotency, such as cloning and stem cell derivation.

DNA Methylierung ist ein zentraler epigenetischer Prozess, welcher entscheidend an der Organisation von Genregulation beteiligt ist. Dieser Vorgang ist wichtig für die Funktion sowohl von embryonalen als auch von Gewebs-Stammzellen. Krebszellen weisen häufig veränderte DNA Methylierungsmuster auf, was auf eine ähnlich wesentliche Rolle der DNA Methylierung in Krebsstammzellen (KSZ) hindeutet. Diese These wurde hier mit Hilfe eines Mausmodells mit verringerter Expression der DNA Methyltransferase Dnmt1 anhand verschiedener Leukämiemodelle untersucht. In einem bi-linearen B-lymphatischen/myeloischen Leukämiemodell konnte gezeigt werden, dass hypomethylierte leukämieinitiierende (Stamm-)zellen (LSZ) myeloische Krebszellen hervorbringen, allerdings nicht zur Bildung von B-lymphatischen Leukämiezellen befähigt sind. Darüber hinaus konnte in einem T-Zell-spezifischen Leukämiemodell gezeigt werden, dass reduzierte Dnmt1 Expression nicht mit der Bildung von T-Zelllymphomen vereinbar ist. Detaillierte Analysen eines myeloischen Leukämiemodells ergaben, dass hypomethylierte LSZs ein vermindertes Selbsterneuerungspotenzial aufweisen. Im Gegensatz zu den starken Funktionseinschränkungen hypomethylierter LSZs, hatten hypomethylierte Knochenmarks-Stromazellen keinen Effekt auf die Entwicklung von Leukämien. Außerdem führte die Behandlung leukämischer Zellen mit demethylierenden Agenzien zu einer teilweisen Aufhebung methylierungsvermittelter Genrepression. Die dadurch verstärkte Expression von Differenzierungsfaktoren verminderte das Leukämiewachstum, was einen möglichen Erklärungsansatz für das eingeschränkte Potenzial hypomethylierter Leukämien darstellt. Diese Ergebnisse demonstrieren eine zentrale Rolle der DNA Methylierung für die Selbsterneuerung und Linienwahl von LSZs, und erlauben somit neue Einblicke in die epigenetische Regulation von KSZs. Diese Erkenntnisse implizieren, dass KSZs möglicherweise ein geeignetes Ziel für epigenetische Therapieansätze darstellen. / DNA methylation is one of the major epigenetic processes which is crucially involved in orchestrating gene regulation primarily by repression of gene expression. DNA methylation plays an important role in controlling functional programs of embryonic and tissue stem cells. As altered DNA methylation patterns are a hallmark of cancer, we hypothesized that DNA methylation might be equally important for cell fate determinations of cancer stem/initiating cells (CSC). To test this, I analyzed a genetic knockdown mouse model of the main somatic DNA methyltransferase Dnmt1 in the context of three different leukemia models. In a bilinear B-lymphoid/myeloid leukemia model hypomethylated bi-potential leukemia stem/initiating cells (LSCs) were shown to be capable of forming a myeloid leukemia, whereas the generation of B-lymphoid blasts was almost entirely abrogated. Moreover, failure of hypomethylated cells to develop T-cell lymphomas in a Notch1-based leukemia model demonstrated their profound lack of T-lineage commitment capacities. Furthermore, detailed analyses of a myeloid leukemia model revealed a severely impaired self-renewal potential in LSCs with reduced Dnmt1 expression. However, contrasting the drastic cell-intrinsic impairments of LSC function by reduced DNA methylation, leukemia development was found to be unaffected by hypomethylated bone marrow stroma. Mechanistically, treatment of cell lines with a demethylating drug led to enhanced expression of differentiation factors due to loss of methylation mediated gene silencing. This was followed by inhibition of leukemia cell growth, thus providing a potential mechanism for impaired functions of hypomethylated leukemias. Collectively, this thesis revealed a critical role for DNA methylation levels in malignant self-renewal and lineage fate choices. These new insights into epigenetic regulation of CSCs suggest that epigenetic therapy displays a potential treatment concept specifically targeting CSCs.

Die zirkadiane Uhr ist ein endogenes Zeitmesssystem, das die Anpassung physiologischer Prozesse an die geophysikalische Zeit ermöglicht. Die zirkadiane Uhr besteht aus einem zentralen Schrittmacher und peripheren Uhren in jeder Zelle. Bei Säugern ist eine bestimmte Anzahl von Uhr-Genen in regulatorischen Schleifen miteinander verbunden, wodurch Oszillationen in der Expression der Uhr-Gene sowie in zahlreichen Zielgenen erzeugt werden. Zielgene der zirkadianen Uhr sind unter anderem an zellulären Prozessen beteiligt, die eine Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielen. Funktionsstörungen der zirkadianen Uhr stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern, unter anderem Krebs. Ziel dieses Projekts war es, die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Tumorentstehung und entwicklung zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf tumorspezifischen Stoffwechselwegen. Die Rolle einer deregulierten zirkadianen Uhr wurde in einem in vitro Zellmodel untersucht. Die SW480 Zelllinie wurde aus einem Primärtumor isoliert und die SW620 Zelllinie aus einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten. Die untersuchten Zelllinien zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf ihre Uhr Phänotypen mit globalen Konsequenzen auf oszillierende Gene und Stoffwechselwege. Die Runterregulation des Uhrgens Bmal1 führte in SW480 Zellen zu einem metastatischen Phänotyp, der stark dem von SW620 Wildtypzellen ähnelte. Darüber hinaus führte die Runterregulation von Bmal1 zu einer Veränderung des metabolischen Phänotyps und zu einer modifizierten Antwort auf die Behandlung mit einem Glykolyseinhibitor. Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse unterstützen die postulierte Rolle von Bmal1 als Tumorsuppressor und verdeutlichen das reziproke Wechselspiel zwischen der zirkadianen Uhr und dem Stoffwechsel von Krebszellen und zeigen mögliche Auswirkungen einer deregulierten Uhr auf den Zellmetabolismus während der Tumorentwicklung. / The circadian clock is an internal timing system that allows the entrainment of physiological and behavioural processes to the geophysical time with a periodicity of about 24 hours. It consists of a central pacemaker and peripheral clocks in every cell. In mammals, a distinct set of genes is interconnected in regulatory feedback loops, thereby generating oscillations in gene expression in the core-clock itself as well as in many target genes. Clock target genes are, among others, involved in cellular processes connected to tumour development and progression, including metabolic pathways, drug response pathways and the cell cycle. Malfunctions of the circadian clock are associated with different pathologies including cancer. The aim of this project was to study the role of the circadian clock in tumour development and progression with a focus on cancer metabolism and treatment response. The role of a deregulated clock was investigated in SW480 cells derived from a primary tumour and SW620 cells derived from a lymph node metastasis of the same patient. The investigated cell lines showed clear differences with respect to their clock phenotypes with consequences on global oscillating gene expression and alterations in metabolic pathways. A knockdown of the core-clock gene Bmal1 in SW480 cells induced a metastatic phenotype similar to SW620 wild type cells, as indicated by faster proliferation, lower apoptosis rate and a highly energetic metabolic phenotype. Furthermore, Bmal1-KD induced metabolic phenotype rewiring as seen by altered glycolytic activity and mitochondrial respiration and modified treatment response to metabolism-targeting anticancer treatment. The results obtained in this project reinforce the postulated role of Bmal1 as a tumour suppressor and elucidate a reciprocal interplay between the circadian clock and cancer metabolism with implications in metabolic phenotype rewiring during tumour progression.

Durch Analyse der Subtraktion-cDNA Bibliothek einer humanen Lungentumor Zelllinie haben wir ein neues Mitglied der S100 Genfamilie identifiziert und charakterisiert, welches S100A14 benannt wurde. Die vollständige cDNA hat eine Länge von 1067 bp und kodiert für ein Protein von 104 Aminosäuren, welches die S100-spezifische Kalzium-bindende Domäne enthält. Das Gen wird in normalen humanen Epithelien ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch Expressionsverluste in vielen Tumorzelllinien. Im Gegensatz zu Tumorzelllinien ist S100A14 auf mRNA- und Proteinebene in vielen humanen Primärtumoren stärker exprimiert, unter anderem in Lungen- und Brustkarzinomen. Um den Mechanismus der erhöhten S100A14 Expression in Lungen- und Brustkarzinomen zu verstehen, haben wir die Effekte des EGF (epidermal growth factor) und des TGF-alpha (transforming growth factor-alpha) untersucht. Beide Faktoren sind Liganden des ERBB Rezeptors und induzieren in der immortalisierten bronchialen Epithelzelllinie S100A14 Expression. Unter Verwendung spezifischer Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die EGF-vermittelte transkriptionelle Induktion der ERK1/2 Signalweg (extracellular signal-regulated kinase) verantwortlich ist und eine de novo Proteinsynthese erfordert. Diese Ergebnisse unterstützend konnte immunhistologisch eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von ERBB2 und S100A14 in primären Brustkarzinomen nachgewiesen werden. Phorbolester-12-Myristat-13-Acetat (PMA) verstärkte gleichfalls die S100A14 mRNA Expression in 9442 Zellen, was eine Regulation durch die Protein Kinase C (PKC) vermuten lässt. Die PMA-induzierte Expression von S100A14 wird ebenso wie die TGF-alpha/EGF-Induktion durch die Aktivierung des ERK1/2 Signalweges vermittelt. In Anbetracht der großen Bedeutung der ERK1/2 und PKC Signalwege in der Tumorentstehung und Tumorprogression ist zu vermuten, dass S100A14 über die aberrante Regulation dieser Signalwege an die maligne Transformation gekoppelt ist. / By analysing a human lung tumour cell line subtraction cDNA library, we have identified and characterized a novel member of the human S100 gene family that we designated S100A14. The full-length cDNA is 1067 bp and encodes a putative protein of 104 amino acids. The predicted protein contains the S100-specific EF-hand calcium-binding domain. The gene is ubiquitously expressed in normal human tissues of epithelial origin. S100A14 transcript was found to be down-regulated in many immortalized and tumour cell lines from diverse tissues. In contrast to the tumour cell lines, S100A14 shows up-regulation at the mRNA and protein level in many human primary tumours, including lung and breast carcinomas. To elucidate mechanisms whereby S100A14 expression is enhanced in lung and breast tumours, we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) on its expression. Both are ligands of ERBB receptor and induced S100A14 expression in the immortalized bronchial epithelial cells. By use of specific inhibitors, we found that EGF-mediated transcriptional induction of S100A14 involves extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signalling and requires de novo protein synthesis. In support of these findings, we demonstrated by immunohistochemistry a significant correlation between ERBB2 and S100A14 protein overexpression in primary breast carcinomas. Our studies showed that the phorbol ester 12-myristate 13-acetate (PMA) increases S100A14 mRNA expression in immortalized bronchial epithelial cells suggesting regulation by protein kinase C (PKC). Similar to TGF-alpha/EGF induction, the PMA-induced S100A14 expression was also mediated by activation of the ERK1/2 signalling cascade. Considering the importance of the ERK1/2 and PKC signalling pathways in tumour development and progression we suggest that it is the aberrant regulation of these signalling cascades that couples S100A14 to malignant transformation.

Deregulierung des RAS/MAPK Signalwegs führen nicht nur zur Krebsentstehung, sondern sind auch mitverantwortlich für Entwicklungsstörungen, dieals Keimbahnmutationen in Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs zurückzuführen sind, werden aufgrund überlappender Phänotypen unter dem Begriff RASopathien subsumiert. Obwohl die Inzidenz für solide Tumore bei diesen Patienten gering ist, wird ein Zusammenhang zum Auftreten verschiedener Leukämieformen deutlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mutationen zweier Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs, PTPN11 und BRAF, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur neoplastischen Transformation analysiert. Zur Durchführung funktioneller Assays wurden Zelllinien mit lentiviraler Vektoren mit NS-, LS- oder NS und Leukämie-assoziierten SHP2 oder CFC-assoz. BRAF Mutationen (Mut), generiert. Die Testung des neoplastischen Potentials erfolgte anhand nicht-tumorigenen humanen sowie an 208F Ratten-Zelllinie. SHP2/BRAF-Mutationen haben eine spindel-ähnliche Zellmorphologie, Proliferation sowie das Dichte- und Anker-unabhängiges Wachstum in 208F gefördert. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass RASopathie-assoziierte Mutationen zu einem Transformationsphänotyp führen können, ähnlich wie die klassischen Ras Onkogenen. Um zu testen, ob Mut-SHP2 das in vivo Tumorwachstum beeinflusst, wurden SHP2-208F-Zellen in Nacktmäuse injiziert. Eine Förderung des Tumorwachstums konnte sowohl durch mut- als auch durch wt-SHP2 beobachtet werden. RASopathie-assoziierte mutierte Proteine führten auch zu einer moderaten Aktivierung des MAPK-Signalwegs. Eine erhöhte Bindungsstärke zu GAB1 konnte mittels ein TAP-Assay ermittelt werden. Auf transkriptioneller Ebene konnte einer Gensignatur, die sowohl durch RASopathien als auch der klassischen onkogenen BRAF identifiziert werden.Die Ergebnisse dieser Studie können für ein besseres Verständnis der Downstream-liegenden Mechanismen von RASopathie-bezogenen Signalwegen und ihrer Beteiligung an der Tumorprogression beitragen / Deregulation of the Ras/MAPK signaling is implicated in a variety of human diseases, including cancer and developmental disorders. The RASopathies are characterized by an overlapping phenotype in patients and result from germline mutations in key regulators of the MAPK signaling cascade. Although the incidence of solid tumors is rather low, reports on different leukemia forms have increased. In this work, a group of mutations in the genes PTPN11 and BRAF were selected for expression in cell lines for a comprehensive molecular and phenotypic characterization. Non-tumorigenic human cell lines and the rat 208F fibroblasts were transduced with lentiviral particles with SHP2/BRAF wildtype (wt), Noonan (NS)-, NS- and leukemia- or LS–associated SHP2 mutations (mut) and CFC-associated BRAF mutations to identify their potential roles in neoplastic transformation. Mutations in both genes promoted cell morphology alterations, cell proliferation, density- and anchorage-independent growth in rat fibroblasts. These results suggested that RASopathies-associated mutations in both genes confer a transformation phenotype in vitro similar to the classical oncogenes. To investigate whether mutations in SHP2 contribute to tumor growth in vivo, 208F cells expressing wt/mut SHP2 were injected in nude mice. Both wt/mut SHP2 expressing cells promoted tumor growth. Additionally, RASopathies-associated mutant SHP2 and BRAF proteins constitutively activate the MAPK signaling in a moderate manner compared to oncogenic BRAF. To identify modifications in the protein interaction of mut-SHP2, TAP assays were performed. Mut-SHP2 proteins showed an increased binding strength to GAB1 compared to wt. Finally, a microarray analysis revealed a gene cluster commonly regulated in both RASopathies and the oncogenic BRAF. The findings of this work might be useful for a better understanding of the downstream mechanisms of RASopathies-related signaling and their involvement in cancer progression.

Brust- und Ovarialkarzinome gehören zu den häufigsten sporadischen Tumorerkrankungen bei der Frau. Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Karzinomen werden von spezifischen Veränderungen der Genexpression begleitet. Durch die bioinformatische Auswertung von vier Millionen ESTs aus cDNA-Bibliotheken von Normalgeweben und der korrespondierenden Tumore wurden Hunderte von differenziell exprimierten Genen selektiert. Nach der chromosomalen Kartierung der Kandidatengene erfolgten weitere Untersuchungen für Gene aus den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23, die häufig in Brust- und Ovarialkarzinomen als aberrant beschrieben wurden. Die Validierung der in-silico Expressionsdaten erfolgte über Northernblot- und cDNA-Array-Analysen von unselektierten und mikrodissezierten Tumorproben. Es konnte für einige der Gene die differenzielle Expression in Brusttumoren bestätigt und dadurch neue Kandidatengene für die untersuchten Genloci identifiziert werden. Das Expressionsmuster einer Acyltransferase in 11q13 als potenzielles Tumorsuppressorgen erbrachte den Hinweis auf eine mögliche Involvierung in den Retinol-Metabolismus und könnte auf einen Mechanismus der Inhibierung der Karzinogenese im Brustepithel hindeuten. / Breast and ovarian cancers have become major tumor diseases among woman. The progression of benign neoplasia to malignant carcinoma is characterized by specific changes of gene expression. By using an in-silico strategy to analyze four million ESTs available in cDNA libraries of normal and the corresponding tumor tissues, we selected hundreds of differentially expressed genes. After chromosomal assignment of the candidate genes, further experiments were focussed on these genes located in the specific regions 1q32-q41 and 11q13-q23 often described to be aberrant in breast and ovarian cancer specimen. The in-silico expression analysis was verifyed by Northern blot and cDNA-Array techniques of unselected and microdissected tumor samples. We could confirm the in-silico expression pattern of some genes and identified novel tumor associated candidate genes for the investigated loci. According to the expression pattern, an acyltransferases located in 11q13 may represent a tumor suppressor gene, which could possibly inhibit breast carcinogenesis by involving in retinol metabolism.