Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) hat bis heute einen hohen medizinischen Bedarf an effektiveren Therapien. Inhibitoren der Bromodomain and extra-terminal domain (BET) Familie wie JQ1 wirken in verschiedenen Krebsarten, einschließlich Lungenkrebs. Während ihre Aktivität auf die Expression von Onkogenen wie c-Myc in vielen Studien untersucht wurde, bleibt der Effekt von BET-Inhibition auf den Apoptose Signalweg weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Aktivität von BET-Inhibitoren auf den Zellzyklus und auf Komponenten der Apoptose-Antwort der Zelle untersucht. Genomweite Transkriptionsanalysen haben zusammen mit Chromatin Immunpräzipitation und anschließender Sequenzierung geholfen das MYC Gen und dessen assoziierte Super-enhancer als primäres Ziel des BET-Inhibitors JQ1 zu identifizieren. Mittels einer Gruppe von NSCLC Modellen belegt diese Arbeit, dass Zelllinien die auf die BET-Inhibitoren reagieren in Apoptose gehen und eine Reduktion der S-Phasen Population zusammen mit gleichzeitiger de-regulation der c-Myc Expression aufwiesen. Andererseits konnte die ektopische Überexpression von c-Myc der anti-proliferativen Wirkung entgegenwirken. Die Auswirkung von BET-Inhibition auf die Expression von 370 Genen, die in der Apoptose Regulation involviert sind, wurde in sensitiven und resistenten Zellen verglichen und dabei wurde die starke BET-Abhängigkeit der Expression von zwei Schlüsselgenen der Apoptose FLIP und XIAP festgestellt. Die Kombination von JQ1 mit dem tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) oder dem Chemotherapeutikums Cisplatin die verstärke die Induktion von Apoptose in sowohl BET-Inhibitor sensitiven als auch in resistenten Zellen. Des Weiteren zeigte die Kombination einen verbesserten Antitumor-Effekte in A549 tumortragenden Mäusen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Identifizierung von BET-abhängigen Genen unterstützend für die Wahl von therapeutischen Kombinationspartnern in der Krebsbehandlung sein kann. / Non-small cell lung cancer (NSCLC) has a high medical need for more effective therapies. Small molecule inhibitors of the bromodomain and extra terminal domain (BET) family such as JQ1 are active in different cancer types, including lung cancer. While their activity on oncogene expression such as c-Myc has been addressed by many studies, the effects of BET inhibition on the apoptotic pathway remain largely unknown. This work evaluates the activity of BET bromodomain inhibitors on cell cycle distribution and on components of the apoptotic response. Genome-wide transcriptional analyses together with chromatin immunoprecipitation followed by sequencing helped to identify the MYC gene and associated super-enhancers as a primary target of JQ1. Using a panel KRAS-mutated NSCLC models, it was found that cell lines responsive to BET inhibitors underwent apoptosis and reduced their S-phase population, concomitant with down-regulation of c-Myc expression. Conversely, ectopic c-Myc overexpression rescued the anti-proliferative effect of JQ1. The effects of BET inhibition on the expression of 370 genes involved in apoptosis were compared in sensitive and resistant cells and the expression of the two key apoptosis regulators FLIP and XIAP was found to be highly BET-dependent. Consistent with this, combination treatment of JQ1 with the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) or the pro-apoptotic chemotherapeutic agent cisplatin enhanced induction of apoptosis in both BET inhibitor sensitive and resistant cells. Furthermore the combination of JQ1 with cisplatin led to significantly improved anti-tumor efficacy in A549 tumor-bearing mice. Altogether these results show that the identification of BET-dependent genes provides guidance for the choice of drug combinations in cancer treatment.

Durch Analyse der Subtraktion-cDNA Bibliothek einer humanen Lungentumor Zelllinie haben wir ein neues Mitglied der S100 Genfamilie identifiziert und charakterisiert, welches S100A14 benannt wurde. Die vollständige cDNA hat eine Länge von 1067 bp und kodiert für ein Protein von 104 Aminosäuren, welches die S100-spezifische Kalzium-bindende Domäne enthält. Das Gen wird in normalen humanen Epithelien ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch Expressionsverluste in vielen Tumorzelllinien. Im Gegensatz zu Tumorzelllinien ist S100A14 auf mRNA- und Proteinebene in vielen humanen Primärtumoren stärker exprimiert, unter anderem in Lungen- und Brustkarzinomen. Um den Mechanismus der erhöhten S100A14 Expression in Lungen- und Brustkarzinomen zu verstehen, haben wir die Effekte des EGF (epidermal growth factor) und des TGF-alpha (transforming growth factor-alpha) untersucht. Beide Faktoren sind Liganden des ERBB Rezeptors und induzieren in der immortalisierten bronchialen Epithelzelllinie S100A14 Expression. Unter Verwendung spezifischer Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass für die EGF-vermittelte transkriptionelle Induktion der ERK1/2 Signalweg (extracellular signal-regulated kinase) verantwortlich ist und eine de novo Proteinsynthese erfordert. Diese Ergebnisse unterstützend konnte immunhistologisch eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von ERBB2 und S100A14 in primären Brustkarzinomen nachgewiesen werden. Phorbolester-12-Myristat-13-Acetat (PMA) verstärkte gleichfalls die S100A14 mRNA Expression in 9442 Zellen, was eine Regulation durch die Protein Kinase C (PKC) vermuten lässt. Die PMA-induzierte Expression von S100A14 wird ebenso wie die TGF-alpha/EGF-Induktion durch die Aktivierung des ERK1/2 Signalweges vermittelt. In Anbetracht der großen Bedeutung der ERK1/2 und PKC Signalwege in der Tumorentstehung und Tumorprogression ist zu vermuten, dass S100A14 über die aberrante Regulation dieser Signalwege an die maligne Transformation gekoppelt ist. / By analysing a human lung tumour cell line subtraction cDNA library, we have identified and characterized a novel member of the human S100 gene family that we designated S100A14. The full-length cDNA is 1067 bp and encodes a putative protein of 104 amino acids. The predicted protein contains the S100-specific EF-hand calcium-binding domain. The gene is ubiquitously expressed in normal human tissues of epithelial origin. S100A14 transcript was found to be down-regulated in many immortalized and tumour cell lines from diverse tissues. In contrast to the tumour cell lines, S100A14 shows up-regulation at the mRNA and protein level in many human primary tumours, including lung and breast carcinomas. To elucidate mechanisms whereby S100A14 expression is enhanced in lung and breast tumours, we studied the effects of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) on its expression. Both are ligands of ERBB receptor and induced S100A14 expression in the immortalized bronchial epithelial cells. By use of specific inhibitors, we found that EGF-mediated transcriptional induction of S100A14 involves extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) signalling and requires de novo protein synthesis. In support of these findings, we demonstrated by immunohistochemistry a significant correlation between ERBB2 and S100A14 protein overexpression in primary breast carcinomas. Our studies showed that the phorbol ester 12-myristate 13-acetate (PMA) increases S100A14 mRNA expression in immortalized bronchial epithelial cells suggesting regulation by protein kinase C (PKC). Similar to TGF-alpha/EGF induction, the PMA-induced S100A14 expression was also mediated by activation of the ERK1/2 signalling cascade. Considering the importance of the ERK1/2 and PKC signalling pathways in tumour development and progression we suggest that it is the aberrant regulation of these signalling cascades that couples S100A14 to malignant transformation.

Ein nicht-invasiver Atemtest zur Lungenkrebsdetektion setzt Kenntnis über lungenkrebsspezifische Substanzen voraus. Die Identifizierung von Lungenkrebsbiomarkern in der Atemluft war das Ziel dieser Arbeit. Leichtflüchtige organische Substanzen (VOC) wurden als Zielkomponenten ausgewählt. Für die VOC-Analytik wurde eine SPME-GC-MS-Methode entwickelt und sowohl auf Modellsysteme als auch auf Realproben angewendet. Drei Lungenadenokarzinomzelllinien wurden in-vitro untersucht. Die VOC-Analyse wurde mit drei verschiedenen Probenahmestrategien durchgeführt und es war ein deutlicher Hintergrundeinfluss der eingesetzten Einwegzellkulturflaschen auf das analysierte VOC-Profil feststellbar. Trotzdem konnten signifikante Unterschiede zwischen Tumorzellen und zellfreien Nährmedien beobachtet werden: 1-Propanol wurde von den Zellen produziert, während der Gehalt einiger Aldehyde sank. Die eingeschränkte Ähnlichkeit des gewählten Zellkulturmodells mit realen Atemluftproben bedingt eine geringe Eignung dieser Ergebnisse für die Biomarkerableitung. Ein Gasmodell auf Basis angefeuchteter, synthetischer Luft wurde als Grundlage für die qualitätsgesicherte, quantitative VOC-Analyse der realen Atemluftproben konzipiert. Diese Modellluft wurde mit 24 Zielsubstanzen (Alkane, Aromaten, sauerstoffhaltige Spezies) sowie 3 Matrix-VOC mit starker Dominanz in den Atemluftproben (Isopren, Aceton, 2-Propanol) angereichert. In Kooperation mit zwei Berliner Kliniken wurden 37 Atemluftproben von Lungenkrebspatienten und 23 Proben von Gesunden gesammelt. Die Anwendung von 1-Butanol als univariater Marker erlaubt eine Erkennung von Lungenkrebs mit einer Sensitivität von 92% und Spezifität von 78%. Durch lineare Diskriminanzanalyse konnte ein Set aus 4 VOC (1-Butanol, 2-Butanon, 2-Pentanon, n-Hexanal) ermittelt werden, welches ebenfalls eine Sensitivität von 92% und mit 87% eine höhere Spezifität aufwies. Gegebenenfalls handelt es sich bei diesen Substanzen jedoch nur um allgemeine Krankheitsmarker. / A non-invasive breath test for lung cancer detection would be favorable but knowledge on lung cancer specific substances is required. This work aims at the identification of potential lung cancer biomarkers in breath. Volatile organic compounds (VOC) were chosen as targets and a SPME-GC-MS method was developed to analyze the VOC profiles of model systems and real samples. Three lung adenocarcinoma cell lines were investigated in-vitro. The VOC analysis, carried out with 3 different sampling strategies, was influenced by the VOC background of the used disposable culture vessels. Changes in the VOC profiles of cell lines compared to cell-free culture media were obvious: 1-propanol was released by the tumor cells whereas the content of some aldehydes was diminished. The similarity of this model system with real breath samples of lung cancer patients was seen to be insignificant. Consequently, these cell cultures were not suitable for biomarker identification. A gaseous model consisting of humidified synthetic air was developed. It was fortified with 24 target VOC (alkanes, aromatics and oxygenated species) as well as 3 matrix compounds (isoprene, acetone and 2-propanol) dominating patients’ VOC profiles in breath. This model was used for the quality assured quantitative VOC analysis in real breath samples. In cooperation with two hospitals 37 single mixed expiratory breath samples from lung cancer patients and 23 from healthy controls were collected. Applying 1-butanol as an univariate biomarker patients and controls were discriminated with a sensitivity of 92% and a specificity of 78%. Linear discriminant analysis displayed a set of 4 VOC (1-butanol, 2-butanone, 2-pentanone, n-hexanal) with similar sensitivity but higher specificity of 87%. However, these potential biomarkers might rather be a consequence of illness in general.